Este protocolo cubre un análisis detallado de la composición de peptidoglicanos utilizando espectrometría de masas de cromatografía líquida junto con extracción avanzada de características y software de análisis bioinformático.
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Artículo de método
Análisis semicuantitativo de peptidoglicano por cromatografía líquida, espectrometría de masas y bioinformática
En este artículo
Resumen
Resumen
El peptidoglicano es un componente importante de las paredes celulares bacterianas y un objetivo celular común para los antimicrobianos. Aunque los aspectos de la estructura del peptidoglicano están bastante conservados en todas las bacterias, también existe una variación considerable entre los grampositivos / negativos y entre las especies. Además, existen numerosas variaciones, modificaciones o adaptaciones conocidas al peptidoglicano que pueden ocurrir dentro de una especie bacteriana en respuesta a la fase de crecimiento y / o estímulos ambientales. Estas variaciones producen una estructura altamente dinámica que se sabe que participa en muchas funciones celulares, incluido el crecimiento / división, la resistencia a los antibióticos y la evitación de la defensa del huésped. Para comprender la variación dentro del peptidoglicano, la estructura general debe descomponerse en sus partes constitutivas (conocidas como muropéptidos) y evaluarse para determinar la composición celular general. La peptidoglicómica utiliza espectrometría de masas avanzada combinada con análisis de datos bioinformáticos de alta potencia para examinar la composición de peptidoglicano con gran detalle. El siguiente protocolo describe la purificación de peptidoglicano de cultivos bacterianos, la adquisición de datos de intensidad de muropéptidos a través de un cromatógrafo líquido-espectrómetro de masas y el análisis diferencial de la composición de peptidoglicano utilizando bioinformática.
Introducción
El peptidoglicano (PG) es una característica definitoria de las bacterias que sirve para mantener la morfología celular, al tiempo que proporciona soporte estructural para proteínas y otros componentes celulares 1,2. La columna vertebral de PG está compuesta por ácido murámico N-acetil ligado a β-1,4 (MurNAc) y N-acetilglucosamina (GlcNAc)1,2. Cada MurNAc posee un péptido corto unido al residuo ᴅ-lactilo que puede ser reticulado a péptidos adyacentes ligados a disacáridos (Figura 1A, B). ....
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Protocolo
1. Preparación de la muestra de peptidoglicano
- Crecimiento de cultivos bacterianos
NOTA: El crecimiento de los cultivos bacterianos variará dependiendo de la especie bacteriana y las condiciones de crecimiento que se examinen. Los parámetros experimentales a probar definirán las condiciones de crecimiento.- Cultivar cultivos bacterianos en condiciones de crecimiento requeridas para la cepa bacteriana y el diseño experimental. Cultivar bacterias como cultivos triplicados (réplicas biológicas), es decir, tres colonias separadas por cepa o condición de crecimiento.
NOTA: Se sabe que las condiciones de crecimiento y la fase de crecim....
- Cultivar cultivos bacterianos en condiciones de crecimiento requeridas para la cepa bacteriana y el diseño experimental. Cultivar bacterias como cultivos triplicados (réplicas biológicas), es decir, tres colonias separadas por cepa o condición de crecimiento.
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Resultados
El aumento de la sensibilidad de detección de la maquinaria de EM junto con el software de reconocimiento de picos de alta potencia ha mejorado la capacidad de aislar, monitorear y analizar composiciones de sustancias de muestras complejas con detalles muy detallados. Utilizando estos avances tecnológicos, estudios recientes sobre la composición de peptidoglicanos han comenzado a utilizar técnicas automatizadas de extracción de características LC-MS 12,13,14,24 sobre la metodología más antigua basada en HPLC
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Discusión
Este protocolo describe un método para purificar peptidoglicano de cultivos bacterianos, procesar para la detección de LC-MS y analizar la composición utilizando técnicas bioinformáticas. Aquí, nos centramos en las bacterias gramnegativas y se requerirá una ligera modificación para permitir el análisis de las bacterias grampositivas.
La preparación de muropéptidos se ha mantenido prácticamente igual desde que se produjo por primera vez en la década de 1960 9,11,15........
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Agradecimientos
Jennifer Geddes-McAlister y al Dr. Anthony Clarke por sus contribuciones en el perfeccionamiento de este protocolo. Este trabajo fue apoyado por subvenciones operativas del CIHR otorgadas a C.M.K (PJT 156111) y un NSERC Alexander Graham Bell CGS D otorgado a E.M.A. Las figuras se crearon en BioRender.com.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| C18 columna de fase inversa - AdvanceBio Columna de péptidos (100 mm x 2,1 mm, 2,7 y micro; m) | Adquisición de datos LC-MS | Agilent | |
| Controlador de manto calefactor, Optichem | Fisher | 50-401-788 | para ebullición al 4% SDS |
| Manto calefactor, 1000mL Hemisférico | Fisher | CG1000008 | para 4% SDS ebullición |
| Incubadora, 37° C | para purificación de sáculos y preparación de muestras MS | ||
| Condensador Leibig, 300MM 24/40,Fisher | CG121805 | para ebullición SDS al 4% | |
| Liofilizador | Labconco | para liofilización de sáculos | |
| Agitador Magentic | Fisher | 90-691-18 | para 4% SDS |
| Q-Tof modelo UHD 6530 | Aglient | Adquisición de datos LC-MS | |
| filtros de microcentrífuga, Nanosep MF 0.2 y micro; m | Fisher | 50-197-9573 | limpieza de la muestra antes de la inyección de MS |
| Soporte de retorta | Fisher | 12-000-102 | para ebullición al 4% SDS |
| Pinza de retorta | Fisher | S02629 | con ebullición al 4% SDS |
| - 1 litro Pyrex | Fisher | 07-250-084 | para ebullición SDS al 4% |
| Sonicador modelo 120 | Fisher | FB120 | para purificación de sáculos |
| Sonicador - micro punta | Fisher | FB4422 | para la purificación de sáculos |
| Ultracentrífuga | Beckman | lavado de sáculos | |
| Botellas ultracentrífugas, Ti45 | Fisher | NC9691797 | pasos de lavado de sáculos |
| Ciudad | de suministro de agua | para condensador | |
| Software | |||
| Chemdraw | Cambridgeeditor molecular de Cambridgesoft | para la predicción de fragmentación de muropéptidos | |
| Excel | Microsoft | viendo listas de muropeptidos anotados, abundancia, patrones isotópicos, etc. | |
| Adquisición de MassHunter | Aglient | en ejecución del instrumento QTOF | |
| Perfil de masas de MassHunter Análisis | diferencial bioinformático | Aglient | |
| Administrador de bibliotecas y bases de datos de compuestos personales de MassHunter | de datos de Muropéptido m/z MS Base de datos | ||
| MassHunter Profinder | Aglient | Extracción | |
| de características recursivasMassHunter Análisis cualitativo | Aglient | Cromatogramas MS y MS/MS | |
| Prisma | Graphpad | Software de gráficos | |
| Perseus | Max Plank Instituto de Bioquímica | 1D Anotación | |
| Material | |||
| Acetonitrilo | Fisher | A998-4 | |
| Acetato de amonio | Fisher | A637 | |
| Amilasa | Sigma-Aldrich | A6380 | |
| Ácido bórico | Fisher | BP168-1 | |
| DNasa | Fisher | EN0521 | |
| Ácido fórmico | Sigma-Aldrich | 27001-500ML-R | |
| LC-MS Mezcla de afinación - HP0321 | Agilent | G1969-85000 | |
| Cloruro de magnesio | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Sulfato de magnesio | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Mutanolisina de Streptomyces globisporus ATCC 21553 | Sigma-Aldrich | M9901 | |
| Gas nitrógeno (>99% de pureza) | Praxair | NI 5.0UH-T | |
| Ácido fosfórico | Fisher | A242 | |
| Pronase E de Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| RNasa | Fisher | EN0531 | |
| Azida sódica | Fisher | S0489 | |
| Borohidruro de sodio | Sigma-Aldrich | 452890 | |
| Dodecil sulfato de sodio (SDS) | Fisher | BP166 | |
| Hidróxido de sodio | Fisher | S318 | |
| Sodio Fosfato (dibásico) | Fisher | S373 | |
| Fosfato de sodio (monobásico) | Fisher | S369 | |
| Tinciones-todo | Sigma-Aldrich | E9379 |
Referencias
- Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiology Reviews. 32, 149-167 (2007).
- Pazos, M., Peters, K. Peptidoglycan. Sub-cellular Biochemistry. 92, 127-168 (2019).
- Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. A., Vollmer, W.
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Reimpresiones y permisos
