Un protocolo mejorado de tiempo y mano de obra eficiente para el aislamiento de hepatocitos primarios en ratones

El hígado sirve como uno de los órganos más importantes en el cuerpo de los vertebrados debido al papel vital que desempeña en numerosas funciones de soporte vital como la digestión de alimentos, la circulación sanguínea y la desintoxicación. El uso del cultivo in vitro de hepatocitos primarios de ratón es cada vez más popular en estudios sobre el metabolismo de los carbohidratos y el carcinoma hepático. Por lo tanto, es importante desarrollar un método conveniente para el aislamiento de hepatocitos primarios de ratón mientras se mantiene su función fisiológica innata. Debido a su función como un centro del metabolismo de la glucosa, el hígado también es fundamental para la producción y el almacenamiento de glucosa¹. Los experimentos con hepatocitos primarios in vitro son imprescindibles para la mayoría de los estudios del metabolismo de la glucosa. Por lo tanto, durante años, varios grupos de investigación han desarrollado protocolos para el aislamiento de hepatocitos primarios en ratones.

El procedimiento general del aislamiento de hepatocitos de ratón es primero eliminar la sangre en el hígado con un líquido isosmótico como solución salina tamponada con fosfato (PBS) o solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) y luego usar solución que contiene colagenasa para disociar los hepatocitos. Estos protocolos comparten un procedimiento general, pero difieren en reactivos y pasos en función de las diferentes necesidades. Sin embargo, la preparación de los reactivos necesarios y la realización de pasos de aislamiento llevan tiempo. En el desarrollo del presente protocolo, se estableció la eficiencia como una prioridad, con todos los reactivos listos para usar y disponibles en el mercado, y la menor cantidad de pasos posible. El objetivo general de este protocolo es proporcionar un método rápido y eficiente en el trabajo de parto para aislar los hepatocitos primarios del ratón, sin poner en peligro la pureza y viabilidad de los hepatocitos primarios aislados.

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de Johns Hopkins. En este estudio se utilizaron ratones hembra C57BL/6 (8 semanas de edad).

1. Preparación:

1. Mezcle William's E Medium (suplemento GlutaMAX) con 10% de FBS y 1% de solución antibiótico-antimicótica para hacer el medio de cultivo.
2. Filtre 25 ml de medio colagenasa-dispasa (por ejemplo, Liver Digest Medium) a través de un filtro de jeringa de 0,45 μm para eliminar los restos de partículas.
3. Caliente 50 ml de H₂O de doble destilación (ddH₂O), 35 ml de medio de perfusión (por ejemplo, medio de perfusión hepática) (o 50 ml la primera vez que se utiliza este protocolo) y 25 ml de medio filtrado de colagenasa-dispasa en un baño de agua de 45 °C durante 30 min.
4. Dentro de una campana de cultivo de tejidos estériles, mezcle 2 ml de 10x HBSS y 18 mL de Percoll en un tubo de 50 mL para hacer 20 mL 1x Percoll-HBSS y mantener en hielo o 4 °C.
   NOTA: 1x Percoll-HBSS se puede mantener a 4 °C durante al menos 6 meses.
5. Dentro de una campana de cultivo de tejidos estériles, vierta 30 ml de medio de lavado (por ejemplo, hepatocyte Wash Medium) en una placa de Petri limpia y manténgalo en hielo.
6. Sumerja el tubo de bombeo en el agua de un baño de agua a 45 °C. Los resultados son más fiables si la temperatura ambiente está a 25 °C.
7. Preparar 2 ml de 1x anestésicos mezclando 225 μL de ketamina HCL, 93,75 μL de xilazina y 1681 μL de 1x PBS.
8. Anestesiar un ratón utilizando un método aprobado. Aquí el ratón fue inyectado intraperitonealmente con 150 μL de 1x anestésicos. Realice las pruebas para detectar la pérdida de reflejos, como la reacción al pellizco del dedo del pie para garantizar una anestesia completa.
9. Asegure el ratón en su espalda a la almohadilla de disección por cuatro extremidades, ya sea fijando o usando cinta impermeable u otros métodos aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la institución (o equivalentes).
10. Prepare pinzas y tijeras esterilizadas para la disección. Para evitar una posible contaminación, realice todos los pasos dentro de una campana estéril.

2. Procedimiento:

1. Usando una bomba peristáltica, comience a bombear ddH₂O calentado a una velocidad de 4 ml / min durante 5 minutos. Cambie el tubo de bombeo de agua a un medio de perfusión calentado.
2. Desinfecte el abdomen del ratón anestesiado con 70% de EtOH y ártelo con una tijera para exponer el hígado, la vena porta y la vena cava inferior (IVC).
3. Detenga la bomba peristáltica. Inserte un catéter de 24 G (por ejemplo, catéter IV cerrado, 24 G, 0,75 IN) en IVC. Comience a bombear y corte la vena porta abierta.
4. Continúe bombeando hasta que el líquido eliminado esté claro (alrededor de 3-5 min). Presione la vena porta cada minuto para dejar que el líquido llegue a cada rincón del hígado. Tenga cuidado de no dejar que las burbujas de aire entren en el IVC.
   NOTA: Este paso consiste en eliminar la mayor cantidad de sangre posible del hígado.
5. Cambie el tubo de bombeo del medio de perfusión al medio colagenasa-dispasa. Continúe bombeando hasta que los 25 ml del medio colagenasa-dispasa se agoten mientras realiza el paso 2.6.
6. Presione la vena porta cada minuto para dejar que el líquido llegue a cada rincón del hígado.
   NOTA: En esta etapa, la pérdida completa de sangre es fatal para el ratón. La muerte del ratón puede confirmarse por la falta de latidos del corazón después del experimento. Deseche el cadáver según las políticas de la instalación.
7. Aísle todo el hígado sin vesícula biliar al medio de lavado de 30 ml en la placa de Petri sobre hielo.
8. Romperlo en pedazos con fórceps para liberar hepatocitos primarios en solución. Este paso convertiría el medio de lavado en una solución turbia llena de hepatocitos primarios liberados y pequeños trozos de hígado.
9. Filtre la solución turbia en el paso 2.8 a través de un colador celular de 70 μm en el Percoll-HBSS de 20 ml 1x en un tubo de 50 ml sobre hielo. Mezclar invirtiendo el tubo 20 veces.
10. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 °C.
11. Dentro de la capucha de cultivo de tejidos, aspire el sobrenadante. Lavar el pellet con 30 mL de medio de lavado en frío.
12. Centrifugar a 50 x g durante 5 min a 4 °C.
13. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 25 ml del medio de cultivo (u otros volúmenes apropiados) dentro de la campana de cultivo de tejidos.
14. Cuente el número de células y platee las células en las placas de cultivo deseadas de acuerdo con el diseño experimental.
    NOTA: Los hepatocitos primarios correctamente aislados de un ratón de 8 semanas de edad suelen ser suficientes para ser chapados en cuatro placas de 6 pocillos o cuatro placas de 12 pocillos.

Para probar la eficiencia, el actual protocolo de aislamiento primario de hepatocitos se realizó en ratones C57BL/6 hembra de 8 semanas de edad. Se probó la unión y pureza de los hepatocitos primarios aislados. El aislamiento primario de hepatocitos se utiliza para una amplia variedad de experimentos sobre fisiología hepática, como los efectos de los fármacos hepáticos y el metabolismo de la glucosa, la actividad de biomarcadores farmacéuticos2, la sensibilidad a la insulina y la producción de glucosa. Por lo tanto, las actividades de los hepatocitos primarios aislados con este protocolo se probaron en los siguientes experimentos.

No se requirió recubrimiento para la fijación primaria de hepatocitos en el presente protocolo.
Los hepatocitos primarios aislados se enchaparon a 5 x 105 células/pozo en una placa de 6 pocillos. Después de 1 h, se observó una fijación firme, y los hepatocitos primarios se expandieron completamente 12 h después del recubrimiento (Figura 3). Esto indicó que 12 h después del recubrimiento, las células estaban listas para ser utilizadas en experimentos. Sobre la base de la morfología del núcleo de los hepatocitos de ratón dentro del hígado, los hepatocitos mononucleares se enriquecieron en los bordes, mientras que los hepatocitos binucleares / polinucleares, una firma de diferenciación terminal, estaban en el medio 3,4. Una cantidad significativa de células fotografiadas mostró la morfología típica de doble núcleo (diploide), lo que indica el éxito de aislar y purificar los hepatocitos primarios vivos. Esto también indica que el recubrimiento de colágeno no es un requisito para la unión primaria de hepatocitos con este protocolo.

La pureza se enriqueció en la población aislada de hepatocitos primarios
Se han utilizado varios marcadores genéticos específicos del tipo celular en protocolos anteriores para verificar la pureza de los hepatocitos primarios aislados (Tabla 1). TTR (Transthyretin), CD95 (Cluster of differentiation 95, también conocido como Fas), ASGR1 (Asialoglycoprotein receptor 1) y ASGR2 son marcadores de hepatocitos. Después del aislamiento, los niveles de ARNm de estos marcadores de hepatocitos aumentaron significativamente, en comparación con todo el hígado (Figura 4A-D, H).

Este protocolo también redujo en gran medida la interferencia de otras células hepáticas. La presencia de células inmunes, células estrelladas y células endoteliales fue menor, mostrada por la fuerte disminución de los niveles de ARNm de CD45 (marcador de células inmunes), COL1A1 (colágeno, tipo I, alfa 1, marcador de células estrelladas) y TIE2 (túnica interna quinasa de células endoteliales, marcador de células endoteliales), en comparación con todo el hígado (Figura 4E-H ). Estos sugieren que este protocolo podría purificar la población primaria de hepatocitos de las células hepáticas y así reducir la posible interferencia de otros tipos de células en los experimentos.

Se preservó la actividad de los biomarcadores farmacéuticos
Los biomarcadores en los hepatocitos se han utilizado ampliamente para la orientación y administración de fármacos. Por lo tanto, la preservación de la actividad de los biomarcadores farmacéuticos es un punto clave en el aislamiento primario de hepatocitos y es un estándar para probar la utilidad del aislamiento primario de hepatocitos2. Los marcadores de hepatocitos ASGR1 y ASGR2 se utilizan de esta manera2. Primero probamos el nivel de expresión de curso de tiempo de estos dos marcadores antes y después del recubrimiento primario de hepatocitos. Después del emplatado, su nivel de ARNm disminuyó considerablemente con el tiempo, pero los niveles se mantuvieron considerables en comparación con todo el hígado hasta el punto de tiempo de 12 h después del recubrimiento, especialmente para ASGR1 (Figura 5A, B). La tendencia de expresión fue consistente con un informe anterior2 e indicó una salud de hepatocitos primarios comparable. Varios patógenos se dirigen a CD81, una proteína unida a la membrana de hepatocitos, para facilitar su entrada en las células y la infección, como el virus de la hepatitis5, Plasmodium falciparum y Plasmodium yoelii6. Otras proteínas localizadas en la membrana de los hepatocitos, como TLR4 (Toll-like receptor 4), también son el objetivo de los patógenos e importantes para la respuesta inmune de los hepatocitos7. Después del recubrimiento, el nivel de expresión de CD81 fue consistente hasta 48 h (Figura 5C). El nivel de expresión de TLR4 generalmente aumentó, pero no hasta después de 48 h, cuando alcanzó un nivel superior al in vivo (Figura 5D). Estos sugieren que los hepatocitos primarios aislados por este protocolo también se pueden usar para estudios CD81 y TLR4 dentro de al menos 48 h después del recubrimiento. En conjunto, estos resultados indican que los hepatocitos primarios aislados son válidos para su uso en estudios relacionados con biomarcadores farmacéuticos. Vale la pena señalar que los niveles de ARN y proteína pueden ser inconsistentes debido a las influencias de las actividades post-transcripcionales como la migración de ARN inducida por péptidos señal, la modificación posttraduccional y / o la degradación de proteínas. Por lo tanto, la verificación del nivel de proteína y la bioactividad de los biomarcadores farmacéuticos identificados por el ARNm puede ser necesaria si así lo requiere el paradigma experimental.

Los hepatocitos primarios aislados eran sensibles a la insulina
También se analizó el rendimiento primario de los hepatocitos en experimentos de metabolismo de la glucosa. La insulina, una hormona que desempeña un papel central en el metabolismo de la glucosa, disminuye el nivel de glucosa, promoviendo la absorción y el almacenamiento de glucosa hepática a través de la fosforilación AKT y FOXO1 (Forkhead box O1). Por lo tanto, se realizó un ensayo de sensibilidad a la insulina con hepatocitos primarios aislados. Después de 16 h, las células se quedaron hambrientas durante 3 h, con un medio libre de suero. En las últimas 0,5 h de inanición, se administró insulina de 100 nM al medio de cultivo. Como se muestra en la Figura 6A-C, la insulina promovió significativamente la fosforilación tanto de AKT en Ser473 como de FOXO1 en Ser256, lo que indica la sensibilidad de los hepatocitos primarios a la insulina. Esto sugiere que los hepatocitos primarios aislados del presente protocolo son útiles en estudios de metabolismo de insulina/glucosa.

Los hepatocitos primarios aislados fueron capaces de producir glucosa
No solo son un centro de almacenamiento de glucosa, sino que los hepatocitos también son responsables de la producción de glucosa. Para probar si los hepatocitos primarios que aislamos son útiles en estudios de producción de glucosa, las células se quedaron hambrientas durante 10 h en presencia de glucagón para estimular la producción de glucosa. El medio de inanición se recolectó para el ensayo de glucosa, mientras que las células se recolectaron para western blot. La fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PEPCK) es un componente esencial en la producción de glucosa hepática, controlando su tasa8. El nivel de proteína de PEPCK aumentó significativamente después del tratamiento con glucagón, lo que sugiere que la vía de producción de glucosa se activó (Figura 7A, B). Esta activación se confirmó aún más por un mayor nivel de producción de glucosa (Figura 7C). Este fenómeno también se confirmó con otros estimuladores de la producción de glucosa como la forskolina más IBMX (Figura 7A-C). Sin embargo, debido a la limitación de este experimento, no pudimos verificar si la producción de glucosa era exclusiva a través de la gluconeogénesis o si también hay un componente de la glucogenólisis.

Figura 1: Configuración del banco. (A) La configuración del banco para el aislamiento primario de hepatocitos. (B) La configuración del banco caricaturesco para el aislamiento primario de hepatocitos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Disección de ratones, perfusión y purificación primaria de hepatocitos. (A) El ratón diseccionado, con flechas apuntando al hígado, IVC y vena porta. (B) Inserción del catéter en IVC. (C) Presionar la vena porta causando agrandamiento y rigidez de los lópes hepáticos, lo que indica una perfusión exitosa. (D) Lópes hepáticos suavizados después de la perfusión, lo que indica el éxito de la digestión de la colagenasa. (E) La posición de la vesícula biliar en el hígado aislado (flecha que apunta a la vesícula biliar). (F) Extirpación de la vesícula biliar. (G) Hígado desgarrado en medio de lavado de hepatocitos. (H) Mezclar 1x Percoll-HBSS con hepatocito primario filtrado antes de la centrífuga. (I, J) pellet primario de hepatocitos después de la centrífuga. (K) Resuspensión primaria de hepatocitos dentro del medio de lavado de hepatocitos. (L, M) El pellet de hepatocitos primarios se formó dentro del medio de lavado de hepatocitos después de la centrífuga. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Hepatocitos primarios después del emplatado. Las imágenes se tomaron después de (A)1 h, (B, C) 12 h, (D) 24 h, (E) 36 h, (F) 48 h, (G) 72 h y (H) 96 h de recubrimiento primario de hepatocitos. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Mejora de la pureza de los hepatocitos primarios después del aislamiento. El ARN se aisló antes (de todo el hígado) y después (de hepatocitos primarios aislados) del aislamiento primario de hepatocitos, seguido de PCR de transcripción inversa, según un protocolo previo9. La pureza primaria de los hepatocitos se evaluó mediante PCR en tiempo real con cebadores para marcadores de hepatocitos (A) TTR, (B) CD95, (C) ASGR1 y (D) ASGR2, mientras que también con marcador de células inmunes (E) CD45, (F) marcador de células estrelladas COL1A1 y (G) marcador de células endoteliales TIE2. (H) Se generó un mapa de calor para los cambios de expresión de los marcadores de tipo celular antes y después del aislamiento primario de hepatocitos. GapDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) se utilizó como control interno. Los cebadores utilizados aquí fueron para genes (las secuencias de cebadores se encuentran en la Tabla 2. Las referencias de secuencia se citan aquí): TTR10; CD9511; ASGR112; ASGR213; CD4514; COL1A115; TIE216; GAPDH17. Los gráficos y el mapa de calor se generaron con GraphPad Prism 8. La barra de error indica desviación estándar, y la significación de la prueba t de dos colas no apareada (ya que las muestras primarias de hepatocitos e hígado entero no se aparearon porque este protocolo requiere hígado intacto para empezar) la significación de la prueba t se indica con asteriscos (* p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001). N=7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Expresión de biomarcadores farmacéuticos. El ARN se aisló de todo el hígado y el hepatocito primario después del recubrimiento, seguido de PCR de transcripción inversa. La expresión de biomarcadores farmacéuticos se evaluó mediante PCR en tiempo real con cebadores para (A) ASGR1, (B) ASGR2, (C) CD81 y (D) TLR4. GAPDH se utilizó como control interno. Los nuevos cebadores utilizados aquí fueron para genes (las secuencias de cebadores se encuentran en la Tabla 2. Las referencias de secuencia se citan aquí): CD8118; TLR419. Los gráficos se generaron con GraphPad Prism 8. N = 5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Sensibilidad a la insulina preservada después del aislamiento primario de hepatocitos. (A) Western blot de p-AKT (S473), AKT, p-FOXO1 (S256), FOXO1 y GAPDH después del tratamiento con insulina. (B) p-AKT (S473)/AKT en densitometría de western blot. (C) p-FOXO1 (S256)/FOXO1 en densitometría de western blot. El ensayo de sensibilidad a la insulina se llevó a cabo 16 h después del recubrimiento primario de hepatocitos. Los hepatocitos primarios se murieron de hambre durante 3 h en William's E Medium (GlutaMAX Supplement) sin FBS pero con solución antibiótica-antimicótica al 1% y con tratamiento con insulina de 100 nM en los últimos 30 min, antes de ser cosechados para la lisis proteica con 1x tampón RIPA. Los gráficos se generaron con GraphPad Prism 8. La imagen de Western blot se llevó a cabo con LI-COR Odyssey CLx. La barra de error indica desviación estándar, y la significación de la prueba t pareada de dos colas se indica con asteriscos (* p < 0.05; ** p < 0.01). N = 4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Ensayo de producción de glucosa. (A) Western blot de PEPCK y GAPDH después del tratamiento con glucagón o forskolina+IBMX durante 10 h. (B) Densitometría del nivel de proteína PEPCK en comparación con GAPDH después del tratamiento con glucagón o forskolina+IBMX durante 10 h. (C) Nivel de glucosa en comparación con el nivel de proteína después del tratamiento con glucagón o forskolina+IBMX durante 10 h. El ensayo de producción de glucosa se llevó a cabo 16 h después del recubrimiento primario de hepatocitos. Los hepatocitos primarios se sintieron hambrientos durante 10 h en DMEM libre de rojo de glucosa y fenol (agregado con 2 mM L-Glutamina, 2 mM piruvato de sodio, 20 mM L-lactato de sodio, 1% Pen Strep), con glucagón de 50nM o 20 μM de forskolina y 200 μM de IBMX. El medio se cosechó para la medición de la concentración de glucosa con Glucose Assay Kit, mientras que la proteína se cosechó para Western Blot. La imagen de Western blot se llevó a cabo con LI-COR Odyssey CLx. La barra de error indica desviación estándar, y la significación de la prueba t pareada de dos colas se indica con asteriscos (* p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001). N = 4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Comparación de protocolos primarios de hepatocitos.

Tabla 2: Lista de cebadores: Cebadores utilizados para los genes TTR, CD95, ASGR1, ASGR2, CD45, COL1A1, TIE2, GAPDH, CD81 y TLR4

Los autores no tienen nada que revelar.