Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Un protocolo mejorado de tiempo y mano de obra eficiente para el aislamiento de hepatocitos primarios en ratones

11.7K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/61812

⸱

25 de octubre de 2021

 ,  , 
1Department of Pediatrics, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Physiology, Temple University School of Medicine, 3Department of Pediatrics, Seattle Children’s Hospital

En este artículo

Resumen

Los hepatocitos primarios son una herramienta valiosa para estudiar la respuesta hepática y el metabolismo in vitro. Utilizando reactivos disponibles comercialmente, se desarrolló un protocolo mejorado de tiempo y mano de obra eficiente para el aislamiento de hepatocitos primarios de ratón.

Resumen

Los hepatocitos primarios se utilizan ampliamente en la investigación in vitro del hígado, especialmente en estudios de metabolismo de la glucosa. Se ha adaptado una técnica base en función de diferentes necesidades, como el tiempo, la mano de obra, el costo y el uso de hepatocitos primarios, lo que resulta en varios protocolos de aislamiento de hepatocitos primarios. Sin embargo, los numerosos pasos y las preparaciones de reactivos que consumen mucho tiempo en el aislamiento primario de hepatocitos son inconvenientes importantes para la eficiencia. Después de comparar diferentes protocolos por sus pros y sus contras, se combinaron las ventajas de cada uno, y se formuló un protocolo de aislamiento de hepatocitos primarios rápido y eficiente. En solo ~ 35 minutos, este protocolo podría producir tanto, si no más, hepatocitos primarios sanos como otros protocolos. Además, los experimentos de metabolismo de la glucosa realizados utilizando los hepatocitos primarios aislados validaron la utilidad de este protocolo en estudios in vitro de metabolismo hepático. También revisamos y analizamos ampliamente la importancia y el propósito de cada paso en este estudio para que los futuros investigadores puedan optimizar aún más este protocolo en función de las necesidades.

Introducción

El hígado sirve como uno de los órganos más importantes en el cuerpo de los vertebrados debido al papel vital que desempeña en numerosas funciones de soporte vital como la digestión de alimentos, la circulación sanguínea y la desintoxicación. El uso del cultivo in vitro de hepatocitos primarios de ratón es cada vez más popular en estudios sobre el metabolismo de los carbohidratos y el carcinoma hepático. Por lo tanto, es importante desarrollar un método conveniente para el aislamiento de hepatocitos primarios de ratón mientras se mantiene su función fisiológica innata. Debido a su función como un centro del metabolismo de la glucosa, el hígado también es fundamental para la producción y el almacenamiento de glucosa1. Los experimentos con hepatocitos primarios in vitro son imprescindibles para la mayoría de los estudios del metabolismo de la glucosa. Por lo tanto, durante años, varios grupos de investigación han desarrollado protocolos para el aislamiento de hepatocitos primarios en ratones.

El procedimiento general del aislamiento de hepatocitos de ratón es primero eliminar la sangre en el hígado con un líquido isosmótico como solución salina tamponada con fosfato (PBS) o solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) y luego usar solución que contiene colagenasa para disociar los hepatocitos. Estos protocolos comparten un procedimiento general, pero difieren en reactivos y pasos en función de las diferentes necesidades. Sin embargo, la preparación de los reactivos necesarios y la realización de pasos de aislamiento llevan tiempo. En el desarrollo del presente protocolo, se estableció la eficiencia como una prioridad, con todos los reactivos listos para usar y disponibles en el mercado, y la menor cantidad de pasos posible. El objetivo general de este protocolo es proporcionar un método rápido y eficiente en el trabajo de parto para aislar los hepatocitos primarios del ratón, sin poner en peligro la pureza y viabilidad de los hepatocitos primarios aislados.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de Johns Hopkins. En este estudio se utilizaron ratones hembra C57BL/6 (8 semanas de edad).

1. Preparación:

  1. Mezcle William's E Medium (suplemento GlutaMAX) con 10% de FBS y 1% de solución antibiótico-antimicótica para hacer el medio de cultivo.
  2. Filtre 25 ml de medio colagenasa-dispasa (por ejemplo, Liver Digest Medium) a través de un filtro de jeringa de 0,45 μm para eliminar los restos de partículas.
  3. Caliente 50 ml de H2O de doble destilación (ddH2O), 35 ml de medio de perfusión (por ejemplo, medio de perfusión hepática) (o 50 ml la primera vez que se utiliza este protocolo) y 25 ml de medio filtrado de colagenasa-dispasa en un baño de agua de 45 °C durante 30 min.
  4. Dentro de una campana de cultivo de tejidos estériles, mezcle 2 ml de 10x HBSS y 18 mL de Percoll en un tubo de 50 mL para hacer 20 mL 1x Percoll-HBSS y mantener en hielo o 4 °C.
    NOTA: 1x Percoll-HBSS se puede mantener a 4 °C durante al menos 6 meses.
  5. Dentro de una campana de cultivo de tejidos estériles, vierta 30 ml de medio de lavado (por ejemplo, hepatocyte Wash Medium) en una placa de Petri limpia y manténgalo en hielo.
  6. Sumerja el tubo de bombeo en el agua de un baño de agua a 45 °C. Los resultados son más fiables si la temperatura ambiente está a 25 °C.
  7. Preparar 2 ml de 1x anestésicos mezclando 225 μL de ketamina HCL, 93,75 μL de xilazina y 1681 μL de 1x PBS.
  8. Anestesiar un ratón utilizando un método aprobado. Aquí el ratón fue inyectado intraperitonealmente con 150 μL de 1x anestésicos. Realice las pruebas para detectar la pérdida de reflejos, como la reacción al pellizco del dedo del pie para garantizar una anestesia completa.
  9. Asegure el ratón en su espalda a la almohadilla de disección por cuatro extremidades, ya sea fijando o usando cinta impermeable u otros métodos aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la institución (o equivalentes).
  10. Prepare pinzas y tijeras esterilizadas para la disección. Para evitar una posible contaminación, realice todos los pasos dentro de una campana estéril.

2. Procedimiento:

  1. Usando una bomba peristáltica, comience a bombear ddH2O calentado a una velocidad de 4 ml / min durante 5 minutos. Cambie el tubo de bombeo de agua a un medio de perfusión calentado.
  2. Desinfecte el abdomen del ratón anestesiado con 70% de EtOH y ártelo con una tijera para exponer el hígado, la vena porta y la vena cava inferior (IVC).
  3. Detenga la bomba peristáltica. Inserte un catéter de 24 G (por ejemplo, catéter IV cerrado, 24 G, 0,75 IN) en IVC. Comience a bombear y corte la vena porta abierta.
  4. Continúe bombeando hasta que el líquido eliminado esté claro (alrededor de 3-5 min). Presione la vena porta cada minuto para dejar que el líquido llegue a cada rincón del hígado. Tenga cuidado de no dejar que las burbujas de aire entren en el IVC.
    NOTA: Este paso consiste en eliminar la mayor cantidad de sangre posible del hígado.
  5. Cambie el tubo de bombeo del medio de perfusión al medio colagenasa-dispasa. Continúe bombeando hasta que los 25 ml del medio colagenasa-dispasa se agoten mientras realiza el paso 2.6.
  6. Presione la vena porta cada minuto para dejar que el líquido llegue a cada rincón del hígado.
    NOTA: En esta etapa, la pérdida completa de sangre es fatal para el ratón. La muerte del ratón puede confirmarse por la falta de latidos del corazón después del experimento. Deseche el cadáver según las políticas de la instalación.
  7. Aísle todo el hígado sin vesícula biliar al medio de lavado de 30 ml en la placa de Petri sobre hielo.
  8. Romperlo en pedazos con fórceps para liberar hepatocitos primarios en solución. Este paso convertiría el medio de lavado en una solución turbia llena de hepatocitos primarios liberados y pequeños trozos de hígado.
  9. Filtre la solución turbia en el paso 2.8 a través de un colador celular de 70 μm en el Percoll-HBSS de 20 ml 1x en un tubo de 50 ml sobre hielo. Mezclar invirtiendo el tubo 20 veces.
  10. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 °C.
  11. Dentro de la capucha de cultivo de tejidos, aspire el sobrenadante. Lavar el pellet con 30 mL de medio de lavado en frío.
  12. Centrifugar a 50 x g durante 5 min a 4 °C.
  13. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 25 ml del medio de cultivo (u otros volúmenes apropiados) dentro de la campana de cultivo de tejidos.
  14. Cuente el número de células y platee las células en las placas de cultivo deseadas de acuerdo con el diseño experimental.
    NOTA: Los hepatocitos primarios correctamente aislados de un ratón de 8 semanas de edad suelen ser suficientes para ser chapados en cuatro placas de 6 pocillos o cuatro placas de 12 pocillos.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Para probar la eficiencia, el actual protocolo de aislamiento primario de hepatocitos se realizó en ratones C57BL/6 hembra de 8 semanas de edad. Se probó la unión y pureza de los hepatocitos primarios aislados. El aislamiento primario de hepatocitos se utiliza para una amplia variedad de experimentos sobre fisiología hepática, como los efectos de los fármacos hepáticos y el metabolismo de la glucosa, la actividad de biomarcadores farmacéuticos2, la sensibilidad a la insulina y la producción de glu...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

Se han desarrollado varios protocolos de aislamiento de hepatocitos primarios. También se han mantenido optimizados y adaptados en función de las diferentes necesidades (Tabla 1). Los protocolos de aislamiento generalmente se componen de dos partes: perfusión (incluida la digestión enzimática) y purificación.

La perfusión se puede realizar con todo el hígado in vivo 2,20,21,22,23 o con lóbulos hepáticos diseca...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (Subvención 5R01HD095512-02 a S.W.).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1x PBSGibco10010023
10x HBSSGibco14065-056
Placa de 12 pocillosFALCON353043 Recubrimiento no requerido
Placa de 6 pocillosFALCON353046 Recubrimiento no requerido
anti-AKTCell Signaling2920S
Solución antibiótica antibiótica (100x), estabilizadaSigma-AldrichA5955
anti-FOXO1Señalización97635S
Señalización celularanti-GAPDH2118S
anti-p-AKT (S473)Señalización celular9271L
anti-PEPCKSanta CruzSC-166778
anti-p-FOXO1 (S256)Señalización celular84192S Filtro celular
, 70 y micro; mCELLTREAT229483
Catéter IV Cerrado, Calibre 24 0.75 INBecton Dickinson383511
DMEM, sin glucosa, sin glutamina, sin rojo de fenolThermoFisher ScientificA1443001
EnzyChrom Kit de ensayo de glucosaBioAssay SystemsEBGL-100
Suero fetal bovino (FBS)HycloneSH30071.03
ForskolinaMilliporeSigmaF3917-10MG
GlucagónSigma-AldrichG2044
Cabra Anti-ratón IgG Anticuerpo SecundarioLI-COR926-68070
Cabra Anti-conejo Anticuerpo Secundario IgGLI-COR926-32211
GraphPad Prisma 8GraphPad SoftwareNA
Hepatocitos Medio de lavadoGibco17704-024
IBMXSeñalización celular13630S
InsulinaLilly NDC 0002-8215-01
Ketamina HCL (100 mg/mL)Hospira IncNDC 0409-2051-05
L-GlutaminaGibco25030081
Medio de digestión hepáticaGibco17703-034Alícuota dentro de la campana de cultivo de tejidos a 25 mL cada uno en tubo de 50 mL, y manténgalo en -20 ° C
congelador Medio de perfusión hepáticaGibco17701-038
Pluma EstreptococoGibco15140122
PercollGE Healthcare17-0891-01
Bomba peristálticaGilsonMinipuls 2Capaz de bombear a 4 mL/min Placa de
PetriFisherbrand08-757-12
CentrífugarefrigeradaSorvallLegend RTCapaz de centrifugar tubo de 50 mL a 4 & grados; C
L-lactato de sodioSigma-AldrichL7022
Piruvato de sodioGibco11360070
Filtro de jeringa, PVDF 0.45 y micro; m 30 mm de diámetroJeringa de229745
, 0,5 mL329461Becton Dickinson
, 60 mLBecton Dickinson309653
Solución de Azul de Tripano, 0,4%Tubo de 15250061
, 15 mLde 430052Corning
, 50 mLCorning430290
Agua Tanque de bañoCorningCLS6783O cualquier tanque de baño de agua capaz de calentar hasta 45 & grados; C
Guillermo' s E Medio (Suplemento GlutaMAX)Gibco32551020
Xilozina (100 mg/mL)Vetone Anased LANDC13985-704-10
celular CELLTREAT Jeringa Gibco Tubo

Referencias

  1. Han, H. S., Kang, G., Kim, J. S., Choi, B. H., Koo, S. H. Regulation of glucose metabolism from a liver-centric perspective. Experimental and Molecular Medicine. 48, 218(2016).
  2. Severgnini, M., et al. A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development. Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).
  3. Guidotti, J. E., et al. Liver cell polyploidization: a pivotal role for binuclear hepatocytes. Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).
  4. Morales-Navarrete, H., et al. A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture. Elife. 4, 11214(2015).
  5. Bruening, J., et al. Hepatitis C virus enters liver cells using the CD81 receptor complex proteins calpain-5 and CBLB. PLoS Pathogens. 14 (7), 1007111(2018).
  6. Silvie, O., et al. Hepatocyte CD81 is required for Plasmodium falciparum and Plasmodium yoelii sporozoite infectivity. Nature Medicine. 9 (1), 93-96 (2003).
  7. Crispe, I. N. Hepatocytes as immunological agents. Journal of Immunology. 196 (1), 17-21 (2016).
  8. Liu, N. C., et al. Loss of TR4 orphan nuclear receptor reduces phosphoenolpyruvate carboxykinase-mediated gluconeogenesis. Diabetes. 56 (12), 2901-2909 (2007).
  9. Wang, Z., et al. Gonadotrope androgen receptor mediates pituitary responsiveness to hormones and androgen-induced subfertility. JCI Insight. 5 (17), 127817(2019).
  10. Santos, S. D., et al. CSF transthyretin neuroprotection in a mouse model of brain ischemia. Journal of Neurochemistry. 115 (6), 1434-1444 (2010).
  11. Pinhu, L., et al. Overexpression of Fas and FasL is associated with infectious complications and severity of experimental severe acute pancreatitis by promoting apoptosis of lymphocytes. Inflammation. 37 (4), 1202-1212 (2014).
  12. Mi, Y., Lin, A., Fiete, D., Steirer, L., Baenziger, J. U. Modulation of mannose and asialoglycoprotein receptor expression determines glycoprotein hormone half-life at critical points in the reproductive cycle. Journal of Biological Chemistry. 289 (17), 12157-12167 (2014).
  13. Tanowitz, M., et al. Asialoglycoprotein receptor 1 mediates productive uptake of N-acetylgalactosamine-conjugated and unconjugated phosphorothioate antisense oligonucleotides into liver hepatocytes. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12388-12400 (2017).
  14. Manczak, M., et al. Neutralization of granulocyte macrophage colony-stimulating factor decreases amyloid beta 1-42 and suppresses microglial activity in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Human Molecular Genetics. 18 (20), 3876-3893 (2009).
  15. Zhang, Y., et al. JAK1-dependent transphosphorylation of JAK2 limits the antifibrotic effects of selective JAK2 inhibitors on long-term treatment. Annals of the Rheumatic Diseases. 76 (8), 1467-1475 (2017).
  16. Shih, S. C., et al. Molecular profiling of angiogenesis markers. American Journal of Pathology. 161 (1), 35-41 (2002).
  17. Liu, G., et al. miR-147, a microRNA that is induced upon Toll-like receptor stimulation, regulates murine macrophage inflammatory responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15819-15824 (2009).
  18. Ding, Q., et al. Mice expressing minimally humanized CD81 and occludin genes support Hepatitis C virus uptake in vivo. Journal of Virology. 91 (4), 01799(2017).
  19. Renshaw, M., et al. Cutting edge: impaired Toll-like receptor expression and function in aging. Journal of Immunology. 169 (9), 4697-4701 (2002).
  20. Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
  21. Salem, E. S. B., et al. Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323(2018).
  22. Cabral, F., et al. Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993(2018).
  23. Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507(2019).
  24. Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies. Malar Journal. 6, 169(2007).
  25. Yin, Z., Ellis, E. C., Nowak, G. Isolation of mouse hepatocytes for transplantation: a comparison between antegrade and retrograde liver perfusion. Cell Transplant. 16 (8), 859-865 (2007).
  26. Hepatocyte media, Thermofisher. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/Hepatocyte_Media_UG.pdf (2021).
  27. Sia, D., Villanueva, A., Friedman, S. L., Llovet, J. M. Liver cancer cell of origin, molecular class, and effects on patient prognosis. Gastroenterology. 152 (4), 745-761 (2017).
  28. Freitas-Lopes, M. A., Mafra, K., David, B. A., Carvalho-Gontijo, R., Menezes, G. B. Differential location and distribution of hepatic immune cells. Cells. 6 (4), 48(2017).
  29. Schachtrup, C., Le Moan, N., Passino, M. A., Akassoglou, K. Hepatic stellate cells and astrocytes: Stars of scar formation and tissue repair. Cell Cycle. 10 (11), 1764-1771 (2011).
  30. Geerts, A. History, heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells. Seminars in Liver Disease. 21 (3), 311-335 (2001).
  31. Poisson, J., et al. Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases. Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).
  32. Peter, M. E., et al. The CD95 receptor: apoptosis revisited. Cell. 129 (3), 447-450 (2007).
  33. Peters, D. T., et al. Asialoglycoprotein receptor 1 is a specific cell-surface marker for isolating hepatocytes derived from human pluripotent stem cells. Development. 143 (9), 1475-1481 (2016).
  34. Willoughby, J. L. S., et al. Evaluation of GalNAc-siRNA conjugate activity in pre-clinical animal models with reduced asialoglycoprotein receptor expression. Molecular Therapy. 26 (1), 105-114 (2018).
  35. Hutchins, N. A., Chung, C. S., Borgerding, J. N., Ayala, C. A., Ayala, A. Kupffer cells protect liver sinusoidal endothelial cells from Fas-dependent apoptosis in sepsis by down-regulating gp130. American Journal of Pathology. 182 (3), 742-754 (2013).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Explorar más artículos

Perfusión mediante bomba peristálticadigestión con colagenasa y dispasafiltración con tamiz celularlavado por centrifugaciónanálisis de marcadores de hepatocitosensayos de metabolismo de la glucosapruebas de sensibilidad a la insulinaprotocolo eficiente en tiempométodo optimizado para el operador
Un protocolo mejorado de tiempo y mano de obra eficiente para el aislamiento de hepatocitos primarios en ratones
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Términos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.