Análisis semicuantitativo de peptidoglicano por cromatografía líquida, espectrometría de masas y bioinformática

Resumen

Este protocolo cubre un análisis detallado de la composición de peptidoglicanos utilizando espectrometría de masas de cromatografía líquida junto con extracción avanzada de características y software de análisis bioinformático.

Resumen

El peptidoglicano es un componente importante de las paredes celulares bacterianas y un objetivo celular común para los antimicrobianos. Aunque los aspectos de la estructura del peptidoglicano están bastante conservados en todas las bacterias, también existe una variación considerable entre los grampositivos / negativos y entre las especies. Además, existen numerosas variaciones, modificaciones o adaptaciones conocidas al peptidoglicano que pueden ocurrir dentro de una especie bacteriana en respuesta a la fase de crecimiento y / o estímulos ambientales. Estas variaciones producen una estructura altamente dinámica que se sabe que participa en muchas funciones celulares, incluido el crecimiento / división, la resistencia a los antibióticos y la evitación de la defensa del huésped. Para comprender la variación dentro del peptidoglicano, la estructura general debe descomponerse en sus partes constitutivas (conocidas como muropéptidos) y evaluarse para determinar la composición celular general. La peptidoglicómica utiliza espectrometría de masas avanzada combinada con análisis de datos bioinformáticos de alta potencia para examinar la composición de peptidoglicano con gran detalle. El siguiente protocolo describe la purificación de peptidoglicano de cultivos bacterianos, la adquisición de datos de intensidad de muropéptidos a través de un cromatógrafo líquido-espectrómetro de masas y el análisis diferencial de la composición de peptidoglicano utilizando bioinformática.

Introducción

El peptidoglicano (PG) es una característica definitoria de las bacterias que sirve para mantener la morfología celular, al tiempo que proporciona soporte estructural para proteínas y otros componentes celulares ^1,2. La columna vertebral de PG está compuesta por ácido murámico N-acetil ligado a β-1,4 (MurNAc) y N-acetilglucosamina (GlcNAc)^1,2. Cada MurNAc posee un péptido corto unido al residuo ᴅ-lactilo que puede ser reticulado a péptidos adyacentes ligados a disacáridos (Figura 1A, B). ....

Protocolo

1. Preparación de la muestra de peptidoglicano

1. Crecimiento de cultivos bacterianos
   NOTA: El crecimiento de los cultivos bacterianos variará dependiendo de la especie bacteriana y las condiciones de crecimiento que se examinen. Los parámetros experimentales a probar definirán las condiciones de crecimiento.
   1. Cultivar cultivos bacterianos en condiciones de crecimiento requeridas para la cepa bacteriana y el diseño experimental. Cultivar bacterias como cultivos triplicados (réplicas biológicas), es decir, tres colonias separadas por cepa o condición de crecimiento.
      NOTA: Se sabe que las condiciones de crecimiento y la fase de crecim....

Resultados

El aumento de la sensibilidad de detección de la maquinaria de EM junto con el software de reconocimiento de picos de alta potencia ha mejorado la capacidad de aislar, monitorear y analizar composiciones de sustancias de muestras complejas con detalles muy detallados. Utilizando estos avances tecnológicos, estudios recientes sobre la composición de peptidoglicanos han comenzado a utilizar técnicas automatizadas de extracción de características LC-MS 12,13,14,24 sobre la metodología más antigua basada en HPLC

Discusión

Este protocolo describe un método para purificar peptidoglicano de cultivos bacterianos, procesar para la detección de LC-MS y analizar la composición utilizando técnicas bioinformáticas. Aquí, nos centramos en las bacterias gramnegativas y se requerirá una ligera modificación para permitir el análisis de las bacterias grampositivas.

La preparación de muropéptidos se ha mantenido prácticamente igual desde que se produjo por primera vez en la década de 1960 9,11,15.^.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Equipment
C18 columna de fase inversa - AdvanceBio Columna de péptidos (100 mm x 2,1 mm, 2,7 y micro; m)	Adquisición de datos LC-MS	Agilent
Controlador de manto calefactor, Optichem	Fisher	50-401-788	para ebullición al 4% SDS
Manto calefactor, 1000mL Hemisférico	Fisher	CG1000008	para 4% SDS ebullición
Incubadora, 37° C			para purificación de sáculos y preparación de muestras MS
Condensador Leibig, 300MM 24/40,Fisher		CG121805	para ebullición SDS al 4%
Liofilizador	Labconco		para liofilización de sáculos
Agitador Magentic	Fisher	90-691-18	para 4% SDS
Q-Tof modelo UHD 6530	Aglient		Adquisición de datos LC-MS
filtros de microcentrífuga, Nanosep MF 0.2 y micro; m	Fisher	50-197-9573	limpieza de la muestra antes de la inyección de MS
Soporte de retorta	Fisher	12-000-102	para ebullición al 4% SDS
Pinza de retorta	Fisher	S02629	con ebullición al 4% SDS
- 1 litro Pyrex	Fisher	07-250-084	para ebullición SDS al 4%
Sonicador modelo 120	Fisher	FB120	para purificación de sáculos
Sonicador - micro punta	Fisher	FB4422	para la purificación de sáculos
Ultracentrífuga	Beckman		lavado de sáculos
Botellas ultracentrífugas, Ti45	Fisher	NC9691797	pasos de lavado de sáculos
Ciudad		de suministro de agua	para condensador
Software
Chemdraw	Cambridgeeditor molecular de Cambridgesoft		para la predicción de fragmentación de muropéptidos
Excel	Microsoft		viendo listas de muropeptidos anotados, abundancia, patrones isotópicos, etc.
Adquisición de MassHunter	Aglient		en ejecución del instrumento QTOF
Perfil de masas de MassHunter Análisis	diferencial bioinformático	Aglient
Administrador de bibliotecas y bases de datos de compuestos personales de MassHunter			de datos de Muropéptido m/z MS Base de datos
MassHunter Profinder	Aglient		Extracción
de características recursivasMassHunter Análisis cualitativo	Aglient		Cromatogramas MS y MS/MS
Prisma	Graphpad		Software de gráficos
Perseus	Max Plank Instituto de Bioquímica		1D Anotación
Material
Acetonitrilo	Fisher	A998-4
Acetato de amonio	Fisher	A637
Amilasa	Sigma-Aldrich	A6380
Ácido bórico	Fisher	BP168-1
DNasa	Fisher	EN0521
Ácido fórmico	Sigma-Aldrich	27001-500ML-R
LC-MS Mezcla de afinación - HP0321	Agilent	G1969-85000
Cloruro de magnesio	Sigma-Aldrich	M8266
Sulfato de magnesio	Sigma-Aldrich	M7506
Mutanolisina de Streptomyces globisporus ATCC 21553	Sigma-Aldrich	M9901
Gas nitrógeno (>99% de pureza)	Praxair	NI 5.0UH-T
Ácido fosfórico	Fisher	A242
Pronase E de Streptomyces griseus	Sigma-Aldrich	P5147
RNasa	Fisher	EN0531
Azida sódica	Fisher	S0489
Borohidruro de sodio	Sigma-Aldrich	452890
Dodecil sulfato de sodio (SDS)	Fisher	BP166
Hidróxido de sodio	Fisher	S318
Sodio Fosfato (dibásico)	Fisher	S373
Fosfato de sodio (monobásico)	Fisher	S369
Tinciones-todo	Sigma-Aldrich	E9379