Análisis semicuantitativo de peptidoglicano por cromatografía líquida, espectrometría de masas y bioinformática

El peptidoglicano (PG) es una característica definitoria de las bacterias que sirve para mantener la morfología celular, al tiempo que proporciona soporte estructural para proteínas y otros componentes celulares ^1,2. La columna vertebral de PG está compuesta por ácido murámico N-acetil ligado a β-1,4 (MurNAc) y N-acetilglucosamina (GlcNAc)^1,2. Cada MurNAc posee un péptido corto unido al residuo ᴅ-lactilo que puede ser reticulado a péptidos adyacentes ligados a disacáridos (Figura 1A, B). Esta reticulación produce una estructura similar a una malla que abarca toda la célula y a menudo se denomina sáculo (Figura 1C). Durante la síntesis de PG, los precursores se generan en el citoplasma y se transportan a través de la membrana citoplasmática por flippasas. Los precursores son incorporados posteriormente al PG maduro por las enzimas transglicosilasa y transpeptidasa, que producen los enlaces glucosídico y peptídico, respectivamente³. Sin embargo, una vez ensambladas, hay numerosas enzimas producidas por las bacterias que modifican y / o degradan el PG para llevar a cabo una serie de procesos celulares, incluyendo el crecimiento y la división. Además, se ha demostrado que varias modificaciones de la PG confieren adaptaciones específicas a la cepa, las condiciones de crecimiento y el estrés ambiental, que han sido implicadas en la señalización celular, la resistencia a los antimicrobianos y la evasión inmune del huésped⁴. Como ejemplos, una modificación común es la adición de un grupo acetilo C6 en el MurNAc que confiere resistencia al limitar el acceso a los enlaces glicano β-1,4 a las enzimas lisozima producidas por el huésped que degradan PG ^4,5,6. En Enterococos, la sustitución del ᴅ-Ala terminal de la cadena lateral peptídica por ᴅ-Lac confiere una mayor resistencia al antimicrobiano vancomicina ^7,8.

El procedimiento general para el aislamiento y purificación de PG se ha mantenido relativamente sin cambios desde que se describió en la década de 1960⁹. Las membranas bacterianas se disuelven a través del tratamiento térmico con SDS, seguido de la eliminación enzimática de proteínas unidas, glicolípidos y ADN restante. El sáculo intacto purificado puede ser posteriormente digerido en los componentes individuales por hidrólisis del enlace β-1,4 entre GlcNAc y MurNAc. Esta digestión produce disacáridos GlcNAc-MurNAc con cualquier modificación estructural y/o enlaces cruzados intactos y se denominan muropéptidos (Figura 1B).

El análisis composicional de PG se realizó inicialmente a través de separación cromatográfica líquida de alta presión (HPLC) para purificar cada muropéptido, seguido de la identificación manual de los muropéptidos^10,11. Desde entonces, esto ha sido reemplazado por la espectrometría de masas en tándem de cromatografía líquida (LC-MS), que aumenta la sensibilidad de detección y disminuye la carga de trabajo manual de purificar cada muropéptido individual. Sin embargo, la naturaleza lenta y compleja de la identificación manual de muropéptidos ha seguido siendo un factor limitante, reduciendo el número de estudios realizados. En los últimos años, con la aparición de tecnologías "ómicas", la extracción automatizada de características LC-MS se ha convertido en una herramienta poderosa, que permite la detección e identificación rápidas de compuestos individuales en muestras complejas de conjuntos de datos muy grandes. Una vez que se identifican las características, el software bioinformático compara estadísticamente la variación entre muestras utilizando análisis diferencial aislando incluso las diferencias mínimas entre el conjunto de datos complejo y mostrándolas gráficamente al usuario. La aplicación del software de extracción de características para el análisis de la composición de PG apenas ha comenzado a ser explorada 12,13,14 y acoplada al análisis bioinformático ¹². A diferencia del análisis proteómico que se beneficia de las bases de datos de proteínas fácilmente disponibles que predicen la fragmentación de péptidos que permiten una identificación totalmente automatizada, actualmente no existe una biblioteca de fragmentación para peptidoglycomics. Sin embargo, la extracción de características se puede acoplar con bases de datos estructurales conocidas y predichas para predecir la identificación de muropéptidos¹². Aquí presentamos un protocolo detallado para el uso de la extracción de características basada en LC-MS combinada con una biblioteca de muropéptidos para la identificación automatizada y el análisis diferencial bioinformático de la composición de PG (Figura 2).

1. Preparación de la muestra de peptidoglicano

1. Crecimiento de cultivos bacterianos
   NOTA: El crecimiento de los cultivos bacterianos variará dependiendo de la especie bacteriana y las condiciones de crecimiento que se examinen. Los parámetros experimentales a probar definirán las condiciones de crecimiento.
   1. Cultivar cultivos bacterianos en condiciones de crecimiento requeridas para la cepa bacteriana y el diseño experimental. Cultivar bacterias como cultivos triplicados (réplicas biológicas), es decir, tres colonias separadas por cepa o condición de crecimiento.
      NOTA: Se sabe que las condiciones de crecimiento y la fase de crecimiento tienen efectos significativos en la composición de PG ^1,2,10. Se debe tener mucho cuidado para mantener la consistencia entre los cultivos y las réplicas para garantizar que los cambios de composición se deban a los parámetros experimentales y no a un error experimental.
   2. Enfriar rápidamente el cultivo a 4 °C, recoger por centrifugación (11.000 x g, 10 min, 4 °C) y congelar el pellet celular a -20 °C. Lavar el pellet de la celda con 4 °C preenfriado, fosfato de sodio 20 mM pH 6.5 antes de la congelación. La producción del pellet de células congeladas debe realizarse lo más rápida y coherentemente posible entre las muestras para limitar la actividad de las enzimas que podrían modificar y/o degradar el PG durante el proceso de recolección. Las muestras pueden procesarse directamente a través del proceso de extracción (sección 1.2) sin congelación; sin embargo, asegúrese de que todas las muestras se procesen de manera similar.
      NOTA: Para garantizar un producto suficiente para pasos posteriores, se utiliza un pellet de celda húmeda de tamaño significativo. Esto produce un pellet de sacculi lo suficientemente grande, que se visualiza y mantiene fácilmente durante los pasos de lavado repetitivos (sección 1.2.5 y 1.2.14) sin pérdida significativa de producto. Dependiendo de la bacteria y las condiciones de crecimiento, este rendimiento probablemente variará. Para la bacteria gramnegativa Pseudomonas aeruginosa, PAO1, 4 L de un cultivo de 0,5 OD₆₀₀ produjeron un pellet de células de 3-4 g y fueron suficientes para producir ~10 mg de sacculi purificado (sección 1.2.17)¹². Se trata de un gran exceso de sacculi que el requerido para la LC-MS (sección 2); Sin embargo, ayudará en la precisión de la medición (sección 1.2.17) y la normalización (sección 1.3).
2. Extracción de peptidoglicano sacculi
   NOTA: El protocolo para la extracción de PG está adaptado de ref.^9,11,15. Este protocolo extraerá el PG de células bacterianas individuales como un sáculo completo, libre de otros componentes celulares. El protocolo se puede utilizar con bacterias gramnegativas o grampositivas. Sin embargo, para las células Gram-positivas, pueden ser necesarios ajustes para aislar la estructura PG más gruesa y para eliminar los polímeros asociados a la pared celular; tales como, ácidos teicoicos.
   1. Resuspender los gránulos de células congeladas a aproximadamente 1:10 del volumen de cultivo original de 20 mM de fosfato de sodio pH 6.5. Realizar este paso a 4 °C (puede ser de 1 a 8 mg de peso de pellet de células húmedas por ml de tampón^11,12).
      NOTA: Para mantener el estado de acetilación del PG, se requiere un pH de 6,5 o inferior^15,16.
   2. Añadir la suspensión celular gota a ebullición 8% dodecil sulfato de sodio (SDS) 20 mM fosfato de sodio pH 6.5 para un volumen final 1:1 (es decir, la concentración final es 4% SDS), agitando suavemente en un matraz de fondo redondo equipado con un condensador refrigerado por agua. (Figura 2, paso 2)
   3. Mantener un hervor suave durante 30 min a 3 h con agitación para asegurar la disociación completa de la membrana. Asegúrese de que la mezcla resultante sea completamente clara sin grumos de células restantes o viscosidad. Se prefiere una ebullición más larga para garantizar la disociación completa.
   4. Deje que se enfríe a temperatura ambiente. La muestra se puede dejar a temperatura ambiente durante la noche.
      NOTA: Cuando la SDS está presente, mantenga las muestras a temperatura ambiente para mantener las SDS en la solución.
   5. Recoger sacculi como pellet mediante ultracentrifugación a 70.000 x g durante 40 min (o el tiempo necesario para sedimentar completamente sacculi) a 25 °C.
   6. Lavar repetidamente sacculi mediante ultracentrifugación sucesiva (sección 1.2.5) y suspensión en ~50 mL de fosfato sódico a temperatura ambiente 20 mM pH 6.5 hasta que el tampón de lavado tenga una concentración de SDS ~0.001%. Por lo general, de 5 a 7 lavados son suficientes.
      NOTA: Para probar la concentración del SDS restante en el tampón de lavado, use el tinte colorimétrico, Stains-all¹⁷.
   7. Resuspender sacculi en 5–10 mL de fosfato sódico a temperatura ambiente 20 mM pH 6.5.
   8. Sonicar la muestra brevemente (~40%, 50 W, 20 kHz, 20 s) a temperatura ambiente para dispersar los grupos.
      NOTA: La sonicación extendida causará mecánicamente el cizallamiento de la estructura PG¹⁸.
   9. Complementar la muestra con 50 μg/ml de amilasa, DNasa y RNasa, 10 mM de sulfato de magnesio y digerir a 37 °C durante 1 h con agitación o nutación.
      NOTA: La digestión de amilasa elimina cualquier glucógeno restante atrapado dentro del sacculi¹¹.
   10. Añadir 100 μg/ml de pronasa y digerir a 37 °C durante la noche con agitación o nutación y ~0,02% de azida sódica.
       NOTA: La digestión de Pronasa elimina las enzimas añadidas (de la sección 1.2.9) y elimina las lipoproteínas que están unidas covalentemente a la PG.
       PRECAUCIÓN: La azida de sodio es altamente tóxica y requiere métodos adecuados de uso/eliminación.
   11. Ultracentrífuga a 70.000 x g durante 40 min (o el tiempo necesario para sedimentar completamente el sacculi) a 25 °C para eliminar la azida sódica.
   12. Resuspender el pellet en 25 mL de 2% SDS 20 mM fosfato de sodio pH 6.5.
   13. Hervir durante 1 h en un vaporizador o en el matraz de fondo redondo con condensador refrigerado por agua (sección 1.2.2).
       NOTA: El segundo paso de ebullición de SDS elimina todas las proteínas y contaminantes restantes del sáculo.
   14. Repita el lavado de sacculi (sección 1.2.6) con ~50 ml de agua destilada doble a temperatura ambiente (ddH₂O) hasta que la concentración de SDS sea ~0.001%.
   15. Resuspender el pellet en una cantidad suficiente de_ddH2Opara suspender sacculi, así como lavar el recipiente (por ejemplo, 25 mL) y congelar durante la noche a -80 °C. El volumen puede variar ya que la muestra se liofilizará en el siguiente paso, aunque los volúmenes más pequeños requieren menos tiempo para liofilizar.
   16. Al día siguiente, liofilizar la suspensión y almacenar a temperatura ambiente.
   17. Medir la cantidad de sacculi liofilizado obtenida en una balanza analítica.
   18. Diluir sacculi en ddH₂O a 10 mg/ml y sonicar brevemente para romper los grupos antes de un análisis adicional.
3. Cuantificación de peptidoglicano purificado
   1. Cuantificar la cantidad de sacculi purificado de la sección 1.2.18 para garantizar que los datos de especificación de masa se igualan durante el análisis diferencial (sección 3.2). Siga la metodología detallada descrita en la Referencia¹⁵.
      NOTA: Los sáculos purificados (sección 1.2.18) se descomponen en componentes individuales de azúcar y aminoácidos por hidrólisis ácida. Los componentes individuales se separan y cuantifican mediante cromatografía de intercambio aniónico mediante detección amperométrica pulsada. Dada la estructura de PG (Figura 1), los muropéptidos individuales están compuestos por un solo MurNAc y un solo residuo de GlcNAc. Por lo tanto, cuantificar la concentración de cualquiera de los residuos representa la cantidad de muropéptidos 1:1 dentro de la muestra. Se prefiere MurNAc debido a la separación limpia de picos de otros componentes PG durante la cromatografía¹⁶.

2. Adquisición de datos por espectrometría de masas

1. Preparación de muropéptidos para espectrometría de masas
   1. Complementar 800 μg de sacculi purificado con 100 μg/ml de mutanolisina, acetato de amonio 100 mM pH 5,5 y 50 mM de cloruro de magnesio en una reacción de 100 μL.
   2. Digerir a 37 °C durante la noche.
   3. Agregue 1:1 volumen 0.5 M tampón de borato pH 9.0 y complemente con ~10 mg / ml de borohidruro de sodio (NaBH₄).
      NOTA: La mutarrotación de azúcares cíclicos entre α y β formas anoméricas causará múltiples formaciones de picos durante la separación por cromatografía líquida de los muropéptidos. El tratamiento con NaBH₄ elimina la interconversión entre las dos formas al reducir MurNAc en muramitol¹¹. El tratamiento no reduce los residuos de 1,6-anhydro MurNAc o azúcar ligado a 1,4.
      PRECAUCIÓN: La reacción de NaBH₄ produce pequeñas cantidades de gas hidrógeno. La reacción NaBH₄ creará burbujas y los tubos de microfuga deben mantenerse abiertos para permitir que el gas escape.
   4. Incubar la muestra a temperatura ambiente durante ~20–30 min.
   5. Centrifugar brevemente para depositar la muestra en el tubo de microfuga y eliminar las burbujas.
   6. Ajuste el pH a <4.0 usando ácido fosfórico 1:5, agregado en incrementos de 5 μL. Pruebe el pH con tiras reactivas de pH tornasol.
   7. Centrifugar a ~17.000 x g durante 1 min para sedimentar cualquier material insoluble restante.
   8. Filtrar con filtros microcentrífugos de 0,2 μm.
   9. Las muestras se centrifugan durante 10 minutos a 30.000 x g antes de la inyección en LC-MS para garantizar que las partículas no se inyecten en la EM.
2. Configuración de LC-MS
   1. Conecte una columna de partículas superficialmente porosas C18 (100 mm x 2,1 mm, tamaño de poro <3 μm) a un espectrómetro de masas tiempo vuelo cuadrupolo (qtof) con una precisión mínima detección m/z de cuatro decimales.
   2. Realizar la separación por cromatografía líquida de muropéptidos
      NOTA: Cada triplicado biológico (sección 1.1.1) debe ejecutarse tres veces a través de la LC-MS (sección 2.2.2 a 2.2.3) (triplicado técnico). Por lo tanto, cada condición probada tendrá un total de nueve archivos de datos LC-MS. La adquisición de datos se realizó utilizando software disponible comercialmente (ver Tabla de materiales). Sin embargo, el software de adquisición debe elegirse en función de la maquinaria MS. A continuación se muestra una guía para configurar el MS con parámetros específicos para ejecutar este protocolo. Para obtener una descripción detallada, consulte el manual del fabricante.
      1. Para la separación cromatográfica, prepare los siguientes disolventes con ácido fórmico (A) al 0,1% y acetonitrilo con ácido fórmico (B) al 0,1%.
      2. Configure un método para la separación cromatográfica utilizando los siguientes parámetros.
      3. Ajuste el caudal a 0,4 ml/min.
      4. Acondicione la columna durante 10 min al 2% B (~24 volúmenes de columna).
      5. Con un muestreador automático, inyectar 10 μL de muestra de la sección 2.1.9.
         NOTA: Ejecute una muestra inicial a través del protocolo LC-MS antes de comenzar la recopilación de datos. Esta ejecución no se utiliza para los datos, sino para aumentar la reproducibilidad del tiempo de retención para todas las ejecuciones posteriores. La reproducibilidad del tiempo de retención es necesaria durante el procesamiento espectral (sección 3.1) para la identificación y agrupación precisas de los picos de la relación masa-carga (m/z).
      6. Separar los muropéptidos usando 2% B durante 5 min (~12 volúmenes de columna), luego aumentarlo a 15% B durante 13 min (~30 volúmenes de columna), aumentarlo aún más a 50% B durante 10 min (~24 volúmenes de columna), y finalmente aumentarlo a 98% B durante 2 min (~5 volúmenes de columna).
         NOTA: Deseche (envíe a la basura) los primeros 2 minutos y los últimos 5 minutos del gradiente.
      7. Termine con un lavado de columna al 98% B durante 6 minutos (~ 14 volúmenes de columna) y 20 minutos (~ 47 volúmenes de columna) de reequilibrio.
   3. Realizar detección por espectrometría de masas de muropéptidos
      1. Calibre el eje de masa en modo positivo utilizando una mezcla de ajuste en acetonitrilo que contenga estándares de masa de referencia LC-MS siguiendo las instrucciones del fabricante de MS.
         NOTA: El MS se sintoniza antes del comienzo de las series cromatográficas (sección 2.2.2.1).
      2. Configure un método para la adquisición de datos de MS utilizando los siguientes parámetros.
         NOTA: Los datos de EM y EM/EM se recogen (secciones 2.2.3.2 a 2.2.3.6) simultáneamente con la separación cromatográfica de los muropéptidos (secciones 2.2.2.4 y 2.2.2.5). Tanto los parámetros cromatográficos como los de MS (secciones 2.2.2.2 y 2.2.3.2) son un método único que se agrega durante la configuración de una lista de trabajo para ejecutar varias muestras en secuencia.
      3. Ajuste la tensión capilar por electrospray a 4,0 kV y la temperatura del gas de secado a 350 ° C con un caudal de 13 L/min.
         NOTA: El nitrógeno (pureza >99%) debe utilizarse como gas de nebulización, secado y colisión durante toda la recopilación de datos de espectrometría de masas.
      4. Ajuste la presión del nebulizador a 40 psi y ajuste el fragmentador a 150 V.
      5. Ajuste los voltajes de RF de boquilla, skimmer y octapolo a 1000 V, 65 V y 750 V, respectivamente.
      6. Ajuste el rango de escaneo a 300–2.000 m/z en modo de iones positivos de 4 GHz (rango dinámico extendido).
      7. Establezca la recopilación de datos utilizando la adquisición MS/MS dependiente de datos con una velocidad de escaneo MS y MS/MS de 1 espectro/segundo. Seleccione cinco masas precursoras por ciclo, en el orden de carga individual, doble y triple.
      8. Ajuste las energías de colisión de fragmentación MS/MS a 15, 20 y 30 eV.

3. Análisis diferencial de la abundancia de muropéptidos

1. Procesamiento espectral del cromatograma LC-MS
   NOTA: La extracción de características recursivas se realizó utilizando software disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales). Se puede utilizar otro software de extracción de características. Sin embargo, otro software puede requerir un procesamiento manual de datos adicional para lograr la extracción recursiva altamente robusta. Varios programas utilizan la característica de terminología, entidad y compuesto casi indistintamente. Para el análisis PG, todos se refieren a la identificación del cromatograma iónico LC-MS representativo de un muropéptido individual (por ejemplo, Figura 3). Durante el procesamiento espectral (sección 3.1), una característica representa los múltiples picos m/z que abarcan las múltiples especies de iones posibles de un solo muropéptido que se agrupan bajo una sola etiqueta compuesta.
   1. En Archivo, inicie un nuevo proyecto.
   2. Agregue los archivos de datos LC-MS QTOF y asigne archivos de datos individuales a una condición / grupo experimental, por ejemplo, dos condiciones de crecimiento diferentes.
   3. Ejecute el asistente de procesamiento de datos Extracción de características recursivas por lotes (moléculas pequeñas/péptidos) y configure los filtros de procesamiento de datos para que coincidan con los parámetros de las condiciones e instrumentación LC-MS para identificar, agrupar y verificar con precisión los picos m/z que representan muropéptidos individuales. A partir del cromatograma, examine la deriva del tiempo de retención y la variación de m/z de picos similares conocidos para establecer los parámetros iniciales del filtro.
      NOTA: La extracción de características recursivas utiliza un algoritmo inicial de extracción de características moleculares no dirigidas para identificar y alinear las características del cromatograma (picos m/z ) en todos los archivos de datos. Una vez creadas, estas características se utilizan para reevaluar los archivos de datos originales (recursivos) con un algoritmo de extracción de características moleculares específico para mejorar la confiabilidad y precisión de las características identificadas. Es mejor establecer la extracción inicial no dirigida con una ventana de detección estrecha y utilizar parámetros de detección más amplios para la extracción recursiva para identificar picos en todos los archivos de datos que pueden faltar en la extracción inicial. La ejecución de la extracción de entidades recursivas puede tardar horas en completarse, dependiendo del número de muestras, la complejidad de los datos y el hardware del equipo presente
   4. Revise los resultados de la extracción de características. Si un número significativo de entidades no se alinean en un grupo, ajuste los parámetros de filtrado recursivo para ampliar/restringir la ventana de detección según sea necesario. Para lograr esto, inspeccione el cromatograma y el perfil isotópico de cada característica extraída para asegurarse de que la detección de características se realizó de manera similar en todos los archivos de datos. Además, para cada entidad identificada dentro de un archivo de datos, examine la puntuación, las advertencias y si la característica pasó los parámetros de filtro elegidos.
      NOTA: Se debe tener cuidado para mantener las ventanas de detección lo suficientemente estrechas como para que las características distintas no se agrupen por error. Esto a menudo se observa por perfiles isotópicos dispares entre archivos de datos, o variaciones significativas de m / z / tiempo de retención. Por el contrario, si hay varias características con tiempos de retención y m/z similares, es posible que los parámetros del filtro fueran demasiado estrictos, lo que resulta en que un pico de MS se divida en dos características. Por lo tanto, vuelva a ejecutar la extracción de características (sección 3.1.3) con parámetros de filtro de tiempo de retención ajustados para permitir una mejor agrupación de estas características. La visualización de los picos de abundancia más bajos indicará si los filtros utilizados (sección 3.1.3) identificaron con precisión los picos por encima del ruido de fondo. Si los picos de abundancia más bajos aparecen similares al fondo, vuelva a ejecutar la extracción de entidades con nuevos parámetros de filtro de fondo.
   5. Exporte los datos como un archivo de intercambio compuesto (.cef) (un formato compatible con el programa de software estadístico) o un archivo separado por columnas (.csv) que contiene la masa, el tiempo de retención y la abundancia de cada característica para cada muestra.
2. Análisis diferencial de características espectrales
   NOTA: El análisis diferencial se realizó utilizando software disponible comercialmente (ver Tabla de materiales). Se puede utilizar otro software bioinformático.
   1. Abra el programa y cuando se le indique, inicie un nuevo proyecto.
   2. Siga las instrucciones para la importación y el análisis de datos. Durante la importación de datos, cargue los archivos extraídos de la función (sección 3.1). Durante el análisis de datos, elija la significación y el cambio de pliegue para el análisis diferencial y seleccione los datos de referencia a la intensidad mediana en todos los archivos de datos. No establezca ningún filtro de datos (si esto se hizo en el paso de procesamiento de espectros anterior (sección 3.1)) ya que la aplicación de filtros de nuevo negaría la extracción robusta de características recursivas. Sin embargo, de manera similar a la extracción de características, el análisis diferencial debe alinearse en función de la masa (m/z) y el tiempo de retención debido a la deriva en la recopilación de datos LC-MS. Utilice los parámetros determinados en la extracción de características (sección 3.1).
      NOTA: Normalice entre ficheros de datos utilizando la cuantificación de muropéptidos (sección 1.3) para asegurarse de que las variaciones se deben a parámetros experimentales y no a variaciones en la purificación de sacculi (sección 1.2). Utilice la opción de escalador externo para ajustar cada archivo de datos para detectar diferencias en la concentración de MurNAc de la muestra.
   3. Una vez que se complete el análisis, examine los análisis gráficos y estadísticos resultantes para identificar muropéptidos que demuestren un cambio significativo en la abundancia entre las condiciones experimentales probadas.
   4. En el navegador del proyecto, haga clic con el botón derecho en los distintos análisis y elija una opción de exportación para guardar los detalles de la entidad como un archivo de datos separado por columnas (.csv) que contiene el m/z, el tiempo de retención, los valores de intensidad sin procesar y normalizados, el valor p, FDR y los cambios de pliegue para cada entidad. Se deben guardar múltiples análisis para obtener todos los datos relevantes.
   5. Exporte un archivo de segunda .csv que contenga solo los muropéptidos que han superado los análisis estadísticos, incluido el valor p <0.05 y el cambio de pliegue >2.
3. Anotación de la identidad del muropéptido a las características espectrales
   NOTA: A cada característica identificada se le debe asignar una estructura muropéptida predicha basada en el m/z y esta anotación debe confirmarse examinando la fragmentación MS/MS. Después de confirmar las anotaciones, puede ser necesario realizar y refinar el análisis diferencial (sección 3.2).
   1. Dentro del software de análisis diferencial, en interpretación de resultados, seleccione ID browser. Añadir una biblioteca de estructuras de muropéptidos esperados y seleccionar parámetros similares a los utilizados anteriormente (sección 3.1.3). Esto producirá una anotación de muropéptido predicha para cada característica identificada. Se puede producir una biblioteca de estructuras de muropéptidos utilizando el m/z para estructuras de muropéptidos predichas y el software de base de datos de EM (ver Tabla de materiales). Sin embargo, una biblioteca de los m/z de >6.000 posibles muropéptidos se puede encontrar en la Referencia¹².
   2. Seleccione la anotación de muropéptido predicha en función de la puntuación correspondiente y la relevancia biológica del muropéptido predicho, es decir, elija el muropéptido más probable que esté presente en la muestra biológica.
   3. Confirme manualmente la anotación del muropéptido predicha comparando los picos m/z del cromatograma MS/MS con el m/z predicho de todas las posibles fragmentaciones de una estructura muropéptida conocida (por ejemplo, Figura 4).
      1. Vea los datos de MS y MS/MS utilizando un programa de visualización de cromatogramas (consulte la Tabla de materiales, Figura 4).
      2. Dibuje la estructura del muropéptido predicha usando un editor molecular (programa de dibujo de estructura química) (ver Tabla de materiales, Figura 4, recuadro gris). Utilice la herramienta de fragmentación de masa para mostrar el m/z de los fragmentos de MS cuando cada enlace se rompe, ya sea individualmente o en combinación.
         NOTA: Dependiendo de la energía de fragmentación utilizada para MS/MS, la fragmentación puede ocurrir en cualquier enlace en la estructura del muropéptido. Sin embargo, algunos enlaces se fragmentan más fácilmente / con frecuencia a niveles de energía más bajos. Por ejemplo, la fragmentación en la cadena lateral del péptido ocurre con mayor frecuencia en el enlace amida entre aminoácidos. Al evaluar la fragmentación, es importante tener en cuenta que los residuos de GlcNAc se fragmentan muy fácilmente del muropéptido. Por lo tanto, la fragmentación de la estructura conocida del muropéptido debe evaluarse con y sin GlcNAc. Debido a la fragmentación en la fuente del GlcNAc, varias características extraídas en el procesamiento espectral (sección 3.1) pueden representar una sola estructura de muropéptido. Si se encuentran, estas características deben fusionarse y el análisis diferencial debe reevaluarse.
      3. Comparar todas las posibles fragmentaciones de la estructura del muropéptido que se determinó (sección 3.3.3.2) con el cromatograma MS/MS (sección 3.3.3.1). Para confirmar la anotación del muropéptido, los picos m/z de múltiples fragmentos deben encontrarse en el cromatograma MS/MS con una ventana de alineación m/z muy mínima (Figura 4).
      4. Para dilucidar la identidad del muropéptido en caso de fragmentación ambigua de MS/MS, repetir las secciones 2.2.2 a 2.2.3 con muestras (sección 2.1.9) para la adquisición adicional de datos de MS/MS que incorporen una lista de precursores preferidos de m/z y tiempo de retención con energías adicionales de colisión de fragmentación MS/MS.
   4. Para las entidades coeluentes que fueron anotadas como el mismo muropéptido, ejecute de nuevo el análisis diferencial (sección 3.2.2) y combine las características extraídas.
4. Evaluación de los cambios globales en las modificaciones del muropéptido
   1. Edite el archivo de .csv (sección 3.2.4) de los muropéptidos de cambio de pliegue alto estadísticamente significativos para incluir una sola columna para cada modificación del muropéptido. Rellene esta columna con una designación para cada muropéptido anotado (sección 3.3) (p. ej., GlcNAc o MurNAc acetilados versus GlcNAc o MurNAc desacetilados).
   2. Sube el archivo .csv modificado en Perseo^22,23. Importe los valores de intensidad normalizados en el cuadro de importación Principal e importe la designación de modificación en el cuadro Importación categórica.
   3. En Anotar filas, haga clic en Anotar filas categóricamente y agregue archivos de datos a cada parámetro experimental.
   4. En la prueba, haga clic en dos pruebas de muestra para realizar la prueba t de un estudiante (valor p < 0.05, FDR < 0.05, s0 = 1).
   5. Haga clic en 1D para realizar la anotación 1D^22,23. Una anotación 1D FDR < 0.05 indica un cambio significativo en la abundancia para la modificación del muropéptido entre los parámetros experimentales probados. Al establecer el valor de umbral (s0) = 1, se mostrarán las puntuaciones FDR de anotación 1D para todos los muropéptidos.
   6. Dentro de un software gráfico (ver Tabla de materiales), produzca un mapa de calor del cambio de pliegue de abundancia para cada modificación de muropéptido y muestre la puntuación de anotación 1D para demostrar la significación (Figura 5B). El cambio de pliegue de cada modificación de muropéptido se puede producir en Microsoft Excel utilizando las intensidades brutas de todos los muropéptidos individuales que contienen la modificación.

El aumento de la sensibilidad de detección de la maquinaria de EM junto con el software de reconocimiento de picos de alta potencia ha mejorado la capacidad de aislar, monitorear y analizar composiciones de sustancias de muestras complejas con detalles muy detallados. Utilizando estos avances tecnológicos, estudios recientes sobre la composición de peptidoglicanos han comenzado a utilizar técnicas automatizadas de extracción de características LC-MS 12,13,14,24 sobre la metodología más antigua basada en HPLC 11,25,26,27,28,29,30,31 . Aunque hay numerosos paquetes de software de extracción de características genéricas disponibles, el software comercial que utiliza la extracción recursiva de características es rápido y altamente robusto al identificar y combinar automáticamente todas las cargas, isótopos y versiones de aducción de cada muropéptido que se encuentra dentro del conjunto de datos LC-MS (Figura 3). Además, los tiempos de retención iniciales, m/z y los patrones isotópicos de las entidades extraídas se utilizan para reevaluar (recursivamente) el conjunto de datos para garantizar la identificación precisa de cada característica en todos los archivos de datos. Por lo tanto, el algoritmo recursivo ayuda a validar y aumentar la confianza en la identificación de picos. La mayoría de los programas genéricos de extracción de características no agrupan cargas/isótopos, etc. y requerirá esto como un paso manual adicional. Además, los programas genéricos serán menos robustos ya que las características se extraen por separado dentro de cada archivo de datos y no como un conjunto de datos completo, que es parte del algoritmo recursivo.

El protocolo peptidoglicómico presentado aquí fue utilizado recientemente para examinar los cambios composicionales de PG entre dos condiciones fisiológicas de crecimiento, a saber, planctónico de natación libre y biofilm comunal estacionario12. Utilizando un QTOF MS altamente sensible junto con la extracción de características recursivas, se reconocieron y rastrearon 160 muropéptidos distintos. Esto representó ocho veces el número de muropéptidos identificados en este organismo anteriormente 29,32, y más del doble de los muropéptidos identificados utilizando otras metodologías en otros organismos10,14,24.

La asociación de cada pico m/z extraído de los datos de EM con un muropéptido particular se facilita mediante referencias cruzadas con una base de datos de estructuras de muropéptidos conocidas y predichas. El cromatograma MS/MS de fragmentación (Figura 4) para cada característica extraída se compara con el perfil de fragmentación (Figura 4, recuadro gris) del muropéptido propuesto utilizando la base de datos.

Los datos peptidoglicómicos se pueden ver de varias maneras diferentes dependiendo de la configuración experimental y las preguntas que se hacen. Dicho análisis gráfico puede incluir análisis de componentes principales (PCA), diagramas de dispersión, diagramas de volcanes, mapas de calor y análisis de agrupamiento jerárquico. Por ejemplo, los diagramas de volcanes resaltan los muropéptidos que demuestran una alta magnitud estadísticamente significativa de cambio de abundancia entre las condiciones probadas (Figura 5A). Estos muropéptidos seleccionados que representan cambios significativos en la abundancia entre las condiciones probadas pueden examinarse más a fondo para detectar modificaciones de muropéptidos. Estas modificaciones pueden incluir la presencia de sustituciones de aminoácidos, cambios en la acetilación o la presencia de actividad de la amidasa. Cuando se examinan juntos, se pueden examinar múltiples muropéptidos que poseen la misma modificación para detectar una tendencia hacia una condición experimental (Figura 5A; puntos verdes resaltados) y se puede evaluar la importancia de todo el grupo (Figura 5B). El seguimiento de una modificación de muropéptido de esta manera, puede indicar una actividad enzimática particular que se ve afectada por el parámetro experimental. Además, los valores atípicos de esta tendencia pueden indicar actividad enzimática con una especificidad particular o función biológica (Figura 5A, puntos resaltados en naranja).

Figura 1: Ejemplo de una estructura típica de peptidoglicano gramnegativo. (A) En las bacterias gramnegativas, el peptidoglicano se encuentra en el periplasma entre las membranas interna y externa. (B) Un solo muropéptido consiste en una N-acetil glucosamina ligada a β-1,4 (GlcNAc) (azul) y un ácido N-acetil murámico (MurNAc) (púrpura) con una cadena lateral peptídica anexa (naranja). La cadena lateral peptídica puede ser reticulada a la cadena lateral del muropéptido adyacente produciendo el peptidoglicano maduro en forma de malla (A). La purificación implica el aislamiento del peptidoglicano de toda la célula como un sáculo donde todo el resto del material celular ha sido despojado. (C) Micrografía electrónica de transmisión de un sáculo de peptidoglicano. En comparación, la PG Grampositiva puede consistir en una mayor variedad de variaciones en la estructura y es parte de la clasificación taxonómica Grampositiva33. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Flujo de trabajo de peptidoglicómica. Preparación de muestras. Paso 1, cultivar y granular células bacterianas (sección 1.1). Paso 2, purificar peptidoglicano sacculi al 4% SDS hervir (sección 1.2). Adquisición de datos. Paso 3, digestión enzimática de sacculi para producir muropéptidos por rotura del enlace β-1,4 entre la N-acetilglucosamina (GlcNAc) y el ácido N-acetilmurámico (MurNAc) de la columna vertebral de peptidoglicano (sección 2.1). Paso 4, análisis de la intensidad del muropéptido mediante LC-MS/MS (sección 2.2). Análisis de datos. Paso 5, extracción de características recursivas identifica y recoge todas las cargas, aductos e isótopos asociados con un único muropéptido (sección 3.1). Paso 6, identificación de muropéptidos comparando la fragmentación prevista con cromatogramas MS/MS (sección 3.3). Paso 7, análisis diferencial bioinformático (sección 3.2) comparando cambios en la composición de peptidoglicanos entre diferentes parámetros experimentales. Paso 8, examinar el cambio global en las modificaciones de muropéptidos dentro de los diferentes parámetros experimentales utilizando anotación 1D (sección 3.4). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Ejemplo de una extracción de entidades recursivas. Para un muropéptido que representa una cadena lateral peptídica de alanina (A), iso-ᴅ-glutamato (E), ácido meso-diaminopimélico (m), alanina (A) reticulada al AE m A de la cadena lateral del muropéptido adyacente (1864.8 m/z). En la característica extraída para 1864.8 m/z se incluyen cargas (+1, +2 y +3), aductos (por ejemplo, sodio y potasio), pérdida de GlcNAc (1 o 2 GlcNAc) y múltiples picos isotópicos para cada variación (por ejemplo, inserción ampliada). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Fragmentación e identificación de muropéptidos. Para la anotación, a cada pico m/z (característica) extraído del cromatograma MS se le da una estructura de muropéptido propuesta basada en la similitud con una biblioteca de muropéptidos. Para confirmar esta estructura propuesta, los fragmentos de MS/MS predichos se generan utilizando un programa de dibujo químico (recuadro de grises). Esta fragmentación predicha se compara con el cromatograma MS/MS. Cuando los fragmentos predichos (recuadro de gris) coinciden con el cromatograma MS/MS, se confirma la estructura del muropéptido propuesta. La figura fue modificada de la Referencia12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Análisis diferencial de la composición de peptidoglicano. (A) Diagrama volcánica del cambio de pliegue y significación estadística de los cambios en la intensidad del muropéptido entre peptidoglicano purificado de P. aeruginosa cultivado como cultivo planctónico o de biopelícula estacionaria de natación libre. Se destacan todos los muropéptidos que tienen una modificación que representó un cambio en la disposición típica de aminoácidos dentro de la cadena lateral del péptido. Los muropéptidos sustituidos por aminoácidos que mostraron una tendencia hacia la disminución de la abundancia de peptidoglicano derivado de biopelícula se destacan en verde. Los muropéptidos sustituidos por aminoácidos que eran valores atípicos de esta tendencia y mostraron una mayor abundancia de peptidoglicano derivado de biopelícula se destacan en naranja. (B) Mapa de calor del cambio de pliegue global en abundancia de todos los muropéptidos sustituidos por aminoácidos con mayor abundancia (naranja) y disminución de abundancia (verde) en biopelículas. Estos muropéptidos se reagruparon y evaluaron para determinar si la sustitución de aminoácidos se produjo en monómeros, dímeros reticulados, o si se sustituyeron el cuarto (AE m +), quinto (AE m A +) o ambos aminoácidos (AEm ++). La significación de cada grupo de muropéptidos se evaluó mediante anotación 1D con FDR < 0,05 para la significación y se muestra la puntuación 1D asociada. La anotación 1D solo se puede realizar en más de 2 muropéptidos (por ejemplo, la sustitución AEm ++ solo se encontró en dos muropéptidos). Por lo tanto, en este caso, la significación debe examinarse para los muropéptidos individuales y no para el grupo. La figura fue modificada de la Referencia12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.