Un protocolo mejorado de tiempo y mano de obra eficiente para el aislamiento de hepatocitos primarios en ratones

Summary

Los hepatocitos primarios son una herramienta valiosa para estudiar la respuesta hepática y el metabolismo in vitro. Utilizando reactivos disponibles comercialmente, se desarrolló un protocolo mejorado de tiempo y mano de obra eficiente para el aislamiento de hepatocitos primarios de ratón.

Abstract

Los hepatocitos primarios se utilizan ampliamente en la investigación in vitro del hígado, especialmente en estudios de metabolismo de la glucosa. Se ha adaptado una técnica base en función de diferentes necesidades, como el tiempo, la mano de obra, el costo y el uso de hepatocitos primarios, lo que resulta en varios protocolos de aislamiento de hepatocitos primarios. Sin embargo, los numerosos pasos y las preparaciones de reactivos que consumen mucho tiempo en el aislamiento primario de hepatocitos son inconvenientes importantes para la eficiencia. Después de comparar diferentes protocolos por sus pros y sus contras, se combinaron las ventajas de cada uno, y se formuló un protocolo de aislamiento de hepatocitos primarios rápido y eficiente. En solo ~ 35 minutos, este protocolo podría producir tanto, si no más, hepatocitos primarios sanos como otros protocolos. Además, los experimentos de metabolismo de la glucosa realizados utilizando los hepatocitos primarios aislados validaron la utilidad de este protocolo en estudios in vitro de metabolismo hepático. También revisamos y analizamos ampliamente la importancia y el propósito de cada paso en este estudio para que los futuros investigadores puedan optimizar aún más este protocolo en función de las necesidades.

Introduction

El hígado sirve como uno de los órganos más importantes en el cuerpo de los vertebrados debido al papel vital que desempeña en numerosas funciones de soporte vital como la digestión de alimentos, la circulación sanguínea y la desintoxicación. El uso del cultivo in vitro de hepatocitos primarios de ratón es cada vez más popular en estudios sobre el metabolismo de los carbohidratos y el carcinoma hepático. Por lo tanto, es importante desarrollar un método conveniente para el aislamiento de hepatocitos primarios de ratón mientras se mantiene su función fisiológica innata. Debido a su función como un centro del metabolismo de la glucosa, el hígado también es fund....

Protocol

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de Johns Hopkins. En este estudio se utilizaron ratones hembra C57BL/6 (8 semanas de edad).

1. Preparación:

1. Mezcle William's E Medium (suplemento GlutaMAX) con 10% de FBS y 1% de solución antibiótico-antimicótica para hacer el medio de cultivo.
2. Filtre 25 ml de medio colagenasa-dispasa (por ejemplo, Liver Digest Medium) a través de un filtro de jeringa de 0,45 μm para eliminar los restos de partículas.
3. Caliente 50 ml de H₂O de doble destilación (ddH₂O), 35 ml de medio de perfusión (por ejem....

Results

Para probar la eficiencia, el actual protocolo de aislamiento primario de hepatocitos se realizó en ratones C57BL/6 hembra de 8 semanas de edad. Se probó la unión y pureza de los hepatocitos primarios aislados. El aislamiento primario de hepatocitos se utiliza para una amplia variedad de experimentos sobre fisiología hepática, como los efectos de los fármacos hepáticos y el metabolismo de la glucosa, la actividad de biomarcadores farmacéuticos², la sensibilidad a la insulina y la producción de glu.......

Discussion

Se han desarrollado varios protocolos de aislamiento de hepatocitos primarios. También se han mantenido optimizados y adaptados en función de las diferentes necesidades (Tabla 1). Los protocolos de aislamiento generalmente se componen de dos partes: perfusión (incluida la digestión enzimática) y purificación.

La perfusión se puede realizar con todo el hígado in vivo 2,20,21,22,23 o con lóbulos hepáticos diseca.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Gibco	10010023
10x HBSS	Gibco	14065-056
Placa de 12 pocillos	FALCON		353043 Recubrimiento no requerido
Placa de 6 pocillos	FALCON		353046 Recubrimiento no requerido
anti-AKT	Cell Signaling	2920S
Solución antibiótica antibiótica (100x), estabilizada	Sigma-Aldrich	A5955
anti-FOXO1	Señalización	97635S
Señalización celular	anti-GAPDH	2118S
anti-p-AKT (S473)	Señalización celular	9271L
anti-PEPCK	Santa Cruz	SC-166778
anti-p-FOXO1 (S256)	Señalización celular	84192S Filtro celular
, 70 y micro; m	CELLTREAT	229483
Catéter IV Cerrado, Calibre 24 0.75 IN	Becton Dickinson	383511
DMEM, sin glucosa, sin glutamina, sin rojo de fenol	ThermoFisher Scientific	A1443001
EnzyChrom Kit de ensayo de glucosa	BioAssay Systems	EBGL-100
Suero fetal bovino (FBS)	Hyclone	SH30071.03
Forskolina	MilliporeSigma	F3917-10MG
Glucagón	Sigma-Aldrich	G2044
Cabra Anti-ratón IgG Anticuerpo Secundario	LI-COR	926-68070
Cabra Anti-conejo Anticuerpo Secundario IgG	LI-COR	926-32211
GraphPad Prisma 8	GraphPad Software	NA
Hepatocitos Medio de lavado	Gibco	17704-024
IBMX	Señalización celular	13630S
Insulina		Lilly NDC 0002-8215-01
Ketamina HCL (100 mg/mL)	Hospira Inc	NDC 0409-2051-05
L-Glutamina	Gibco	25030081
Medio de digestión hepática	Gibco	17703-034	Alícuota dentro de la campana de cultivo de tejidos a 25 mL cada uno en tubo de 50 mL, y manténgalo en -20 ° C
congelador Medio de perfusión hepática	Gibco	17701-038
Pluma Estreptococo	Gibco	15140122
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
Bomba peristáltica	Gilson	Minipuls 2	Capaz de bombear a 4 mL/min Placa de
Petri	Fisherbrand	08-757-12
Centrífuga	refrigeradaSorvall	Legend RT	Capaz de centrifugar tubo de 50 mL a 4 & grados; C
L-lactato de sodio	Sigma-Aldrich	L7022
Piruvato de sodio	Gibco	11360070
Filtro de jeringa, PVDF 0.45 y micro; m 30 mm de diámetro	Jeringa de	229745
, 0,5 mL	329461		Becton Dickinson
, 60 mL	Becton Dickinson	309653
Solución de Azul de Tripano, 0,4%	Tubo de 15250061
, 15 mL	de 430052		Corning
, 50 mL	Corning	430290
Agua Tanque de baño	Corning	CLS6783	O cualquier tanque de baño de agua capaz de calentar hasta 45 & grados; C
Guillermo' s E Medio (Suplemento GlutaMAX)	Gibco	32551020
Xilozina (100 mg/mL)	Vetone Anased LA	NDC13985-704-10