Summary
本稿では 、サルモネラ・チフィムリウム・ トリプトファン合成酵素の発現と精製のための一連の連続的な方法を提示し、このプロトコルは、1日でタンパク質複合体を精製するための急速なシステムをコンプする。対象となる方法は、部位特異的変異誘発、 大腸菌におけるタンパク質発現、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、および結晶化である。
Abstract
サルモネラチフィムリウム由来のトリプトファン合成酵素(TS)バイ酵素複合体(α 2 β 2 TS)を用いた構造研究が行われ、その触媒機構、アロステリック挙動、およびPLP依存酵素における生成物への酵素的形変換の詳細を理解することが行われている。本研究では、単離されたαおよび単離されたβサブユニットを生成する新規発現系により、2日以内に分離されたサブユニットから2 β st TS複合体をα大量に精製した。精製は、アフィニティー・クロマトグラフィーにより行い、続いて親和性タグの切断、硫酸アンモニウム沈殿、およびサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を行った。β部位の酵素における重要な残基の役割をよりよく理解するために、部位特異的突然変異誘発は、以前の構造研究で行われた。野生型および変異型α 2stTS複合体βを精製する別のプロトコルが作成されました。硫酸アンモニウム分画とSECを用いたシンプルで高速かつ効率的なプロトコルにより、1日で2stTS複合体α 2 β精製が可能になりました。この研究で説明した両方の精製プロトコルは、PEG 8000およびシュペルミンを使用して同じ複合体を精製する前のプロトコルと比較して、精製プロトコルに沿ってα 2 β 2StTS複合体を結晶化する場合にかなりの利点を有する。野生型および変異型の結晶化は、わずかに異なる条件下で生じ、PEG 8000およびスペルミンを用いた一部の変異体の精製を損なう。X線結晶学研究に適した結晶を調製するために、結晶化、結晶質、および凍結保護を最適化するためにいくつかの努力がなされた。ここで提示される方法は、一般に、2st TS複合体のトリプトファン合成酵素サブユニットおよび野生型および変異型α 2 β 2の精製に適用されるべきである。
Introduction
トリプトファン合成酵素(TS)バイ酵素複合体(α 2 β 2)は、アクロステリック酵素であり、細菌、植物、および真菌1、2、3におけるアミノ酸L-トリプトファンの生合成における最後の2つのステップを触媒する。サルモネラ菌腸管腸炎セロバル腸管(St)は、ヒトおよび他の動物において重篤な胃腸感染症を引き起こす。ヒトおよび高等動物はTS(EC 4.2.1.20)を有しないため、S.チフィムリウムα 2 β 2 TS複合体(α 2 β 2StTS)の阻害は、クリプトスポリジウム症および結核4、生殖器および眼感染症5の治療のための潜在的な薬物標的として探求されてきた。 αサブユニットは、インドール-3-グリセロールリン酸(IGP)からグリセアルデヒド-3-リン酸(GAP)およびインドールへのアルドー分解切断を触媒し、インドールトタクマー中間体の形成を経て、その後、炭素結合切断を経てGAPとインドール3,6を生成する。β触媒部位には、シッフ塩基を介してβ-Lys87に結合したピリドキサール5′リン酸(PLP)補因子分子が含まれており、これは酵素βサブユニット3,7での反応の過程で電子シンクとして機能する。β部位は、L-トリプトファンおよびPLP依存反応中の水分子を与えるためにインドールによるL-セリン側鎖ヒドロキシルの置換を触媒する。セントTSは、多酵素複合体2,3内における基質チャネリングおよびアロステリック通信の調査のための長年のモデルとして機能する。TSのαとβサブユニット間の双方向のアロステリック通信は、触媒ステップを同期させ、L-トリプトファン合成中のインドール放出を防止するために必要である3。この取り組みを拡張するために、StTS βサブユニットの触媒部位における酵素構造、メカニズムおよび機能の関係をさらに探求するために、単一点突然変異(β-Gln114Ala、β-Lys167Thr、およびβ-Ser377Ala)によっていくつかの変異体を調製しました。
α2β2StTS の触媒機構に関する詳細な研究は、エディス W. マイルズの研究グループによって開始されました。天然大腸菌α 2 β 2TS複合体を用いた初期の研究は、単離されたαサブユニット8、9、単離βサブユニット10、11、およびα 2 β 2TS複合体の分離サブユニット12からの再構成の精製および特徴付けに焦点を当てている。精製は硫酸アンモニウム沈殿、サンプル透析、DEAE-セファデックスクロマトグラフィー、透析、およびDEAE-セファデックスカラム12上の第2のクロマトグラフィーラウンドによって行った。別のプロトコルでは、同じ複合体の精製は、明確化された細胞リセートをDEAE-Sephadexカラムにロードし、続いてセファローズ4Bカラムにクロマトグラフィーステップを行い、硫酸アンモニウム沈殿および透析13を行うことで改善された。両方の精製プロトコルは4〜5日間続きます。エシェリヒア・コリα 2 β 2TS錯体が結晶化したが、当時のX線回折には結晶が適していなかった。
新規研究では、S.チフィムリウムα 2 β 2TS複合体の組換えおよび野生型形態を精製し、14,15を結晶化した。組換えα 2 β 2St TS複合体は、pEBA-10発現ベクターを担持した大腸菌株CB149において過剰発現した。初期結晶化およびX線回折データの収集と分析2stTS複合体β α 2の収集と分析は、14を報告した。しかし、2 β 2StTS結晶αのような長くて細い針は構造研究を損なった。より良いX線回折データを収集する試みにおいて、α 2 β St TS複合体15の野生型および変異型を精製する別の精製プロトコルが記載された。精製は、スペルミンおよびPEG8,000を用いた初期沈殿を用いて精製した細胞リセートに行い、遠心分離により大きなかさばる沈殿物を除去した。高量のα 2 β 2StTS複合体を含む上清画分を、黄色の結晶が析出するまで4°Cで16〜48時間保存した。結晶を洗浄し、異なるバッファーに対して広範囲に透析した。タンパク質複合体は、硫酸アンモニウムを含む緩衝液中で再結晶化し、15.15を透析した。タンパク質の結晶化は、溶液中のタンパク質および沈殿物濃度に依存するが、α 2 β 2StTS複合体の他の変異型の精製を、溶液中で監視、予測、再生することは困難である。このプロトコルには、クロマトグラフィー法を使用しないという利点があります。しかしながら、欠点は、結晶化、透析、再結晶化に必要な長い精製時間であり、典型的には5〜7日を要する。X線データ収集に適した結晶を得るために、600以上の結晶化条件を、タンパク質濃度、温度、沈殿物(PEG4,000、6,000、および8,000)の組み合わせおよび変動を用いて評価した。結晶はより良い結晶形態を持ち、12%PEG 8,000および2 mMのスペルミンを含む条件でより速く成長した。結晶化は4、30、または42°Cではなく25°Cでより好ましく、3日以内に最大寸法15に成長した。当時のα 2 β 2StTS結晶構造(1996-1999)16、17、18、19、20、21、その他多くの構造がこれまでに発表されています。
ここで、主な目的は、トリプトファン合成酵素を精製し、タンパク質の結晶化を最適化するための代替プロトコルを提示することです。本研究は、野生型単離αサブユニット(α St TS)、単離βサブユニット(β St TS)、2 β 2stTS複合体 αを単離されたサブユニットから再構成し、α 2 β 2St TS複合体の野生型および変異型を精製するための有意な改善を示す。 精製時間が大幅に短縮され、結晶化と凍結保護が最適化されるため、過去のプロトコルに対する利点はかなり高いものです。本研究で設計されたα 2 β 2St TS複合体の変異型は、野生型形態に使用される同じ条件付近で結晶化している。しかし、微細結晶化最適化は、原子分解に近いところで構造決定に十分な品質の大きな単結晶を得る必要があった。現在までに、タンパク質データバンク(PDB)に堆積した134のトリプトファン合成酵素結晶構造があり、細菌、古細菌および真核生物に関してそれぞれ101、31、2の結晶構造を考慮しています。うまく、73の構造はS.エンテラバーチフィムリウムに属し、α 2 β 2StTS複合体の5つの結晶構造は1.50オングストロームよりも高い解像度制限を有する。当然のことながら、4アウト5は、私たちの研究グループ(PDB ID:5CGQは1.18 Å、4HT3は1.30 Å、4HPJは1.45 Å、6DZ4は1.45 Å解像度で)で作成されました。2stTS複合体α 2 βの変異型の洗練された結晶構造は、L-トリプトファン合成に関与する必須アミノ酸残基が果たすメカニズムおよび役割に関する新たな洞察を提供することが期待される。
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Protocol
1. αおよびβサブユニットと再結合されたα 2βStTS 複合体を浄化するための高速プロトコル
- pETSUMO発現ベクターにサブクローニングするDNA
- pEBA-10発現ベクター22にクローン化されたサルモネラ・腸膜腸筋腸球菌からトリプトファンシンターゼのα−およびβ-サブユニットをコードする翻訳結合遺伝子(trpAおよびtrpB)を得る。pEBA-10 ベクターを DNA テンプレートとして使用します。
注:または、以下に記載されているプライマーは、 サルモネラ腸内腸 球性皮内 腸球体 ゲノムから両方の遺伝子を増幅するために使用することができます。分子生物学のステップはすべて、「分子クローニング:実験室マニュアル23」に記載されているように従った。 - ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して、セントTS-FW-BamおよびαセントTS-Rev-Eco αプライマーを使用してα-subunit(α St TS)の全長ポリヌクレオチド配列を個別に増幅し、β-subunit(βStTS)の全長配列をセントTS-FW-BamとβセントTS-Rev-Hind β βします。約55°Cの溶融温度と2分のポリメラーゼ延長時間を使用してください。
- 高忠実度のDNAポリメラーゼ(例えば、Phusion)とメーカーのプロトコルを使用してDNA配列を増幅します。50 μL PCR 反応に加えてヌクレアーゼを含まない水 34 μL、5x 反応バッファー 10 μL、1μL の 10 mM フォワードプライマー、1 μL の 10 μM 逆プライマー、1 μL のテンプレート DNA (200 ng)、1.5 μL の DMSO、0.5 μL のポリメシアプライヤを加えます。
- PCR プログラムでは、ホット スタート(98 °C で 180 秒)、30 回の増幅サイクル(98 °Cで 30 秒、55 °Cで 30 秒、72 °Cで 120 秒)、および最終延長 (72 °C で 300 秒) を使用します。
注:斜体のシーケンスは、それぞれ 、BamHI、 エコRI、 バムHIと ヒンドIII制限サイトに対応しています。PCR断片の末語に近い酵素切断効率は、余分な塩基(小文字配列)を添加することによって増強された。
αセントTS-FW-バム:5'cgcGGATCCATGGAACTACGAAA-3′
αセントTS-レヴエコ:5'ccgGAATTCTTATGCGCGGGGGGC-3′
βセントTS-FW-Bam:5'cgcGGATCCATGACAACTCTCAAC-3′
βセントTS-レヴ・ヒンド:5'-cccAAGCTTTCAGATTCCCCTC-3′
- PCR産物を1x TAEバッファー(40mMトリス、20mM酢酸、1 mM EDTA)の6V/cmでPCR産物をロードし、目的のDNAバンドを抽出し、メーカーの指示に従ってシリカビーズキットを使用してPCR断片を精製します。
- 適切な制限酵素と37°Cで2時間メーカーが推奨する条件で、各DNA断片の少なくとも200 ngを消化します。
- 50 μL制限消化反応を設定するには、ヌクレアーゼを含まない水を34 μL、DNA 10 μL(200 ng)、10x反応バッファーの5 μL、0.5 μLの制限酵素1、および0.5 μLの制限酵素2を加える。
- 6 V/cmで1x TAE上の0.8%アガロースゲルに消化産物をロードし、ゲル抽出物、およびゲルは、市販のキットを使用して消化断片を精製します。
- サブクローンは、各断片を個々に 大腸菌 発現修飾ベクターpET SUMOに、あらかじめ適切な酵素で消化し、ゲルを精製した。
注: このベクトルは、商用 pET SUMO の修正版です。このベクターは制限酵素クローニング用に最適化されています。pET SUMOクローニングサイトにpET 28bベクター(バムHI、エコRI、サックI、サルI、ヒンドIII、NotI、およびXhoI)のマルチクローニングサイト(MCS)を挿入しました。このベクターには、スモールユビキチン様修飾タンパク質(SUMO)および複数のクローニング部位を有するフレーム内のN末端6x-ヒスチジンタグが含まれています。 - リゲート100ngの改変pET SUMOと50ngのPCRフラグメントをT4 DNAリガーゼで25°Cで2時間用いた。
- 構築されたプラスミドを大腸菌株DH10B α細胞の有能な細胞に変換する。35 μg/mLカナマイシンを含む LB寒天プレート上のプレートセル。プレートを37°Cで一晩反転してインキュベートする。
- 各変換から単一のコロニーを選択し、超純粋なプラスミドDNAを調製し、DNAシーケンシングを行い、α StTSまたはβ StTSがN末端His6-SUMOタグでフレームにクローン化されたことを確認します。
注:細胞培養のグリセロールストック(菌性グリセロールの16%最終濃度で細胞懸濁液を回す)を準備し、-80°Cで長期間保存してください。 - 発現プラスミドをスモ-α StTSまたはSUMO-β St TSを、T7プロモーターベースのシステムを用いて大腸菌発現株ロゼッタ(DE3)pLysSの有能な細胞に個別に変換する。 35 μg/mL カナマイシンとクロラムフェニコールを含む寒天プレートに組換え細胞をプレートします。プレートを37°Cで一晩反転してインキュベートする。
- コロニー形成に成功した後、1つのコロニー(衛星コロニーなし)を選び、両方の抗生物質で5mLのLB培地に分散させます。培養細胞は37°Cで200rpmで一晩揺動する。
注:細胞培養のグリセロールストックを準備し、-80°Cで長期保存するか、組み換えタンパク質発現のためにすぐに使用してください。
- pEBA-10発現ベクター22にクローン化されたサルモネラ・腸膜腸筋腸球菌からトリプトファンシンターゼのα−およびβ-サブユニットをコードする翻訳結合遺伝子(trpAおよびtrpB)を得る。pEBA-10 ベクターを DNA テンプレートとして使用します。
- STTSおよび SUMO β st TS サブユニットαSUMO- st TS サブユニットの式
- 新鮮な大腸菌株ロゼッタ(DE3)は、スモー-α StTSまたはSUMO-β St TSを含むpLysS細胞は、凍結グリセロールストックの一部を35μg/mLカナマイシンおよびクロラムフェニコールを含むLBの50mL培養物に構築または掻き取る。37°Cで200rpmで揺れ、一晩細胞を成長させます。
- 翌朝、2%グリセロールプラスカナマイシンおよびクロラムフェニコール(2.8 Lフェルンバッハフラスコ)を含むLBの新鮮で無菌2x 1000 mLで一晩細胞培養の5mLを接種する。37°Cで200rpmで揺れ、細胞培養を成長させます。
注:LBブロスでのSUMO-α StTSまたはSUMO-β St TSの発現は、1リットル当たり125〜150mgのタグ付きタンパク質を生み出します。特定の要求を満たすために、プロトコルを上下にスケーリングすることを検討してください。 - OD600 が0.4mMの最終濃度でイソプロピルβ-D-1チオガラクトピラノシド(IPTG)を添加し、200rpmで振盪して一晩30°Cでインキュベートを行い、0.6-0.8に達すると組換えタンパク質発現を誘導します。
- 4°Cで4000xgで20分間遠心分離して細胞を収穫する。上清を取り除き、冷たいリシスバッファー1(50 mM Tris-Cl、pH 8.0、500 mM NaCl、5%グリセロール、10 mM 2-メルカプトエタノール、および40 mMイミダゾールCl)を含む細胞ペレットを60mLの最終容積まで再懸濁させます。
注:細胞は、-80°Cで長期保存することも、タンパク質精製のためにすぐに使用することもできます。細胞を保存するには、細胞懸濁液を2 x 50 mLの使い捨て遠心円錐管に分割し、タンパク質精製段階まで細胞ペレットを-80°Cに保ちます。
- の精製 α- トリプトファンシンターゼのβサブユニット
注:特に明記されていない限り、すべての手順は4°Cで行う必要があります。精製時間を短縮するために、Ni-NTAアガロース・アフィニティーカラムとサイズ排除カラムをタンパク質精製前または組換えタンパク質発現中にバッファー内で平衡化します。- 1/2"ホーンプローブ(または同様の機器)を備えたデジタルソニファーを使用して超音波処理によって細胞ペレットを破壊する。10 sパルスと20の休息を使用するか、完全な細胞破壊まで、氷水浴の80%振幅デューティサイクルで20サイクルを実行します。
- 細胞のリセートを30,000 x g で30分間遠心分離する。吸気上清は、ペレットがチューブから外れないことを保証する。氷上の0.45 μmフィルターユニットで上澄みをフィルターし、15 mL Ni-NTAアガロースニッケル帯電アフィニティーカラムを通して、リシスバッファー1で事前平衡化して流します。
注:各Ni-NTAアガロースカラムは、SUMO-α StTSまたはSUMO-β StTS組換えタンパク質のいずれかを精製するために使用されます。精製は、高速タンパク質液体クロマトグラフィーシステムに結合した2x 5 mL Ni-NiTAカラムで行うことができます。一度に1つのタンパク質を精製します。 - 100 mLのリシスバッファー 1 に Ni-NTA アガロースカラムを洗浄します。
- バッファーE1(25 mM Tris-Clバッファー、pH 7.8、200 mM NaCl、5%グリセロール、および400 mMイミダゾール-Cl)を用いた80 mLのワンステップ溶出を進める。
注:SUMOプロテアーゼは最大300 mMイミダゾールを許容し、遠心フィルターデバイスの膜は最大100 mMイミダゾールを許容します。大量のイミダゾールを除去し、タンパク質サンプルを希釈し、タンパク質濃度で時間を無駄にする代わりに精製時間を短縮するために、硫酸アンモニウム沈殿を行うことをお勧めします。 - 上清分率の初期体積を評価します。25°Cで60%の飽和(39.48 g / 100 mL)に達するまで、一度に少量の硫酸アンモニウムをゆっくりと添加する。30分間溶液を軽くかき混ぜ、泡を避けます。遠心分離機 10,000 x g で 15 分間
- 吸気し、上清分を慎重に捨てる。ペレット分率をサンプルバッファーの 20 mL (20 mM トリス Cl、 pH 8.0、300 mM NaCl および 5% グリセロール) で再懸濁します。
- SUMO-プロテアーゼによるHIS-SUMOタグ切断の場合、 サッカロミセス・セレビシアeからUbl特異的プロテアーゼ1の組換えフラグメントを1:1000比で添加し、4°Cで2時間インキュベートする。
- 消化産物を25°Cで2000xgで遠心分離し、アフィニティークロマトグラフィーカラムを介してサンプルをロードする前にタンパク質凝集体を除去します。
- 15 mL Ni-NTA アガロースカラム上に20 mL再懸濁サンプルを渡すHis6-SUMOタグの痕跡を除去し、以前にリシスバッファー1で平衡化した。
- タグなしのα StTS またはstTS β含むパススルー サンプルを収集します。
- Ni-NTAカラムをバッファ1の20 mLで洗浄し、タグなし のα StTSまたはβ StTSの残り物を収集します。
- 4°Cで3,000 x g で回転することにより、15 mL 10 kDa カットオフ遠心フィルターユニットで各サブユニットを別々に濃縮します。 濃縮タンパク質を新たに2.0mLチューブとマイクロ遠心分離機(10,000 x g、10分、4°C)に移し、凝集体を除去します。タンパク質濃度24を決定し、20〜25 mgmL-1で1mLアリコートを調製し、液体窒素中でラベル、フラッシュフリーズ、-80°Cで保存します。
注:予精製タンパク質サンプルは、-80 °Cで長期保存することも、サイズ排除クロマトグラフィーカラム(SEC)上でタンパク質精製のためにすぐに使用することもできます。 - タンパク質アリコート(20mg)とマイクロ遠心分離機を10,000 x g で10分間服用し、SEC以前の凝集体を除去します。
- サイズ除外クロマトグラフィーカラムにサンプルをロードする(例えば、 HiPrep 16/60 セファクリルS-200 HR)は、速タンパク質液体クロマトグラフィーに0.5 mL min-1の流量で結合し、以前はSEC緩衝液(10 mM Tris-Cl、pH 7.8、100 mM NaCl、5%グリセロール、0.1 mMピリドキシスリン酸) で平衡化した。
注:セントTSまたはβ StTSサブユニットの分離αを高く精製し、SECラウンドの数を減らすには、1.5 mL minの流量でサイズ除外クロマトグラフィーカラムに20〜25 mg mL-1の5 mLサンプルをロードします。 - ピーク画分におけるα StTSまたはβ StTSの品質を評価するには、それぞれ12%または15%のドデシル硫酸ゲル電気泳動(SDS-PAGE)を用いて、クーマシーブリリアントブルーステイン25で染色した。
- 新鮮な15 mL 10 kDaカットオフ遠心フィルター単位でタンパク質を濃縮し、タンパク質濃度24を決定し、20〜25 mg mL-1で0.5 mLアリコートを調製し、ラベル、液体窒素中のフラッシュフリーズ、-80 °Cで保存します。
- αサブユニットとβサブユニットからのα 2 β 2StTS複合体の精製
注:サイズ排除クロマトグラフィーカラム(セファデックスS-200 HRまたはスーパーデックス200 pg)をSECバッファ(10 mM Tris-Cl、pH 7.8、100 mM NaCl、5%グリセロール、0.1 mMピリドキサールリン酸)で平衡化します。- αサブユニットとβサブユニットから野生型α 2 β 2StTS複合体を精製するために、α StTSおよびβ StTSサブユニットのサンプルを4°Cで融解する。
- アリコート(1.2 α St TS:1.0 β St TSモル比)を組み合わせ、4°Cで1時間インキュベートします。
注: αStTS の超過分は、β StTS のほとんどが α2 β2StTS 複合体に組み込まれるようにする必要があります。 - ミクロ遠心分離(10,000 x g、10分、4°C)でタンパク質凝集体を除去します。
- 明確化した上清をサイズ除外列にロードします。
- ピーク画分におけるα StTSまたはβ StTSの品質を評価するには、それぞれ12%または15%のドデシル硫酸ゲル電気泳動(SDS-PAGE)を用いて、クーマシーブリリアントブルーステイン25で染色した。
- タンパク質濃度24を決定し、15〜20 mg mL-1で250〜1000 μLアリコートを調製し、液体窒素中のフラッシュフリーズ、-80°Cで保存します。
2. α 2 β St TS複合体の野生型または変異型の精製
- StTSの変異体を調製するための部位特異的変異β
- 構築pEBA-10発現ベクター22 をポリメラーゼ連鎖反応の2段階の間のDNA鋳型として使用して 、β-chainTSポリヌクレオチド配列に特異的なポイント変異を導入する。
注:このプロトコルは、サルモネラチフィムリウムトリプトファンシンターゼからαまたはβサブユニットに単一点突然変異を導入するために使用することができます。追加のために、望ましい変異を含む新しいオリゴヌクレオチドプライマーは、適宜設計されなければならない。本研究では、Q114A β変異、Β K167T、β S377Aが挙げられている。 - ヌクレオチドプライマーTS-FW-NcoI/Q114A-Rev、TS-FW-NcoI/K167T-Rev、およびTS-FW-NcoI/S377A-Revのペアを使用してPCR反応を行い、それぞれA1、B1、C1のフラグメントを生成します。
注:オリゴヌクレオチドTS-NcoI-FWおよびTS-SacI-Revは、それぞれ、pEBA-10ベクターでクローン化されたαβ StTSポリヌクレオチド配列の上流および下流のアニールを行う。- 高忠実度のDNAポリメラーゼ(例えば、Phusion)とメーカーのプロトコルを使用してDNA配列を増幅します。50 μL PCR 反応の場合、ヌクレアーゼを含まない水 34 μL、5x 反応バッファー 10 μL、10 mM dNTPs 1 μL、1μL の 10 μM フォワードプライマー、1 μL の 10 μM 逆プライマー、1 μLのテンプレート DNA (200 ng)、1.5 μL の DMSO、0.5 μL のポリマーを加えます。
- PCR プログラムでは、ホット スタート(98°Cで 180 秒)、30 回の増幅サイクル(98 °Cで 30 秒、55 °Cで 30 秒、72°Cで 120 秒)、最終延長(72°Cで 300 秒)を使用します。
注:分子生物学のすべてのステップは、分子クローニング:実験室マニュアル23に記載されているように従いました。小文字のシーケンスは制限部位に対応しますが、太字と斜体のシーケンスは突然変異に対応します。
TS-FW-NcoI: 5'-CAA TTT CAC ACA GGA AAC AGA cca tgg-3'
Q114A-Rev: 5'-C アガ GGC GAC GCC GTGGC GC ACC GGC GCC GGT TTC-3'
K167T-Rev: 5'-CTC GTT ACA GGC ATC TGT タグ CGT AGC GGA GCC-3'
S377A-Rev: 5'-C TTT ATC TCC GcG GCC AGC ギャグ ATT GAC CAC CAG-3'
- ヌクレオチドプライマーTS-Rev-SacI/Q114A-FF、TS-Rev-SacI/K167T-FF、およびTS-Rev-SacI/S377A-FFのペアを使用してPCR反応を行い、それぞれA2、B2、およびC2の断片を生成します。
TS-Rev-SacI (5'-TTA tgc gcg GCT GGC GGC TTT CAT GGC TGA G-3'
Q114A-FF 5'-GAA ACC GGC GCC GGT GT GCAC GC GTC GCC TCT G-3'
K167T-FF 5'-GGC TCC GCT ACG CTA ACA GAT GCC TGT AAC GAG-3'
S377A-FF 5'-CTG GTG GTC AAT CTC GCT CT C CGC GGA GAT AAA G-3' - ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、部分断片を個別に増幅する。55°Cの溶融温度と2分のポリメラーゼ延長時間を使用してください。
- PCR反応の第2ラウンドを実行するには、上記のPCR産物を6V/cmの1x TAEに0.8%アガロースゲルにロードし、ゲル抽出物とゲルが目的の断片を精製します。
- フラグメントA1/A2、B1/B2、C1/C2を等モル量で別々に混合し、96°Cで10分間熱変性し、25°Cでアニールします。 メーカーのプロトコルに従って、高忠実度ポリメラーゼおよびデオキシリボヌクレオチドで組換えストランドを拡張します。
- 全長変異型DNA断片の高いコピー数を生成するには、オリゴプライマーTS-FW-NcoIおよびTS-Rev-SacIを追加して、2回目のPCRを行う。
- PCR産物を6V/cmで1x TAEバッファーに0.8%アガロースに負荷し、目的のDNAバンドをゲル抽出し、PCR断片をゲル化し、製造業者が推奨する適切な緩衝液および条件に従って37°Cで2時間適切な制限消化を進める。
- 適切な制限酵素と37°Cで2時間メーカーが推奨する条件で、各DNA断片の少なくとも200 ngを消化します。 50 μL制限消化反応を設定するには、ヌクレアーゼを含まない水を34 μL、DNA 10 μL(200 ng)、10x反応バッファーの5 μL、0.5 μLの制限酵素1、および0.5 μLの制限酵素2を加える。6 V/cmで1x TAEバッファーに0.8%アガロースに消化産物をロードし、消化PCRフラグメントを精製します。
- PEBA-10のダイジェスト 200 ng 制限酵素 NcoI と SacI メーカーの勧告に従って.消化産物を0.8%アガロースゲルに6V/cmの1x TAEバッファーにロードし、バンドの特派員をベクターに切り出し、消化されたベクターをゲル化します。
- LIgate 100 ngのPCRフラグメントを有するベクターのLIGATEは、以前に消化および精製し、25°Cで2時間T4 DNAリガーゼを用いた。 構築されたプラスミドを有能な細胞に変換します. 50 μg/mL アンピシリンを含む LB寒天プレート上のプレートセル。プレートを37°Cで一晩反転してインキュベートする。
- 各細胞変換から単一コロニー(任意の衛星コロニーなし)を選び、アンピシリンを含むLB培地の5mLに分散させます。37°Cで200rpmで揺れ、一晩細胞を成長させます。 各設計された構造から10μgの超純粋プラスミドDNAを調製します。細胞培養物のグリセロールストック(菌性グリセロールの最終濃度16%で細胞懸濁液を回す)を調製し、-80°Cで長期保存する。
- DNAシーケンシングを行い、トリプトファン合成酵素のαおよびβサブユニットをコードする全長配列を確認します。個々の個々の突然変異を確認し、望ましくないランダム突然変異を含む任意のプラスミドコンストラクトを廃棄する。本研究で用いたオリゴヌクレオチドプライマーは以下の通りである。
TS-1F: 5'-アガカアクトクトクトカアク-3'
TS-1R: 5'-GAAATGCCAACATTAC-3'
TS-2F: 5'-CAGTCGCCGAACGTC-3'
TS-3F: 5'-ガッツGCAACAGC-3'
TS-4F: 5'-CTGGCATTGAACAGTC-3'
TS-5F: 5'-CGTTGCATCATCATCATTG-3'
注:オリゴヌクレオチドプライマーTS-1F、TS-1R、TS-2F、およびTS-3Fアニールは、βサブユニットのポリヌクレオチド配列上に(GenBankの受付コード:CP051286.1)。αサブユニットのポリヌクレオチド配列上のプライマーTS-4FおよびTS-5Fアニール(GenBank加盟コード:CP053865.1)。 - 各プラスミドコンストラクト(pEBA-10-β Q114A、pEBA-10-β K167T、およびpEBA-10-β S377A)の200ngを使用して、大腸菌発現株CB149の有能な細胞を変換し、trpオーペロン26を欠く。コロニー形成に成功した後、1つのコロニーを選び、50 μg/mLアンピシリンを含むLB培地の5 mLで細胞を成長させます。細菌インキュベーター中の培養は一晩で37°Cで行う。細胞培養のグリセロールストックを調製し、-80°Cで長期保存するか、組み換えタンパク質発現にすぐに使用する。
注:サルモネラチフィムリウムトリプトファンシンターゼからαまたはβサブユニットの単一点突然変異は、大腸菌株CB149におけるL-トリプトファンの酵素機能または低合成を損なう可能性がある。SDS-PAGEゲルで2stTS複合体が検出された発現量またはα 2 β 2st TS複合体が検出されない場合は、大腸菌株BL21(DE)pLys-Sまたはロゼッタ(DE3)pLys-Sのいずれかを使用することを検討してください。
- 構築pEBA-10発現ベクター22 をポリメラーゼ連鎖反応の2段階の間のDNA鋳型として使用して 、β-chainTSポリヌクレオチド配列に特異的なポイント変異を導入する。
- 大腸菌におけるα 2 β 2St TS複合体の野生型と変異型の発現
- 50 μg/mL アンピシリンを含む LB 培地の新鮮で無菌 50 mL に望ましい構造を収容する 大腸菌 発現株を成長させます。37°Cで200rpmで揺れ、一晩細胞を成長させます。
- 2%グリセロールプラスアンピシリン(2.8 L フェルンバッハフラスコ)を含む LB の新鮮で無菌 2x 1000 mL に一晩細胞培養の 5 mL を加えます。37°Cで200rpmで揺れ、細胞培養を成長させます。
- 最終濃度0.4mMでIPTGを添加し、200rpmで振盪して一晩30°Cでインキュベートを行い、OD600 が0.6-0.8に達すると組換えタンパク質発現を誘導します。
- 4°Cで4000xgで20分間遠心分離機で細胞を収穫する。上清を取り除き、冷たいリシスバッファー2(50 mMトリスCl、pH 7.80、100 mM NaCl、5 mMジチオトライトール、1 mM EDTA、および1 mM PMSF)を含む細胞ペレットを50 mLバッファーの最終体積に再懸濁します。
注:細胞は、-80°Cで長期保存することも、タンパク質精製のためにすぐに使用することもできます。細胞を保存するには、細胞懸濁液を2 x 50 mLの使い捨て遠心円錐管に分割し、タンパク質精製段階まで細胞ペレットを-80°Cに保ちます。LBブロス中の2 β stTS複合体α変異体および野生型の発現は、1リットル当たり125〜150mgのタンパク質を生み出す。特定の要求を満たすために、プロトコルを上下にスケーリングすることを検討してください。
- 2 stTS複合体のα 2 β野生型または変異型の精製
注:次のプロトコルは、組換えαの非タグ付き組換え野生型または変異型を浄化することを目的としています。2β2Stスキルセットや努力に応じて、1日以内にTSコンプレックス。精製時間を短縮するために、バッファー前のタンパク質精製/発現においてサイズ排除カラムを平衡化する。野生型または変異型αの精製2β2StTS複合体は、硫酸アンモニウム分画及びサイズ排除クロマトグラフィーを含む2段階精製によって行われる。このプロトコルは、LB培地の1 Lから純粋な複合体の60-100 mgを生成します。- 1/2"ホーンプローブ(または同様の機器)を備えたデジタルソニファーを使用して超音波処理によって細胞ペレットを破壊する。10 sパルスと20の休息を使用するか、完全な細胞破壊まで、氷水浴の80%振幅デューティサイクルで20サイクルを実行します。
- 25°Cで30分間30,000xgで細胞リセートを遠心分離する。 吸気上清は、ペレットがチューブから外れないことを保証する。室温で0.45 μmフィルターで明確化した上清分をフィルター処理します。
- 明確化された上清分分率の初期体積を評価します。一度に少量の硫酸アンモニウムをゆっくりと添加し、20%の飽和に達するまで(11.51g/100mL)。硫酸アンモニウム分画を25°Cで行う。 10分間溶液を軽くかき混ぜ、泡を避けます。
- 遠心分離機 30,000 x g で 10 分 25 °C. 20%の上清分をきれいなフラスコに移します。サンプルバッファー20mL(50mMトリスCl、pH 7.80、100mM NaCl、1 mM EDTA、および2 mMジチオトレイトールを含む)の20%ペレット分率を穏やかに再懸濁し、サンプルを調製してSDS-PAGEゲルを実行します。20%ペレット分率を捨てます。
- 20%上清分の初期体積を評価します。硫酸アンモニウムを30%飽和(5.94g/100mL)に加え、溶液をかき混ぜ、気泡を避け、遠心分離機を以前のように。30%の上清分をきれいなフラスコに移します。20 mLのサンプルバッファー2に30%ペレット分率を緩やかに再懸濁し、サンプルを調製してSDS-PAGEゲルを実行する。30%ペレット分率を捨てます。
- 30%上清分の初期体積を評価します。40%の飽和度(6.14g/100mL)に達した硫酸アンモニウムを加え、溶液をかき混ぜ、気泡を避け、遠心分離機を以前のように。40%の上清分をきれいなフラスコに移します。サンプルバッファー2の10mLで40%ペレット分を緩やかに再懸濁し、サンプルを調製してSDS-PAGEゲルを実行する。40%の上清分を捨てます。
注:12%SDS-PAGE gel25で30%と40%の上清およびペレット分画のサンプルを使用してαβStTS複合体の品質を評価します。任意の他の変異型αβStTS複合体が40%上清分画分であることを確認した場合、硫酸アンモニウム(13.0 g/100 mL)の60%の飽和度で進める。予精製α 2 β 2 StTS複合体の予精製タンパク質アリコートは、-80°Cで長期保存することも、サイズ排除クロマトグラフィーカラム(SEC)上でタンパク質精製のために直ちに使用することもできます。 - タンパク質サンプルを10,000 x g、20分でマイクロ遠心分離し、 4°Cをロードし、高速タンパク質液体クロマトグラフィーに取り付けられたHiPrep 16/60 S-200 HRカラムに上清分率をロードし、流速0.5 mL min-1で、以前はSECバッファ(10 mM Tris-Cl、pH 7.8、100 mM NaCl、5%グリセロール)で平衡化 0.1 mMピリドキサールリン酸)。
注:大量の複雑さを浄化するには、1.5 mL分の流量でHiLoad 26/600 Superdex 200 pg列に20-25 mg mL-1の5mLサンプルをロードします。 - 硫酸アンモニウム分画に沿って採取した試料を、12%SDS-PAGEゲルに対してSECカラムから採取した、クマシーブリリアントブルーステイン25で染色した。
- 野生型または変異型α 2 β 2StTS複合体を15 mL 100 kDaカットオフ遠心フィルターユニットで4°Cで3,000 x gで回転させて濃縮します。 濃縮タンパク質を新たに2.0mLチューブとマイクロ遠心分離機(10,000 x g、10分、4°C)に移し、凝集体を除去します。
- タンパク質濃度24を決定し、20〜25 mg mL-1で0.5 mLアリコートを調製し、液体窒素中でラベル、フラッシュフリーズ、および-80°Cで保存します。
3.α 2βStTS複合体の野生型と変異型の結晶化を最適化
注:α 2 β 2StTS複合体の初期結晶化条件は、12%PEG 8,000および2 mMスペルミン22を含む条件で以前に報告されました。
- 結晶化アッセイの前にストックソリューションを準備し、より良い結晶化再現性を達成します。TSを用いて構造研究を行うために、二酵素複合体の金属配位部位でNa+ またはCs+ イオンを用いてタンパク質を結晶化する。
- 200 mM のスペルミンの 5 mL ストック溶液を水中に用意し、500 μL のアリコートを-20 °Cに保ちます。
- 水で30%(w/v)PEG 8000の50 mLストック溶液を調製し、25 mLの使い捨て遠心分離機円錐形フラスコスコラスコ25 m20 °Cに25 mLアリコートを保管します。
- 25 mL ストック溶液を水に入れ、25 °Cに保ちます。
- 水で1 M NaClの25 mLストック溶液を調製し、25°Cに保ちます。
- 1 M ビシンの 3x 50 mL ストック溶液を調製し、CsOH または NaOH で titrate して、pH 7.6、7.8、および 8.0 でバッファー溶液を得ます。25 mL のアリコートを 4 °Cに保ちます。
- 氷浴上のα 2 β 2StTS複合体(20〜25mg mL-1)のサンプルを解凍する。
- マイクロ遠心分離機試料を10,000 x g で25°Cで10分間10分間、タンパク質凝集体を除去した。
- クリアした上清分をクリーンマイクロ遠心チューブに移します。
- 推定タンパク質濃度24 および希薄タンパク質アリコート(150-200 μL)で15mgmL-1 で50mMビシンCsOHまたは-NaOH、50 mM CsClまたはNaClを含むpH 7.8。タンパク質サンプルを25°Cに保ちます。
- 500 μL リザーバーソリューションを、無菌 1.5 mL ラベル付きマイクロ遠心チューブ内の 3x 24 ウェルの座っているドロッププレート用に準備します。リザーバー溶液には、50 mM ビシン CsOH または -NaOH、50 mM CsCl または NaCl、および PEG 8000 が含まれています。プレート列のPEG 8000(6-11%)の濃度とプレート列のスペルミン(2〜8 mM)の濃度を変化させます。各セットのバッファー pH (pH 7.6、7.8、8.0) を変更します。
- チューブと渦を少なくとも10秒激しくキャップします。気泡を取り除くために25°Cで10分間10,000 x g の遠心管。 ラベル付けされた各リザーバに500 μLの緩衝液を分配する。
- P-10マイクロピペットを使用し、各座っているドロップウェルあたり15 mg mL-1 でタンパク質溶液の5 μLを分配します。気泡を避けてください。各対応リザーバ溶液の5μLをタンパク質ドロップに加えます。混合中の気泡を避け、混合物を均質化するために上下にピペットしないでください。
- 透明な粘着テープでプレートをテープに貼り、25°Cで保存します。 結晶は2〜5日で現れ、2週間以内に完全な寸法に成長します。
4. X線回折データ収集とα 2 β 2StTS複合構造ソリューション
注:X線回折データ収集の前に、各結晶に対して凍結保護剤溶液を事前に準備してください。特定のリザーバ溶液を使用して、溶液中のdiメチルスルホキシド(10、20、および30%v/v)および特異的リガンド(複数可)を含む3つのアリコートを調製する。ジメチルスルホキシドは、グリセロール、エチレングリコール、およびPEG200-300よりも優れた凍結保護剤であることが判明した。
- 立体顕微鏡下でクライオループを使用して大きな単結晶を収穫する。
- 沈殿液を含む各凍結保護剤溶液のピペット2 μLに加えて、より高濃度のdイメチルスルホキシドおよびリガンド(複数可)を 新しいカバースライドに加えた。
- 順次に、各滴に cリスタルを浸し、結晶を凍結保護液中で30秒間平衡させます。
- -173 °C (100 K) の気体窒素流を使用して凍結保護された結晶をフラッシュ冷却するか、液体窒素に浸してパックに長期保存します。
注:泡デュワーに液体窒素を充填し、クリスタルパックを事前に冷却し、極低温貯蔵デュワーに結晶を保存し、乾燥荷主を使用してシンクロトロンにクリスタルを出荷します。 - -173 °CでX線回折データの収集を進めます。 0.5~4.0秒の露光時間と0.5°振動を使用してX線回折データを記録します。180-360°回転する。
- iMosflm27でX線回折画像を処理し、適切な空間群に反射ファイルを生成する。一般に、2 β 2stTS結晶α、宇宙群C121(C2)に属する。
- CCP4 パッケージ29に実装された Scala28を使用して、反射の複数の観測値をまとめてスケールします。
- MolRep30と適切な検索モデルを用いた分子置換により、2 β St TS複合体の高解像度α 2の構造を解く。構造解が成功した後に、クート31のモデルと電子密度マップを検査する。
注:タンパク質データバンクには、異なるリガンド(複数可)を有する多くのTS結晶構造が堆積しています。より良い分子置換ステップと新しい結晶構造に適合する時間の短縮のために、目的のリガンド(複数可)を含む最良の検索モデルを使用してください。CCP429、30、またはフェニックス31で結晶構造の改良を進めます。 - クート32を使用してモデルを手動で調整し、Refmac29、33またはphenix.refine31、34で自動的に絞り込みます。クート32でモデル構築の反復ラウンドを実行し、自動絞り込みを実行して、最終的なモデルを構築し、改良します。
- タンパク質データバンクのウェブサイトで座標と構造因子の堆積を進めます。
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Representative Results
トリプトファン合成酵素のαとβサブユニットの精製
α-subunit(αSt TS)およびサルモネラ・チフィムリウム・トリプトファンシンターゼのβサブユニット(β StTS)を、改変pET SUMOベクター中でサブクローニングした。 図1Aは、His6-SUMO-α St TS(lane αON)およびHis6-SUMO-β St TS(レーンβON)融合タンパク質に対応する2つの強いバンドの代表的なSDS-PAGE結果を示す。本研究で説明した精製プロトコルにより、2日以内に両方のサブユニットを個別に精製することができた。最初の日は、Ni-NTAアフィニティクロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿、続いてHis-SUMOタグ切断、His-SUMOタグの痕跡の除去、およびタンパク質濃度によって各タンパク質を精製するために使用されました。図1B及び図1Cは、それぞれαサブユニット及びβサブユニット精製の代表的なSDS-PAGEの結果を示す。2日目には、αサブユニットとβサブユニットから濃縮αサブユニット、βサブユニット、およびα 2stTS複合体をβ 2個のサイズ除外クロマトグラフィーカラムにロードした。図1Dは、S-200HRサイズ排除カラム上のαStTS、β StTS、およびα 2 β 2stTS複合体の典型的な溶出プロファイルを示す。図1Eは、収集されたピーク分数の代表的なSDS-PAGE結果を示す。最も純粋なピーク画分をプールし、濃縮し、α 2 β StTS複合体をタンパク質結晶化研究に使用した。
野生型と変異型α 2 β StTS複合体の精製
α 2 β 2S.チプトファン合成複合体の野生型および変異型を精製する別の迅速かつ効率的なプロトコルが、本研究に記載されている。図2は、α-およびβ-subunits22に対する野生型の翻訳結合遺伝子(trpAおよびtrpB)コードを含むpEBA-10構築物の表現を示す。 α 2stTS複合体の変異型を生成する2段階pcr変異生成プロトコルβ図3に示す。
pEBA10における変異α 2 β 2St TS複合体の符号化領域を、DNAシーケンシングによって確認し、大腸菌株CB149細胞26を変換するために使用した。α 2 β 2StTS複合体の野生型および変異型を過剰発現し、組換えタンパク質を1〜2日以内に正常に精製した。室温での硫酸アンモニウム分画は、異種発現系から汚染物質タンパク質の大部分を容易に除去した(図4A、レーン20P、30P及び40S)。HiPrep 16/60 セファクリルS-200HRサイズ排除クロマトグラフィーカラム上にα 2 β 2StTS(143.06 kDa)複合体の相対溶出位置を有する代表的な溶出プロファイルを図4Bに示す。除外されたピーク画分の純度を、プール前にSDS-PAGE分析した(図4C)。
野生型と変異型α 2 β 2トリプトファン合成合成結晶の最適化
野生型および変異型α 2 β 2StTScomplexのアリコートを15mgml-1で、24ウェル座り落とし板を設置するために使用した。典型的には、5μLタンパク質溶液と貯蔵液の同等量からなる液滴を、500μLのリザーバ溶液に対して平衡化した(図5)。スペルミンは、野生型および変異型α 2 β St TS複合体22を結晶化するために必要とされる。野生型を結晶化するスペルミンの最終濃度は2mMであるが、本研究では変異複合体を結晶化するスペルミンの濃度がわずかに高いことが示された(4〜8mM)。
大きな単結晶は、PEG8000(6-11%)およびビシン緩衝液pHを変化させる微細結晶化最適化を通じて得られた。異なる形態の結晶は2-5日で出現し、結晶は2週間以内にフルサイズに成長した(図6)。X線回折データ収集の前に、結晶を凍結保護剤溶液(30%以上のジメチルスルホキシドを含むリザーババッファー)に浸漬した。最適化されたプロセスにより、近原子分解能でX線回折測定に適した品質の結晶が得られた。
X線回折データ解析
野生型α 2β stTS複合体α結晶構造を、本稿で説明した方法で作製し、X線回折データを原子分解能に近い形で収集した。結晶をF9阻害剤({{4-(トリフルロメトキシ)フェニル[スルホニル}アミノ)エチルジヒドロリン酸)およびL-トリプトファンを含有する凍結保護溶液に浸漬した。
完全なX線回折データセットは、0.5°の増分で結晶を360°回転させることによって、高度光源(Berkeley-CA)のSIBYLSシンクロトロンビームライン12.3.1で収集されました。X線回折強度を処理し、データ収集統計を表1にまとめた。対称性分析は、結晶がモノクリニック空間群C2に属していることを示す。単位セルパラメータは、a = 182.55、b = 59.30、c = 67.37Å、α = 90.00、β = 94.82、γ = 90.00°です。 マシューズ係数の計算値(Vm = 2.57 Å3 Da-1)は、52.08%35,36の溶媒含有量を有する結晶の非対称単位における1つのTSヘテロ二量体分子(αβ StTS)の存在を示唆している。すべてのX線データを低温(100K)で収集し、回折品質を向上させ、放射線減衰を減少させた。複合体中 βのα 22stTS結晶構造は、金属配位部位のα部位およびセシウムイオンにおける阻害剤F9と複合体で野生型αβSt TSモデルを用いた分子置換法によって解けた(PDB IDコード:4HT3)。 最終的な座標ファイルと構造因子は、PDBに加盟コード5CGQを付けて預託した(図7A)。野生型α 2 β 2StTS複合体の結晶構造は、酵素α部位(図7B)、金属配位部位(図7C)におけるセシウムイオン、補因子ピリドキサール5'リン酸共価結合βLys87(図7D)、および酵素β部位のL-トリプトファン(図7E)で18解像した。モデル5CGQは、現在までにPDBに堆積した2 β 2stTS結晶構造の最高分解能αである。
図1:αおよびβサブユニットとα 2 β StTS複合体の精製。(A)組換えタンパク質発現。12%SDS-PAGEゲルは、30°CでのIPTG誘導後のSUMO-α StTS(αON)およびSUMO-β StTS(βON)の一晩の発現プロファイルの(α/β0前のIPTG誘導)(B, C)Ni-NTAアフィニティクロマトグラフィーに続いて硫酸アンモニウム沈殿(60%飽和)、(S)精製粗エキス(FT1)Ni-NTAカラムスルーサンプル(W)カラム洗浄サンプル(E)溶出サンプル(60S)および(60P)高速遠心分離後の上清および沈殿画画、 それぞれ(D)SUMO-プロテアーゼ消化生成物(FT2)Ni-NTAカラムは、St TSまたはβ StTSサブユニット αを含むサンプルを通過する。(D)α StTS サブユニット (28.67 kDa)、βStTS サブユニット (42.86 kDa)、および hiPrep 16/60 セファクリル S-200 HR サイズ除外クロマトグラフィーカラムを備えた α2β2StTS コンプレックス (143.06 kDa) の溶出プロファイル。各実行は別々に実行されました。(E)個々のクロマトグラフィーから除外されたピーク画分の SDS-PAGE ゲル。15%のSDS-PAGEゲルは、α 2 β 2StTS複合体およびα StTSサブユニットを分析するために調製されたが、12%のSDS-PAGEゲルは、β St TSサブユニットを分析するために調製された。レーンMW、kDaの分子量マーカー。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:構築物pEBA-10の表現。(A)αをコードする野生型の翻訳結合遺伝子(trpAおよびtrpB)の表現 - およびβ-サルモネラ属腸内細菌由来のトリプトファンシンターゼのサブユニット(ヤン、アフメドら1996)。(B)ベクターは、アンピシリン耐性(amp)遺伝子、複製起源(ori)、LACI q遺伝子、IPTG誘導体がない場合にlacプロモーターをより良くシャットダウンするlacIq遺伝子、およびLacI抑圧されたプロモーターを含み、この図のより大きなバージョンを見るにはここをクリックしてください。
図3:2段階PCR変異生成プロトコルの全体表現。pEBA-10ベクターをDNA鋳型として用いた。PCRの第1ラウンドは、第1のフラグメントおよびプライマーTS-Rev-SacIおよびMUT-FW(変異を含む前進プライマー)を生成するためにプライマーTS-FW-NcoIおよびMUT-REV(変異を含む前方プライマー)を用いて調製し、第2のフラグメントを生成する。断片をゲル精製し、等量結合し、熱変性、およびアニールした。組換えストランドをポリメラーゼおよびデオキシリボヌクレオチドで拡張した。PCRの第2ラウンドはプライマーTS-FW-NcoIおよびTS-Rev-SacIで調製した。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:野生型及び変異型の精製2 β 2StTS複合体をα。 (A)硫酸アンモニウム沈殿に沿って集めたサンプルの12%SDS-PAGEゲルを室温で20、30、40、50%の硫酸アンモニウム飽和度を使用した:(CE)粗抽出物(S)および(P)上清及び沈殿画分を高速遠心後。(B) Α2β2StTS (143.06 kDa) 複合体の溶出プロファイルを HiPrep 16/60 セファクリル S-200 HR サイズ排除クロマトグラフィーカラム.(C)12% SDS-PAGEゲル画像を除外したピーク画分.レーンMW、kDaの分子量マーカー(精密プラスタンパク質未染色基準、バイオ・ラッド)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:野生型および変異型のα 2 β StTS複合体に対する結晶化最適化。結晶は、50 mMCsCl2を含む50mMビシンCsOH緩衝液中で成長した。ポリエチレングリコール8000(6-11%)およびスペルミン(2-8 mM)の濃度を変化させて、X線タンパク質結晶学による構造研究を行う単一の大きな結晶形態を得た。(A) ビシン CsOH, pH 7.6.(B) ビシン CsOH, pH 7.8.(C) ビシン CsOH, pH 8.0.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:野生型及び変異型の結晶のフォト顕微鏡写真 α 2 β 2StTS複合体。結晶は形態が異なりますが、それらは宇宙グループC2に属しています。結晶は2週間後の最終条件で完全な寸法に成長しました。約0.20 x 0.15 x 0.10 mmの大きさの結晶。(A-D)PLPホロ結晶は、野生型形態の金属配位部位(列A)におけるセシウムイオンとの複合体、変異型α 2 β 2βQ114A(列B)、α 2 β 2βK167T(列C)、およびα 2 β 2βS377A(列D)を有する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:結晶構造の微細化後に得られた電子密度マップの結晶構造と検証の全体の可視化(a)野生型α 2 β 2St TS複合体を酵素α部位(黄色色)、金属配位部位(青色)でセシウムイオン、補因子ピリドキサール5'リン酸共有結合結合βLys87(緑色)、1800年に18分の1でゼロβゼラ(シアン)の生成物L-トリプトファンを有する。αサブユニットは水色で着色されていますが、βサブユニットはサーモンで着色されています。(B-E)電子密度マップは、(B)阻害剤F9(C)セシウムイオン(D)ピリドキサール-5′リン酸塩、および(E)L-トリプトファンの周りの1.0 r.m.s.レベルで輪郭を描いた。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| データ収集と処理 | |
| X線源/ビームライン | ALSビームライン 12.3.1 |
| 波長(Å) | 10,000 |
| 解像度 (Å) | 40.00 - 1.18 (1.24 - 1.18) |
| 反射の総数 | 2151280 (252941) |
| 一意の反射の合計数 | 231646 (32187) |
| インデックス作成、スケーリング、マージ用のスペースグループ | C 1 2 1 |
| セルの寸法 | |
| a, b, c (Å) | 182.55, 59.30, 67.37 |
| α, β, γ (°) | 90.00, 94.82, 90.00 |
| モザイク性 | 0.61 |
| マシューズ ボリューム VM (Å3 Da-1) | 2.57 |
| ルメス (%) | 8.6 (93.0) |
| 14.7 (3.0) | |
| CC1/2 (%) | 0.999 (0.778) |
| 完全性 (%) | 98.6 (94.2) |
| 多様 性 | 9.3 (7.9) |
| 絞り込み統計 | |
| 工数/ルフリー (%) | 14.04 / 16.05 |
| RMSD ボンド長さ (Å) | 0.0120 |
| RMSD ボンド角度 (°) | 14,059 |
| ラマチャンドランが好んだ | 515 (96.44%) |
| ラマチャンドラン許可 | 16 (3.00%) |
| ラマチャンドランは許可されていない | 3 (0.56%) |
表 1: データ収集および処理かっこ内の値は、外側のシェルに対して使用されます。
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Discussion
2 β 2 βの変異型α、α 2 β 2βK167T、α 2 β 2βS377A StTS複合体の構造機能相関研究に成功しました。 当初、我々は、精製中にPEG8000とスペルミンでα 2 β 2StTS複合体結晶化を必要とする以前の精製プロトコル22を用いて変異体を精製しようと試みた。結晶化速度は、変異体の形態および溶液中の複合体の濃度に依存するが、結晶が大きな溶液体積に現れる時期を予測することは困難である。結晶化は、長い期間(48-96時間)後、または結晶化開始15後にPEG 8000の余分な量を添加する必要があるいずれかの達成することができる。
残念ながら、本研究で提示された2stTS複合体β α 2の変異形態は、プロトコルの初期ステップ中に結晶化に失敗し、結晶学的研究を損なうため、このプロトコルを使用して正常に精製されなかった。そこで、硫酸アンモニウム分画とサイズ排除クロマトグラフィーからなるシンプルで効率的な精製プロトコルを作成し、野生型の高い収率を与え、2stTS複合体α 2 β変異型を生成しました。このプロトコルは、結晶化の要件や精製に伴うプロトコルのトラブルシューティングがないため、以前のプロトコル(5-7日)15、22と比較すると高速(1〜2日)、再現性があります。さらに、我々は、分離物から2stTS複合体をβ αサブユニット、βサブユニットおよび再構成αを大量に精製するための新しい発現構造とプロトコルを作成しました。
将来のアプリケーションは、機能および構造研究を行うために野生型および変異体サブユニットの組み換えが含まれる。変異体α 2 β 2βQ114A、α 2 β 2βK167T、およびα 2 β 2βS377A複合体は、野生型形態(2mM)と比較した場合に、より高濃度のスペルミン(4〜8mM)を含む条件で結晶化した。 したがって、pHの沈殿物と緩衝液の濃度を変化させることによって、タンパク質結晶の品質を向上させるのに時間を費やす価値があります。単一の大きな結晶形は、6-11%PEG8,000を含むビシン緩衝溶液(pH 7.6-8.0)で無作為に成長した。本研究で説明する方法は、αおよびβ活性部位内の異なるリガンドを有するα 2 β 2複合体の結晶構造を調製するために使用され、インドールおよびセリンのトリプトファンへの変換に関与する異なる中間体および遷移状態を模倣する。これらの変異体の結晶構造は、L-トリプトファン合成における主要な残基が果たすメカニズムと役割に関する新たな洞察を提供することが期待される。
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Disclosures
著者らは、競合する金銭的利益を開示し、宣言するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、米国国立衛生研究所(GM097569)によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL 10 kDa filter | MilliporeSigma | UFC901024 | centrifugal filter unit |
| 15 mL 100 kDa filter | MilliporeSigma | UFC910024 | centrifugal filter unit |
| 2 mL cryogenic vials | Corning | CLS430489 | Cryogenic vials |
| 2 mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-141 | microcentrifuge tubes |
| 24-well Cryschem Plate | Hampton Research | HR3-158 | 24-well sitting drop plates |
| 2-mercaptoethanol | Fisher Scientific | O3446I-100 | Chemical |
| 50 mL centrifuge conical tubes | Thermo Scientific | 12-565-270 | centrifuge conical tubes |
| AB15 ACCUMET Basic | Fisher Scientific | 13-636-AB15 | pH meter |
| Agarose | Fisher Scientific | BP1356-100 | Agarose gel |
| ammonium sulfate | Fisher Scientific | A702-500 | Chemical |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | Antibiotic |
| Bacterial incubator | Fisher Scientific | S35836 | incubator. |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | Restriction enzyme |
| bicine | Fisher Scientific | BP2646100 | Chemical |
| Branson 450 Digital Sonifier | Brason | B450 | Cell disruptor |
| Cesium chloride | Fisher Scientific | BP210-100 | Chemical |
| Cesium hydroxide | Acros Organics | AC213601000 | Chemical |
| Chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904-100 | Antibiotic |
| dimethyl sulfoxide | Fisher Scientific | D1391 | Chemical |
| dithiothreitol | Fisher Scientific | BP172-5 | Chemical |
| DNA Polymerase | Thermo Scientific | F530S | HF polymerase |
| dNTP Set | Invitrogen | 10-297-018 | dNTPs set |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | Restriction enzyme |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher Scientific | S311-100 | Chemical |
| Excella E25R Orbital Shaker | Eppendorf New Brunswick | M1353-0004 | Orbital incubator |
| GE AKTA Prime Plus | GE Healthcare | 8149-30-0004 | FPLC |
| Gel Extraction Kit | Invitrogen | K210012 | DNA purification kit |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | Chemical |
| HindIII | New England Biolabs | R0104S | Restriction enzyme |
| His-Trap columns | GE Healthcare | GE17-5255-01 | 5 mL Histrap column |
| imidazole | Fisher Scientific | O3196-500 | Chemical |
| IPTG | Thermo Fisher Scientific | R0392 | Inducer |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906-5 | Antibiotic |
| Kelvinator Series-100 | Kelvinator | discontinued | Ultra low freezer |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | Liquid broth |
| Luria Bertani agar | Fisher Scientific | BP1425-2 | Solid broth |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | Chemical |
| NcoI | New England Biolabs | R0193S | Restriction enzyme |
| Ni-NTA affinity beads | Thermo Fisher Scientific | R90115 | Ni-NTA agarose beads |
| PEG 8000 | Fisher Scientific | BP233-100 | Chemical |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Fisher Scientific | 44-865-0 | Chemical |
| pyridoxal phosphate | Acros Organics | AC228170010 | Chemical |
| S-200 HR | Cytiva | 45-000-196 | Size exclusion column |
| SacI | New England Biolabs | R0156S | Restriction enzyme |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | Chemical |
| Sorvall RC-5B centrifuge | Sorvall | 8327-30-1004 | Floor cetrifuge |
| Spermine | Acros Organics | AC132750010 | Chemical |
| Superdex 200 prep grade | Cytiva | 45-002-491 | Size exclusion column |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202S | DNA liagse |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-500 | Chemical |
| Ubl-specific protease 1 | Thermo Scientific | 12588018 | SUMO Protease |
References
- Miles, E. W. Tryptophan synthase: a multienzyme complex with an intramolecular tunnel. Chemical Record. 1 (2), 140-151 (2001).
- Raboni, S., Bettati, S., Mozzarelli, A. Tryptophan synthase: a mine for enzymologists. Cellular and Molecular Life. 66 (14), 2391-2403 (2009).
- Dunn, M. F. Allosteric regulation of substrate channeling and catalysis in the tryptophan synthase bienzyme complex. Archives of Biochemistry and Biophysics. 519 (2), 154-166 (2012).
- Chaudhary, K., Roos, D. S. Protozoan genomics for drug discovery. Nature Biotechnology. 23 (9), 1089-1091 (2005).
- Caldwell, H. D., et al. Polymorphisms in Chlamydia trachomatis tryptophan synthase genes differentiate between genital and ocular isolates. Journal of Clinical Investigation. 111 (11), 1757-1769 (2003).
- Kulik, V., et al. On the structural basis of the catalytic mechanism and the regulation of the alpha subunit of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium and BX1 from maize, two evolutionarily related enzymes. Journal of Molecular Biology. 352 (3), 608-620 (2005).
- Barends, T. R., et al. Structure and mechanistic implications of a tryptophan synthase quinonoid intermediate. Chembiochem. 9 (7), 1024-1028 (2008).
- Hatanaka, M., White, E. A., Horibata, K., Crawford, I. P. A study of the catalytic properties of Escherichia coli tryptophan synthetase, a two-component enzyme. Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 596-606 (1962).
- Henning, U., Helinski, D. R., Chao, F. C., Yanofsky, C. The A protein of the tryptophan synthetase of Escherichia coli. Purification, crystallization, and composition studies. Journal of Biological Chemistry. 237, 1523-1530 (1962).
- Wilson, D. A., Crawford, I. P. Purification and properties of the B component of Escherichia coli tryptophan synthetase. Journal of Biological Chemistry. 240 (12), 4801-4808 (1965).
- Adachi, O., Miles, E. W. A rapid method for preparing crystalline beta 2 subunit of tryptophan synthetase of Escherichia coli in high yield. Journal of Biological Chemistry. 249 (17), 5430-5434 (1974).
- Adachi, O., Kohn, L. D., Miles, E. W. Crystalline alpha2 beta2 complexes of tryptophan synthetase of Escherichia coli. A comparison between the native complex and the reconstituted complex. Journal of Biological Chemistry. 249 (24), 7756-7763 (1974).
- Higgins, W., Fairwell, T., Miles, E. W. An active proteolytic derivative of the alpha subunit of tryptophan synthase. Identification of the site of cleavage and characterization of the fragments. Biochemistry. 18 (22), 4827-4835 (1979).
- Ahmed, S. A., Miles, E. W., Davies, D. R. Crystallization and preliminary X-ray crystallographic data of the tryptophan synthase alpha 2 beta 2 complex from Salmonella typhimurium. Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3716-3718 (1985).
- Miles, E. W., et al. The beta subunit of tryptophan synthase. Clarification of the roles of histidine 86, lysine 87, arginine 148, cysteine 170, and cysteine 230. Journal of Biological Chemistry. 264 (11), 6280-6287 (1989).
- Rhee, S., Parris, K. D., Ahmed, S. A., Miles, E. W., Davies, D. R. Exchange of K+ or Cs+ for Na+ induces local and long-range changes in the three-dimensional structure of the tryptophan synthase alpha2beta2 complex. Biochemistry. 35 (13), 4211-4221 (1996).
- Rhee, S., et al. Crystal structures of a mutant (betaK87T) tryptophan synthase alpha2beta2 complex with ligands bound to the active sites of the alpha- and beta-subunits reveal ligand-induced conformational changes. Biochemistry. 36 (25), 7664-7680 (1997).
- Schneider, T. R., et al. Loop closure and intersubunit communication in tryptophan synthase. Biochemistry. 37 (16), 5394-5406 (1998).
- Rhee, S., Miles, E. W., Davies, D. R. Cryo-crystallography of a true substrate, indole-3-glycerol phosphate, bound to a mutant (alphaD60N) tryptophan synthase alpha2beta2 complex reveals the correct orientation of active site alphaGlu49. Journal of Biological Chemistry. 273 (15), 8553-8555 (1998).
- Weyand, M., Schlichting, I. Crystal structure of wild-type tryptophan synthase complexed with the natural substrate indole-3-glycerol phosphate. Biochemistry. 38 (50), 16469-16480 (1999).
- Sachpatzidis, A., et al. Crystallographic studies of phosphonate-based alpha-reaction transition-state analogues complexed to tryptophan synthase. Biochemistry. 38 (39), 12665-12674 (1999).
- Yang, L. H., Ahmed, S. A., Miles, E. W. PCR mutagenesis and overexpression of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium: On the roles of beta (2) subunit Lys-382. Protein Expression and Purification. 8 (2), 126-136 (1996).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2012).
- Lowry, O. H., et al.
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Kawasaki, H., Bauerle, R., Zon, G., Ahmed, S. A., Miles, E. W. Site-specific mutagenesis of the alpha subunit of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium. Changing arginine 179 to leucine alters the reciprocal transmission of substrate-induced conformational changes between the alpha and beta 2 subunits. Journal of Biological Chemistry. 262 (22), 10678-10683 (1987).
- Battye, T. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. iMOSFLM: a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 67, Pt 4 271-281 (2011).
- Evans, P. Scaling and Assessment of Data Quality. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 62, Pt 1 72-82 (2006).
- Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 67, 235-242 (2011).
- Vagin, A., Teplyakov, A.
- Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, Pt 2 213-221 (2010).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K.
- Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 53, Pt 3 240-255 (1997).
- Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 68, Pt 4 352-367 (2012).
- Matthews, B. W.
- Kantardjieff, K. A., Matthews Rupp, B. coefficient probabilities: Improved estimates for unit cell contents of proteins, DNA, and protein-nucleic acid complex crystals. Protein Science. 12 (9), 1865-1871 (2003).
