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Uso de análisis de imágenes por ordenador para mejorar la cuantificación de la metástasis pulmonar en el modelo de cáncer de mama 4T1

DOI:

10.3791/61805

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October 2nd, 2020

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1Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, 2Graduate Program in Translational Biology, Medicine and Health, Virginia Polytechnic Institute and State University, 3Department of Biomedical Engineering and Mechanics, Virginia Polytechnic Institute and State University, 4Department of Basic Science Education, Virginia Tech Carilion School of Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Describimos un método más consistente y expeditivo para cuantificar la metástasis pulmonar en el modelo de cáncer de mama 4T1 mediante Fiji-ImageJ.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El cáncer de mama es una tumoral devastadora, que representa 40.000 muertes femeninas y el 30% de los nuevos diagnósticos de cáncer femenino en los Estados Unidos solo en 2019. La principal causa de muertes relacionadas con el cáncer de mama es la carga metastásica. Por lo tanto, los modelos preclínicos para el cáncer de mama deben analizar la carga metastásica para que sea clínicamente relevante. El modelo de cáncer de mama 4T1 proporciona un modelo de ratón cuantificable y cuantificador de forma espontánea para el cáncer de mama humano en estadio IV. Sin embargo, la mayoría de los protocolos 4T1 cuantifican la carga metastásica contando manualmente las colonias manchadas en placas de cultivo de tejidos. Si bien esto es suficiente para los tejidos con menor carga metastásica, el error humano en el conteo manual causa resultados inconsistentes y variables cuando las placas son confluentes y difíciles de contar. Este método ofrece una solución basada en computadora para el error de recuento humano. Aquí, evaluamos el protocolo usando el pulmón, un tejido altamente metastásico en el modelo 4T1. Las imágenes de placas teñidas de azul de metileno se adquieren y se cargan para su análisis en Fiji-ImageJ. Fiji-ImageJ determina a continuación el porcentaje del área seleccionada de la imagen que es azul, lo que representa el porcentaje de la placa con carga metastásica. Este enfoque basado en computadora ofrece resultados más consistentes y expeditivos que el conteo manual o la evaluación histopatológica para tejidos altamente metastásicos. La consistencia de los resultados de Fiji-ImageJ depende de la calidad de la imagen. Pueden producirse ligeras variaciones en los resultados entre las imágenes, por lo que se recomienda que se tomen varias imágenes y se promedan los resultados. A pesar de sus limitaciones mínimas, este método es una mejora para cuantificar la carga metastásica en el pulmón al ofrecer resultados consistentes y rápidos.

Introduction

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Una de cada ocho mujeres será diagnosticada con cáncer de mama en su vida, y sin embargo, a pesar de múltiples opciones de tratamiento, el cáncer de mama es la segunda causa principal de muertes relacionadas con el cáncer en mujeres estadounidenses1. Estas mujeres no están muriendo por el tumor primario en su mama. En su lugar, la carga metastásica es responsable de la mortalidad de esta enfermedad, ya que comúnmente se propaga al pulmón, hueso, cerebro, hígado, y los ganglios linfáticos2. Debido a esto, los modelos de cáncer de mama necesitan evaluar la metástasis para contribuir a frenar la mortalidad de esta enfermeda....

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Protocol

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Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso animal (IACUC) de Virginia Tech y de acuerdo con la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. La realización de este protocolo requiere el permiso de las instituciones apropiadas y el cumplimiento de todas las directrices apropiadas.

1. Cultivo celular

  1. Hacer medios de cultivo completos (RPMI + 10% Suero Bovino Fetal +1% Pluma Strep). Reavice 4T1 células de acuerdo con el ProtocoloATCC 10 e incubar a 37oC y 5% co2 en un matraz T-25 hasta que se conflue....

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Results

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Este método contiene ajustes simples del protocolo Pulaski y Ostrand-Rosenberg 4T13 y se puede visualizar en la Figura 1. Cuando 3 investigadores separados contaron manualmente colonias metastásicas para 12 placas pulmonares (1:10 dilución), los resultados fueron muy inconsistentes entre diferentes contadores (Figura 2A). Todos los investigadores fueron dirigidos a "contar las colonias metastásicas que aparecen como puntos azules", sin em.......

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Discussion

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Como se ha demostrado, el recuento manual de las colonias metastásicas en cada placa pulmonar puede ser un método inexacto e impreciso para cuantificar la metástasis pulmonar, demostrando la necesidad de un mejor medio de cuantificación(Figura 2). El análisis histopatológico difería ligeramente tanto del conteo manual como del análisis Fiji-ImageJ(Figura 2B y 4D),probablemente porque las diapositivas H&E no son una muestra representativa de todo.......

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Disclosures

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Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por el Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine (IA), el Virginia Tech Institute for Critical Technology and Applied Science Center for Engineered Health (IA), y National Institutes of Health R21EB028429 (IA).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Cámara de anestesiaVer comentarios Vercomentarios Utilicemateriales aprobados en las políticas de su institución
Agente anestésicoVer comentariosVer comentariosUtilice materiales aprobados en las políticas de su institución
BALB/c Ratones hembraThe Jackson Laboratory000651
Tijeras sin filoRobozRS-6700
CalculadoraCualquieraCualquier
CámaraCualquierMínimode 8 megapíxeles
CentrífugaCualquieraCualquiera Necesitaser capaz de 125 x g y 300 x g
CO2 Configuración de la eutanasiaVer comentariosVer comentariosUtilice materiales aprobados en las políticas de su institución
Cámaras frigoríficas, refrigeradores, cámaras frigoríficasCualquieraCualquiera
Computadora con Fiji-ImageJCualquieraCualquieraNecesita ser capaz de ejecutar Fiji-ImageJ
Cámara de conteoFisher Scientific02-671-10
Tijeras curvasRobozRS-5859
Agua destiladaCualquiera Cualquiera
MP Biomedicals100617
Báscula electrónicaCualquierCualquiera
Suero Fetal Bovino (FBS)R& D SystemsS11150
PinzasRobozRS-8100
IceN/A/A
IncubadoracomentariosVer comentariosDebe ser capaz de 5% de CO2 y 37 ° C
MetanolFisher ScientificA412SK-4
Azul de metilenoSigma-Aldrich03978-250ML
Penicilina EstreptomicinaATCC30-2300
Alfileres o agujasCualquieraCualquieraPara sujetar ratones durante la necropsia
Pinzas de plásticoVWR25729-670
RMPI-1640 MedioATCC30-2001
Balancín o rueda giratoriaCualquieraTijeras
afiladasRobozRS-6702
Filtro desechable estéril con membrana PESThermoFisher Scientific568-0010
Matraces T-150Fisher Scientific08-772-48
Matraces T-25 FisherScientific10-126-10
Frascos T-75 FisherScientific13-680-65
Vaso de precipitados de plástico de tres esquinasFisher Scientific14-955-111FSe utiliza para pesar ratones
Azul de tripánVWR97063-702
Tripsina-EDTAATCC30-2101
Colagenasa tipo IVSigma-AldrichC5138
Placas de cultivo de tejidos de 3,5 cmNunclon153066
jeringa de 1 mLBD309659
tubos de microcentrífuga de 1,7 mLVWR87003-294
placas de cultivo de tejidos de 10 cmFisher Scientific08-772-22
placa de 12 pocillosCorning3512
tubo de centrífuga de 15 mLFisher Scientific14-959-70C
1X Solución salina tamponada con phostfato de Dulbecco (DPBS)Fisher Scientific SH30028FS
1X Hank' s Solución salina equilibrada (HBSS)Thermo ScientificSH3026802
27 g 1/2 en agujasFisher Scientific14-826-48
4T1 (ATCC® CRL&tímido; 2539&comercio;)ATCCCRL-2539
Tubo de centrífuga de 50 mLFisher Scientific14-959-49A
6-TioguaninaSigma-AldrichA4882
70 μ Filtro de celdas MFisher Scientific22-363-548
70% etanolSigma AldrichE7023Diluido al 70% con agua desionizada
Elastase N Ver

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. American Cancer Society. Cancer Facts & Figures. American Cancer Society. , (2019).
  2. Yousefi, M., et al. Organ-specific metastasis of breast cancer: molecular and cellular mechanisms underlying lung metastasis. Cellular Oncology. 41 (2), 123-140 (201....

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