Artículo de método

Un método de seccionamiento simple y seco para obtener la sección de resina de tamaño de semilla completa y sus aplicaciones

DOI:

10.3791/61822

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23 de enero de 2021

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1Key Laboratory of Crop Genetics and Physiology of Jiangsu Province/Jiangsu Key Laboratory of Crop Genomics and Molecular Breeding, Yangzhou University, 2Co-Innovation Center for Modern Production Technology of Grain Crops of Jiangsu Province/Joint International Research Laboratory of Agriculture & Agri-Product Safety of the Ministry of Education, Yangzhou University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Esta técnica permite la preparación rápida y sencilla de la sección de resina de tamaño de semilla entera para la observación y análisis de células, gránulos de almidón y cuerpos proteicos en diferentes regiones de la semilla.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La morfología, el tamaño y la cantidad de células, gránulos de almidón y cuerpos proteicos en semillas determinan el peso y la calidad de las semillas. Son significativamente diferentes entre las diferentes regiones de semillas. Con el fin de ver claramente las morfologías de las células, gránulos de almidón y cuerpos proteicos, y analizar cuantitativamente sus parámetros morfológicos con precisión, se necesita la sección de tamaño de semilla completa. Aunque la sección de parafina de tamaño de semilla entera puede investigar la acumulación de materiales de almacenamiento en semillas, es muy difícil analizar cuantitativamente los parámetros morfológicos de las células y materiales de almacenamiento debido a la baja resolución de la sección gruesa. La sección de resina delgada tiene alta resolución, pero el método de seccionamiento rutinario de resina no es adecuado para preparar la sección de tamaño de semilla entera de semillas maduras con un gran volumen y alto contenido de almidón. En este estudio, presentamos un método de seccionamiento seco simple para preparar la sección de resina de tamaño de semilla completa. La técnica puede preparar las secciones transversales y longitudinales de tamaño integral de semillas en desarrollo, maduras, germinadas y cocidas incrustadas en resina LR White, incluso para semillas grandes con alto contenido de almidón. La sección de tamaño de semilla entera se puede teñir con brillo fluorescente 28, yodo y Coomassie azul brillante R250 para exhibir específicamente la morfología de células, gránulos de almidón y cuerpos proteicos claramente, respectivamente. La imagen obtenida también se puede analizar cuantitativamente para mostrar los parámetros morfológicos de las células, gránulos de almidón y cuerpos proteicos en diferentes regiones de semillas.

Introducción

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Las semillas vegetales contienen materiales de almacenamiento como almidón y proteínas y proporcionan energía y nutrición a las personas. La forma, el tamaño y la cantidad de los materiales celulares y de almacenamiento determinan el peso y la calidad de las semillas. Las células y materiales de almacenamiento en diferentes regiones de semillas tienen morfologías significativamente diferentes, especialmente para algunos cultivos de cereales de alta amilasa con inhibición de la enzima ramificada de almidón IIb1,2,3. Por lo tanto, es muy importante investigar las morfologías de las células y materiales de almacenamiento en diferentes regiones de semillas.

El seccionamiento de parafina es un buen método para preparar la sección de tamaño de semilla entera y puede exhibir la estructura tisular de la semilla y la acumulación de material de almacenamiento en diferentes regiones desemillas 4,5,6. Sin embargo, las secciones de parafina suelen tener un espesor de 6-8 m con baja resolución; por lo tanto, es muy difícil observar claramente y analizar cuantitativamente la morfología de los materiales celulares y de almacenamiento. Las secciones de resina suelen tener un espesor de 1-2 m y una alta resolución y son muy adecuadas para observar y analizar la morfología de los materiales celulares y de almacenamiento7. Sin embargo, el método de seccionamiento rutinario de resina tiene dificultades para preparar la sección de tamaño de semilla completa, especialmente para semillas con un gran volumen y alto contenido de almidón; por lo tanto, no hay manera de observar y analizar la morfología de las células y materiales de almacenamiento en diferentes regiones de la semilla. La resina LR White es una resina acrílica y exhibe baja viscosidad y fuerte permeabilidad, lo que lleva a sus buenas aplicaciones en la preparación de la sección de resina de semillas, especialmente para granos maduros de cereales con gran volumen y alto contenido de almidón. Además, la muestra incrustada en resina LR White se puede teñir fácilmente con muchos tintes químicos para exhibir claramente la morfología de las células y materiales de almacenamiento bajo el microscopio ligero o fluorescente7. En nuestro artículo anterior, hemos reportado un método de seccionamiento seco para preparar las secciones de tamaño de semilla entera de granos de cereales maduros incrustados en resina LR White. El método también puede preparar la sección de tamaño de semilla entera del grano de cereales en desarrollo, germinado y cocido8. La sección obtenida de tamaño de semilla entera tiene muchas aplicaciones en la observación y análisis de micromorfología, especialmente para ver y analizar cuantitativamente las diferencias morfológicas de los materiales celulares y de almacenamiento en diferentes regiones desemillas 8,9.

Esta técnica es adecuada para los investigadores que desean observar la microestructura del tejido y la forma y el tamaño de las células, gránulos de almidón y cuerpos proteicos en diferentes regiones de semillas utilizando microscopio de luz. Las imágenes de secciones de tamaño de semilla entera teñidas específicamente para exhibir células, gránulos de almidón y cuerpos proteicos pueden ser analizadas por un software de análisis morfológico para medir cuantitativamente los parámetros morfológicos de células, gránulos de almidón y cuerpos proteicos en diferentes regiones de semillas. Con el fin de demostrar la aplicabilidad técnica y las aplicaciones de sección de tamaño integral, hemos investigado las semillas maduras de maíz y colza y los granos de arroz en desarrollo, germinados y cocidos en este estudio. El protocolo contiene cuatro procesos. Aquí, utilizamos el grano de maíz maduro, que es el más difícil en la preparación de las secciones de tamaño de semilla entera debido al gran volumen y alto contenido de almidón, como una muestra para exhibir los procesos paso a paso.

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Protocolo

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1. Preparación de semillas incrustadas en resina (Figura 1)

  1. Fijar seis granos maduros de maíz en 10 ml de glutaraldehído con fosfato del 2,5% (0,1 M, pH7,2) a 4 oC durante 48 h. Los investigadores pueden elegir otras mezclas fijativas, concentraciones fijativas, y condiciones de fijación de acuerdo con sus objetivos de investigación y tipos de tejido.
  2. Saque los granos y los corte longitudinal o transversalmente a 2-3 mm de espesor utilizando una hoja afilada de doble cara, y fijelos en 10 ml de glutaraldehído con búfer de fosfato (0,1 M, pH 7,2) de nuevo durante 48 h.
  3. Lave las muestras tres veces con 10 ml de tampón de fosfato de 0,1 M (pH 7.2) durante 30 minutos cada vez.
  4. Deshidratar las muestras en grados crecientes de solución acuosa de etanol (10 ml) del 30% al 50%, 70%, 90% una vez y 100% tres veces durante 30 minutos cada vez.
  5. Infiltrar las muestras en grados de aumento de 10 ml de solución de resina LR White diluidas con etanol del 25% al 50%, 75% una vez y 100% dos veces a 4oC durante 12 horas cada vez.
  6. Prepare los pedestales para las muestras antes de incrustarlos. Añadir 0,25 ml de resina blanca 100% LR en un tubo centrífugo de 2 ml, y polimerizarlo a 60 oC durante 48 h.
  7. Añadir sucesivamente la resina blanca LR pura (0,5 ml) y la muestra infiltrada en el tubo de centrífuga con un pedestal. Enderezar las muestras con la aguja anatómica y polimerizarlas a 60oC en un horno durante 48 h.

2. Seccionamiento seco para la preparación de la sección de tamaño de semilla entera (Figura 1)

  1. Saque los granos incrustados del tubo de centrífuga y corte el exceso de resina alrededor de la muestra utilizando una cuchilla afilada.
  2. Sujete el bloque de resina en el soporte de muestra de ultramicrotoma (EM UC7), y recorte la resina superflua en la superficie de la muestra y alrededor de la muestra con una hoja.
  3. Pulir la superficie de la muestra finamente con un cuchillo de vidrio hasta que se pueda formar una sección completa.
  4. Coloque un pequeño gancho de cobre alrededor de 2 mm por encima del borde de la hoja antes de cortar y corte la muestra en una sección de 2 m. El papel del gancho es evitar el rizado hacia arriba de la sección.
  5. Coloque el gancho debajo de la sección para apoyarlo cuando la sección sea larga.
  6. Agregue 100 l de agua en un portaobjetos sin receta, y transfiera cuidadosamente la sección completa e ininterrumpida al agua con las pinzas.
  7. Con el fin de suavizar la sección arrugada, calentar y secar la muestra sobre la mesa aplanada a 50 oC durante la noche.
    1. Si la sección se desmorona o se desgarra, extienda el tiempo para cada infiltración de resina de la muestra de 12 h a 24 h o 48 h.
    2. Si la sección tiene algunas líneas paralelas al cuchillo, sujete firmemente el bloque de muestra. Si la sección tiene algunas líneas verticales al cuchillo, por favor use un cuchillo nuevo.

3. Tinción y observación de la sección

NOTA: Para observar la estructura tisular y morfología de las células, gránulos de almidón y cuerpos proteicos, manche las secciones con manchas específicas según el propósito de la investigación. Aquí, utilizamos el iluminador fluorescente 28, solución de yodo, y Coomassie azul brillante R250 para manchar las paredes celulares, gránulos de almidón y cuerpos proteicos, respectivamente.

  1. Para observar la morfología de las células, manchar la sección con 40 ml de 0,1% (p/v) de aclarador fluorescente 28 solución acuosa en un frasco de tinción de vidrio compacto de 70 ml a 45 oC durante 10 min, y luego enjuáguelo con agua corriente durante 5 min. Observe y fotografíe la sección bajo un microscopio de fluorescencia equipado con una cámara CCD.
  2. Para observar la morfología de los gránulos de almidón, manche la sección con 40 l de solución de yodo (0,07% (p/v) I2 y 0,14% (p/v) KI en 25% (v/v) glicerol) durante 1 min, y cubra la muestra que contiene solución de yodo con un cubreobjetos. Visuale y fotografíe la muestra bajo un microscopio de luz equipado con una cámara CCD.
  3. Para observar la morfología de los cuerpos proteicos, sumerja la sección con 40 ml de ácido acético al 10% (v/v) en un frasco de tinción de vidrio compacto de 70 ml durante 10 min a 45oC, y luego mancharlo en 40 mL de 1% (p/v) Coomassie brillante azul R250 en 25% (v/v) isopropanol y 10% (v/v) ácido acético durante 15 min a 45 oC. Lavar las secciones manchadas con agua corriente durante 5 min, y secar. Observe y fotografíe la sección bajo un microscopio de luz equipado con una cámara CCD.

4. Análisis cuantitativo de los parámetros morfológicos

  1. Procesar y analizar cuantitativamente las imágenes fotografiadas para el área, el eje largo/corto y la redondez de las células, gránulos de almidón y cuerpos proteicos en diferentes regiones de semillas utilizando software de análisis de morfología (software Image-Pro Plus 6.0) siguiendo exactamente los procedimientos de Zhao et al.9.

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Resultados

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Método de seccionamiento en seco simple para obtener una sección de tamaño de semilla completa
Establecemos un método de seccionamiento seco simple para preparar una sección de semillas de tamaño de semilla entera incrustada en resina LR-blanca (Figura 1). El método puede preparar secciones transversales y longitudinales de tamaño de semilla entera con espesor de 2 m(Figura 2-5, Figura Complementaria 1-4<...

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Discusión

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Las semillas son el recurso renovable más importante para alimentos, forraje y materia prima industrial, y son ricas en materiales de almacenamiento como el almidón y las proteínas. La morfología y cantidad de células y el contenido y configuración de los materiales de almacenamiento afectan al peso y la calidad de las semillas7,12. Aunque la estareología y la tecnología de análisis de imágenes pueden medir el tamaño y la cantidad de células en una región de teji...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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La financiación fue proporcionada por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32071927), el Proyecto de Talento de la Universidad de Yangzhou y el Desarrollo del Programa Académico Prioritario de las Instituciones de Educación Superior de Jiangsu.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Ácido acéticoSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
Tarro de vidrio compacto (5 plazas)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
Coomassie azul brillante R-250Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
CubreobjetosSangon Biotech (Shanghái) Co., Ltd.
Cuchilla de doble caraGillette Shanghai Co., Ltd.74-S
Absoluto de etanolSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
Mesa de aplanamientoLeicaHI1220
Microscopio de fluorescenciaOlympusBX60
Abrillantador fluorescente 28Sigma-Aldrich910090
Tiras de vidrioLeica840031
Solución de glutaraldehído al 50% en aguaSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
GlycerolSangon Biotech (Shanghái) Co., Ltd.
YodoSangon Biotech (Shanghái) Co., Ltd.
IsopropanolSangon Biotech (Shanghái) Co., Ltd.
MicroscopioOlympusBX53
LR Resina blancaAgar ScientificAGR1281A
OvenShanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co., Ltd.9023A
Yoduro de potasioSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
SlideSangon Biotech (Shanghái) Co., Ltd.
PinzasF518101 Sangon Biotech (Shanghái) Co., Ltd.
Fosfato de sodio dibásico dodecahidratoSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
Fosfato de sodio monobásico dihidratadoSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
UltramicrótomoLeicaEM UC7
A501931E678013A100472F518211A500737A600875A600232A500538A507048 óptico A100512F519022A607793A502805

Referencias

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  1. Cai, C., et al. Heterogeneous structure and spatial distribution in endosperm of high-amylose rice starch granules with different morphologies. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (41), 10143-10152 (2014).
  2. He, W., et al. The defective effect of starch branching enzyme IIb from weak to strong induces the formation of biphasic starch granules in amylose-extender maize endosperm. Plant Molecular Biology. 103 (3), 355-371 (2020).
  3. Wang, J., et al. Gradually decreasing starch branching enzyme expression is responsible for the formation of heterogeneous starch granules. Plant Physiol. 176 (1), 582-595 (2018).
  4. Chen, X., et al. Dek35 encodes a PPR protein that affects cis-splicing of mitochondrial nad4 intron 1 and seed development in maize. Molecular Plant. 10 (3), 427-441 (2017).
  5. Hu, Z. Y., et al. Seed structure characteristics to form ultrahigh oil content in rapeseed. PLoS One. 8 (4), 62099(2013).
  6. Huang, Y., et al. Maize VKS1 regulates mitosis and cytokinesis during early endosperm development. Plant Cell. 31 (6), 1238-1256 (2019).
  7. Xu, A., Wei, C. Comprehensive comparison and applications of different sections in investigating the microstructure and histochemistry of cereal kernels. Plant Methods. 16, 8(2020).
  8. Zhao, L., Pan, T., Cai, C., Wang, J., Wei, C. Application of whole sections of mature cereal seeds to visualize the morphology of endosperm cell and starch and the distribution of storage protein. Journal of Cereal Science. 71, 19-27 (2016).
  9. Zhao, L., Cai, C., Wei, C. An image processing method for investigating the morphology of cereal endosperm cells. Biotech & Histochemistry. 95 (4), 249-261 (2020).
  10. Borisjuk, L., et al. Seed architecture shapes embryo metabolism in oilseed rape. The Plant Cell. 25 (5), 1625-1640 (2013).
  11. Lott, J. N. A. Protein bodies in seeds. Nordic Journal of Botany. 1, 421-432 (1981).
  12. Jing, Y. P., et al. Development of endosperm cells and starch granules in common wheat. Cereal Research Communications. 42 (3), 514-524 (2014).

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