Dos Enfoques Citométricos De Flujo De La Detección De Superficie Del Ligando NKG2D Para Distinguir Las Células Madre De Las Subpoblaciones A Granel En La Leucemia Mieloide Aguda

Las células NK son importantes efectoras del sistema inmune innato que pueden reconocer y eliminar células malignas o células sanas estresadas (por ejemplo, por una infección viral) sin estimulación previa de^{antígenos 1.} Este proceso está estrechamente regulado a través de un complejo repertorio de receptores activadores —como los receptores naturales de citotoxicidad (NCR), NKG2D y CD16— y receptores inhibitorios que están representados en gran medida por receptores asesinos similares a inmunoglobulinas (KIRs)^2. El atascamiento de KIRs a las moléculas humanas de la clase I del antígeno del leucocito (HLA) en las células somáticas asegura el auto-reconocimiento y transporta tolerancia de la célula de NK. Por otro lado, la ausencia de auto-reconocimiento y el aumento de la unión de los receptores activadores a sus ligandos en las células diana desencadenan la liberación de gránulos citotóxicos que conducen a la citotoxicidad mediada por células NK¹. Finalmente, las células NK pueden ejercer citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) mediante la unión del receptor activador CD16 a dianas que expresan la porción Fc de Ig^(FcR)2. Aparte de la citotoxicidad directa, las células NK también pueden desencadenar la liberación de citoquinas que unen lo innato con el sistema inmune adaptativo³.

NKG2D es un importante receptor activador expresado en NK, NKT, γδ T, y las células T CD8 +^{ingenuas 4} que permite a tales células inmunes citotóxicas reconocer y lise NKG2D ligando (NKG2DL) que expresan las células diana. Las células sanas comúnmente no expresan NKG2DL. En cambio, la expresión de NKG2DL se regula al alza en células malignas o infectadas por virus para que estas sean susceptibles de aclaramiento inmunológico⁵.

La familia humana NKG2DL comprende ocho moléculas conocidas entre las cuales las dos moléculas relacionadas con la cadena MHC I A y B (MICA y MICB⁶⁾y las proteínas de unión al citomegalovirus UL16 1-6 (ULBP1-6^7). La expresión de NKG2DL está regulada tanto en los niveles transcripcional, post-transcripcional como post-translacional^8. Como tal, mientras que la expresión de NKG2DL no es comúnmente perceptible en la superficie de células sanas, NKG2DL mRNA⁹ y la expresión intracelular de la proteína fueron divulgados en tejidos sanos. La relevancia funcional de dicha expresión y los mecanismos subyacentes a tales patrones de expresión discrepantes aún no se han definido¹⁰.

La regulación mecanicista de la expresión de NKG2DL en las células cancerosas es un área fascinante de la investigación. Las vías que se sabe que están implicadas en el estrés celular, por ejemplo, la vía de estrés por choque térmico^9,o en las vías asociadas al daño del ADN, como la ataxia telangiectasia mutada (ATM) y la vía¹¹relacionada con Rad3 (ATR), así como las infecciones virales o bacterianas se han relacionado directamente con la inducción de la expresión de NKG2DL^12. Sin embargo, incluso si la expresión superficial de NKG2DL ha sido inducida de manera efectiva, esta expresión puede perderse nuevamente a través del desprendimiento mediado por proteolíticos, un mecanismo asociado con el escape inmune y el mal pronóstico clínico en algunos cánceres^13.

La ausencia de NKG2DL de la superficie de la célula puede también desempeñar papeles importantes en pacientes con AML. Aquí, el tratamiento con quimioterapia intensiva a menudo induce la remisión, pero la recaída a menudo ocurre a partir de células madre leucémicas (LSC), que sobreviven selectivamente a las quimioterapias y evaden la respuesta inmune. Como mostramos recientemente, los LSC, por ejemplo, escapan a la lisis de células NK suprimiendo la expresión de superficie NKG2DL¹⁴.

Inversamente, la ausencia de expresión de NKG2DL superficie se puede utilizar como un método para identificar y aislar de manera conveniente supuestas subpoblaciones de células similares a tallos de subpoblaciones leucémicas homólogas a granel. Aquí, presentamos dos acercamientos cytometric del flujo que se puedan utilizar para detectar la expresión superficial de NKG2DL y de tal modo para identificar las células madres negativas de NKG2DL en leucemia y quizás también en otros cánceres: Un método para el reconocimiento superficial del cacerola-ligand y un método que implica la coloración con los anticuerpos solos o agrupados que reconocen las proteínas conocidas individuales de NKG2DL.

Las muestras de pacientes se recogieron después de la aprobación de la Junta de Revisión de Ética de los Hospitales Universitarios de Basilea y Tuebingen.

1. Biotinilación de la proteína de fusión NKG2D

NOTA: Este paso se realiza con un kit de biotinilación (ver Tabla de Materiales) deacuerdo con las instrucciones del fabricante. Este paso del protocolo debe realizarse al menos 24 h antes de la tinción. La proteína de fusión NKG2D biotinilada debe almacenarse a -20 °C.

1. Descongelar tanto la biotina, como los tubos de proteína de fusión NKG2D a temperatura ambiente (RT).
   NOTA: Si las células necesitan ser estériles para un uso experimental adicional (inyección en ratones, ensayos de unidades formadores de colonias, etc.), reconstituya la proteína de fusión bajo una campana de flujo laminar para evitar la contaminación. De lo contrario, cada paso se puede realizar en un banco.
2. Gire rápidamente hacia abajo los 50μg de proteína de fusión liofilizada NKG2D. Añadir 500 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) para reconstituir el polvo y mezclar a fondo con una micropipeta P1000.
3. Añadir 100 μL de la proteína de fusión NKG2DL a un tubo de biotina para obtener una concentración final de 100 μg/mL.
4. Mezcle la solución a fondo mediante un resuspiente continuo con una micropipeta P100.
5. Incubar la solución de proteína/biotina de fusión a un RT controlado durante 24 h. La proteína de fusión ya está lista para usar.

2. Descongelación de las células primarias de AML

NOTA: Aproximadamente 5.000.000 de células leucémicas congeladas por paciente almacenadas en nitrógeno líquido se descongelaron y luego se utilizaron para los ensayos de inmediato. Las células leucémicas fueron obtenidas y congeladas como se describió^{previamente 15}. Brevemente, las muestras de sangre periféricas recogidas de pacientes con AML y los altos porcentajes de la célula de la ráfaga (>90% de ráfagas entre células mononucleares) fueron procesadas con una separación del gradiente de densidad para obtener las células mononucleares y congeladas posteriormente en el suero fetal del becerro (FCS) que contenía la solución del sulfóxido dimethyl del 10% (DMSO). Los números de la célula variaron altamente entre los pacientes en dependencia de la concentración del leucocito en el paciente (gama: 1.000.000 a 30.000.000 de células leucémicas por sangre del mL).

1. Medio RPMI precalentado que contiene el 10% de FCS a 37 °C utilizando un baño de agua. Para cada vial de células AML (hasta 30.000.000 de células en 1 mL de FCS + 10% dmso), añadir 10 mL de medio precalentado a un tubo de reacción de 15 ml.
2. Retire el cryovial que contiene AML primario del almacenamiento de nitrógeno líquido y descongele inmediatamente las células usando un baño de agua de 37 °C. Mueva suavemente el tubo hacia adelante y hacia atrás en el agua, permitiendo que el contenido del vial se descongele hasta que solo quede un pequeño cristal de hielo.
3. Transfiera inmediatamente las células descongeladas al tubo que contiene el medio y enjuague el vial con 1 mL de medio.
4. Centrifugar las células a 300 x g durante 10 min y desechar el sobrenadante sin molestar el pellet.
5. Lavar las células con 5 mL de medio RPMI que contiene 10% de FCS y centrífuga a 300 x g durante 10 min.

3. Conteo de celdas

1. Resuspend el pellet de la célula en un volumen sabido de medio RPMI que contiene el 10% de FCS.
2. Transfiera un pequeño volumen de la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y diluya en una proporción conocida con azul tripano o cualquier otro tinte alternativo que permita la discriminación de células vivas/células muertas.
3. Utilice cualquier dispositivo para contar las celdas.
4. Centrifugar las células a 300 x g durante 10 min y desechar el sobrenadante sin molestar el pellet.

4. Tinción de células AML primarias usando la proteína de fusión biotinilada NKG2D

1. Preparar el tampón de tinción complementando 500 mL de PBS con albúmina sérica bovina (BSA) y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) a una concentración final de 0,07 mM y 2 mM, respectivamente. Ajuste el pH (7.2–7.4) si es necesario.
2. Resuspend el pellet de la célula con el almacenador intermediario de la coloración a una concentración final de 0,5 x 10⁷ cells/mL.
   NOTA: Opcionalmente, antes de la tinción, las células se pueden incubar con un agente bloqueador (por ejemplo, hIgG (1μg/ml) durante 30 min en RT o agente bloqueador de FcR)..
3. Transferir 100 μL de la suspensión celular a una placa de fondo en U de cultivo celular de 96 pozos y centrifugar la placa a 300 x g durante 10 min. Deseche el sobrenadante sin molestar el pellet.
4. Prepare una mezcla maestra de proteína de fusión NKG2D biotinilada para que las células se resuspended en un volumen final de 50 μL por pozo con una concentración final de 10 μg/mL por pozo.
5. Añadir la mezcla maestra preparada en el paso 4.4 con una pipeta de 100 μL y resuspend los pellets celulares con una pipeta multicanal de 300 μL.
   NOTA: Reduzca el volumen final de acuerdo con el número de células para reducir la cantidad de proteína de fusión necesaria para la tinción.
6. Incubar la suspensión celular durante 25 min a RT o 50 min a 4 °C.
7. Lave las células agregando 200 μL de tampón de tinción por pozo con una pipeta multicanal de 300 μL.
8. Centrifugar la placa a 300 x g durante 10 min y desechar el sobrenadante sin molestar el pellet.
9. Repita los pasos 4.7 y 4.8.
   NOTA: La tinción descrita aquí se realiza en una placa de fondo en U de cultivo celular de 96 pozos. Por lo tanto, los pasos de lavado se realizan dos veces debido a la pequeña capacidad de volumen de tales placas. La tinción también se puede realizar en otros tubos y los pasos de lavado se pueden realizar solo una vez usando un volumen más grande.
10. Prepare una mezcla maestra utilizando Streptavidin-PE (ver Tabla 1 para diluciones) para que las células se resuspended en un volumen final de 50 μL.
    NOTA: Agregue anticuerpos de selección para su tipo de interés celular como, por ejemplo, CD33, CD34. para AML.
11. Añadir la mezcla maestra preparada en el paso 4.10 utilizando una pipeta de 100 μL y resuspend los pellets celulares con una pipeta multicanal de 300 μL.
12. Incubar las suspensiones celulares durante 15 min a RT o 30 min a 4 °C en la oscuridad.
13. Lave las células agregando 200 μL de tampón de tinción por pozo con una pipeta multicanal de 300 μL.
14. Centrifugar la placa a 300 x g durante 10 min y desechar el sobrenadante sin molestar el pellet.
15. Repita los pasos 4.13 y 4.14.
16. Prepare una solución de tampón de tinción incluyendo 7-AAD (7-Aminoactinomycin D, 1:1000) o cualquier reactivo para distinguir entre células vivas y muertas.
17. Pellets de células resuspéntidas en tampón de tinción de 200 μL + 7-AAD preparados en el paso 4.16 en el uso de una micropipeta multicanal de 300 μL.
18. Analice las células usando un dispositivo cytometry de flujo.

5. Tinción de anticuerpos anti-NKG2DL individuales o agrupados

1. Utilice la misma suspensión de celda que en el paso 4.2.
2. Transferir 100 μL de la suspensión celular a una placa de fondo en U de cultivo celular de 96 pozos utilizando una pipeta multicanal de 300 μL y centrifugar la placa a 300 x g durante 10 min. Deseche el sobrenadante sin molestar el pellet.
3. Prepare una mezcla maestra de anticuerpos para cada anticuerpo primario o anticuerpos agrupados (consulte la Tabla 2 para diluciones) de modo que las células se resuspended en un volumen final de 50 μL.
4. Añadir la mezcla maestra preparada en el paso 5.3 con una pipeta de 100 μL y resuspend los pellets celulares con una pipeta multicanal de 300 μL.
5. Incubar las células durante 25 min en RT.
6. Lave las células agregando 200 μL de tampón de tinción por pozo usando una pipeta multicanal de 300 μL.
7. Centrifugar el cultivo celular de 96 pozos en la placa de fondo en U a 300 x g durante 10 min y desechar el sobrenadante sin molestar el pellet.
8. Repita los pasos 5.6 y 5.7.
9. Prepare una mezcla maestra de anticuerpos añadiendo el anticuerpo secundario (ver Tabla 2 para diluciones) para que las células se resuspended en un volumen final de 50 μL por pocillo.
10. Añadir la mezcla maestra preparada en el paso 5.9 con una pipeta de 100 μL y resuspend los pellets celulares con una pipeta multicanal de 300 μL.
11. Incubar durante 15 min a RT o 30 min a 4 °C en la oscuridad.
12. Lave agregando 200 μL de tampón de tinción por pozo usando una pipeta multicanal de 300 μL.
13. Centrifugar la suspensión celular a 300 x g durante 10 min y desechar el sobrenadante sin molestar el pellet.
14. Repita los pasos 5.12 y 5.13.
15. Pellets de células resuspentes en tampón de tinción de 200 μL que contienen 7-AAD preparados en el paso 4.16.
16. Analice las células usando un dispositivo cytometry de flujo según lo descrito en el paso 6.

6. Adquisición de datos

NOTA: Asegúrese de que se realizan controles de calidad semanales del citómetro de flujo para asegurarse de que los láseres funcionan correctamente. Para el protocolo presentado aquí, se realiza un proceso semanal de citómetro y seguimiento (CTS) con perlas relativas para comprobar el rendimiento del láser en todos los canales. Después del CTS, se registran 10.000 eventos utilizando las perlas de 8 picos como control interno. Todos los picos deben estar en la misma posición dentro de sus puertas y bien separados entre sí.

1. Cree la compensación de la matriz para restar la superposición espectral entre detectores con perlas o con celdas¹⁶.
2. Registre 10.000 eventos para las células no manchadas y las cuentas manchadas individuales. Para los controles de fluorescencia menos uno (FMO), registre 50,000 eventos y para las muestras completamente teñidas registre hasta 100,000 eventos.
   NOTA: Alternativamente, se pueden realizar muestras teñidas individuales en las células. Si es así, asegúrese de que las celdas tienen una señal positiva para el marcador deseado.
3. Adquiera una sola célula teñida o una muestra de perla para cada fluoróforo utilizado en el experimento para revelar la cantidad de superposición espectral. Utilice el creador de compensación del dispositivo de citometría de flujo para calcular los valores de derrame y aplicar la matriz de compensación a todas las muestras medidas.
   NOTA: Los anticuerpos secundarios no se pueden utilizar para la creación de compensación utilizando perlas si la compensación se calcula con perlas. Dependiendo del tipo de perlas de compensación, los anticuerpos secundarios no se pueden utilizar para la compensación con perlas.
4. Para los controles FMO y las muestras teñidas completas con la proteína de fusión, en primer lugar, seleccione las células en función de su dispersión directa (FSC) y dispersión lateral (SSC). Después de la exclusión de dobletes, bloquear las células en función de su negatividad para 7-AAD (PercP-Cy5.5) señal para excluir las células muertas (ver paso 5.15). La gráfica final muestra la expresión de CD34 (eje Y) y NKG2DL (eje X) en singletes vivos.
5. Para los anticuerpos anti-NKG2DL individuales, aplique la misma estrategia a las muestras, pero tenga en cuenta que la positividad del ligando se encuentra en Alexa Fluor 488 y no en el canal PE.
6. Ajuste las puertas de acuerdo con los controles FMO para la estrategia de gating de los pasos 6.4 y 6.5 (ver Tabla 3)para que los controles FMO apropiados se realicen para este experimento: En el software de análisis, dibuje una puerta en la fracción negativa. Al registrar la muestra completamente teñida, las celdas por encima de la puerta creada previamente son positivas para el marcador analizado.

Ambos protocolos presentados aquí permiten el enriquecimiento de AML LSC mediante análisis citométricos de flujo utilizando CD34, un marcador conocido de LSC17,en combinación con la expresión de la superficie de NKG2DL mediante la utilización de reconocimiento de panligando o tinción con anticuerpos agrupados contra ligandos individuales. En la Figura 1,mostramos que las muestras de LMA analizadas son positivas para CD34 y NKG2DL, pero también existen subpoblaciones negativas, lo que se demuestra por la presencia de cuatro poblaciones diferentes en total. Nuestros datos muestran la estrategia típica de gating para tal tinción, comenzando con la selección de la población principal de células a través de su FSC y SSC. Los dobletes y las células muertas se excluyen en el análisis aguas abajo (Figura 1A). Las puertas se ajustan utilizando controles FMO para garantizar la identificación adecuada de las células positivas (Figura 1B).

En la Figura 1C,destacamos las intensidades de fluorescencia de las células positivas para CD34 (APC, eje Y) vs NKG2DL (PE, eje X). Las células AML que son positivas para CD34 muestran una menor expresión superficial de NKG2DL(Figura 1C),lo que está en línea con los hallazgos anteriores de nuestro laboratorio, mostrando que la expresión de NKG2DL está asociada con la falta de stemness14.

La Figura 2 indica la robustez de ambos métodos de tinción NKG2DL. En la Figura 2A,investigamos tres muestras primarias de LMA lado a lado mostrando 19,8, 49,8 y 89,4%, respectivamente, de eventos positivos para la tinción de la proteína de fusión frente a 20,4, 50,4 y 90,6% para la tinción de anticuerpos anti-NKG2DL agrupados (anticuerpos agrupados contra MICA, MICB, ULBP1, ULBP2/5/6 y ULBP3), respectivamente. Por otro lado, la tinción de un solo ligando (contra MICA, MICB, ULBP1, ULBP2/5/6 o ULBP3) muestra un rango de eventos positivos de hasta el 92%(Figura 2B). Este porcentaje varía en función del propio ligando y del paciente, por ejemplo, ulbp3 (figura 2B). Cabe destacar que una sola celda puede expresar múltiples NKG2DL.

Cuando múltiples anticuerpos anti-NKG2DL se agrupan y combinan en un solo tubo, el porcentaje de células positivas es comparable al porcentaje de la proteína de fusión (Figura 2A). Como tal, ambos protocolos funcionan bien y pueden proporcionar resultados similares con respecto a la expresión de NKG2DL en las células AML primarias. En algunos AML, el método de la proteína de fusión puede permitir una sensibilidad más alta puesto que puede permitir el reconocimiento de otras proteínas de NKG2DL.

Figura 1: Estrategia de gating típica de muestras primarias de AML. (A)Las celdas se gatean primero en función de su tamaño (eje X) y complejidad (por ejemplo, granularidad, eje Y). A continuación, los dobletes se excluyen trazando el alto o el ancho con respecto al área para la dispersión hacia delante. Finalmente, las células vivas se seleccionan en función de su tamaño (eje X) frente a su negatividad para 7AAD (PerCP-Cy5.5, eje Y). (B)Los controles FMO se utilizan para establecer las puertas que ayudan a discriminar entre poblaciones positivas y negativas para los marcadores indicados. La estrategia de gating sigue siendo idéntica a la que se muestra en la Figura 1A. (C)Gráfica de citometría de flujo que muestra eventos positivos y negativos para CD34 (APC, eje Y) vs NKG2DL (PE o AlexaFluor488, eje X). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 2: Comparación de protocolos de tinción. (A)Gráficos de barras que muestran el porcentaje de eventos positivos para la proteína de fusión frente a los anticuerpos anti-NKGD2L agrupados (n = 3 muestras de AML) de células vivas individuales cerradas. (B)Gráficos de barras que muestran el porcentaje de eventos positivos para la tinción de un solo ligando para todos los anticuerpos anti-NKG2DL conocidos y los ligandos individuales agrupados (consulte la Tabla de materiales para obtener información detallada sobre los anticuerpos). El gating fue realizado otra vez en solas células vivas. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Tabla 1: Tubos necesarios para teñir muestras con la proteína de fusión NKG2D. Esta tabla muestra los tubos necesarios para configurar el experimento.

Tabla 2: Tubos necesarios para teñir muestras con los anticuerpos anti-NKG2DL. Esta tabla muestra los tubos necesarios para configurar el experimento.

Tabla 3: Tubos necesarios para establecer los controles esenciales. Esta tabla muestra los tubos requeridos para configurar los controles adecuados de anticuerpos FMO, primarios y secundarios. Todos los controles requeridos (FMO) deben ser agregados por el experimentador para obtener resultados válidos y datos interpretables.

Los autores no tienen nada que revelar.