Summary
Vi beskriver forberedelsen af bånd af serielle sektioner og deres samling på stor overførsel støtte til brug som Array Tomography prøver, sammen med automatiserede billedbehandling procedurer i en scanning elektron mikroskop. Protokollen tillader screening, hentning og målrettet billeddannelse af lokale, sjældne hændelser og erhvervelse af store datamængder.
Abstract
Elektronmikroskopi påføres i biologi og medicin til billeddannelse af cellulære og strukturelle detaljer ved nanometeropløsning. Historisk set har Transmission Electron Microscopy (TEM) givet indsigt i celle ultrastruktur, men i det seneste årti har udviklingen af moderne Scanning Electron Microscopes (SEM) ændret måden at se inde i cellerne. Selv om opløsningen af TEM er overlegen, når protein-niveau strukturelle detaljer er nødvendige, SEM-opløsning er tilstrækkelig til de fleste af de organelle-niveau cellebiologi-relaterede spørgsmål. Udviklingen inden for teknologi muliggjorde automatiske volumenopsamlingsløsninger som Serial block-face imaging (SBF-SEM) og Focused ion beam SEM (FIB-SEM). Ikke desto mindre forbliver disse metoder den dag i dag ineffektive, når identifikation og navigation til interesseområder er afgørende. Uden midler til præcis lokalisering af målområder før billeddannelse skal operatørerne erhverve meget flere data, end de har brug for (i SBF-SEM), eller endnu værre forberede mange gitre og afbilde dem alle (i TEM). Vi foreslår strategien med "lateral screening" ved hjælp af Array Tomography i SEM, som letter lokaliseringen af interesseområder, efterfulgt af automatiseret billeddannelse af den relevante brøkdel af det samlede prøvevolumen. Arraytomografiprøver bevares under billeddannelse, og de kan arrangeres i sektionsbiblioteker, der er klar til gentagen billedbehandling. Flere eksempler er vist, hvor lateral screening gør det muligt for os at analysere strukturelle detaljer, der er utroligt udfordrende at få adgang til med enhver anden metode.
Introduction
På trods af betydningen af EM-relaterede teknikker holder den indsats, der kræves for at mestre dem, hele området begrænset til et lille antal specialister. Et væsentligt problem er identifikation og hentning af en region af interesse (ROI) i prøverne bevaret for EM. Udseendet af den samme prøve adskiller sig betydeligt, når den analyseres ved optisk mikroskopi og efter behandling til EM-observation. Ændringerne for kemisk forberedte prøver omfatter anisotropisk prøve krympning efter dehydrering trin (~ 10% i hver dimension) og tab af fluorescens ved brug af osmium i fiksering og farvning protokol (Figur 1A). For ultratynde afsnit, prøverne er indlejret i epoxy eller akryl harpikser ved hjælp af forskellige strategier (Figur 1B). For at opnå vellykkede resultater af dette præparat skal hele prøven være fraktioneret i stykker, der ikke overstiger 1 mm x 1 mm. For at opfylde standardkravene til TEM(Transmission Electron Microscopy) er denne lille del af prøven yderligere opdelt til 50-150 nm tykke skiver. De resulterende gråtonebilleder viser vævsorganisation og organellestruktur på en minutfraktion af hele prøven mere detaljeret end nogen anden mikroskopiteknik (Figur 1C). Et typisk TEM datasæt giver 2D-information, teoretisk ekstrapoleret til at forstå de processer, der naturligt forekommer i et 3D-rum i celler og væv. Figur 1D udgør udfordringen ved erhvervelse af ultrastrukturelle mængder: Hvis en terning på side 1.000 μm er opdelt ved 50 nm tykkelse, kræves der 20.000 sektioner til at dække hele volumen; for en 500 μm sidekube, vil det være 10.000 sektioner. For at dække et volumen på 50 μm x 50 μm x 50 μm kan det være nødvendigt med 1.000 sektioner "kun". At opnå dette volumen manuelt er praktisk talt umuligt og ekstremt udfordrende at udføre med automatisering. Hvis vi ud over prøvedybden skal dække hele overfladen af sådanne hypotetiske terninger, bliver dækningen af 1 μm2 overflade ved rimelig opløsning et alvorligt logistisk problem (figur 1E). Selv om det store antal sektioner for de ekstraordinære store projekter, såsom connectomics-tilgange, er afgørende for de fleste "verdslige" EM-projekter, udgør det en betydelig ulempe at generere flere sektioner, der er nødvendige for observationen.
Der er flere metoder til at erhverve 3D ultrastrukturelle oplysninger: seriel afsnit Transmission Electron Microscopy (TEM), TEM tomografi, Array Tomography (AT), Serial Block Face Imaging Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM), og Fokuseret Ion Beam Scanning ElektronMikroskopi (FIB-SEM). De væsentligste forskelle mellem disse metoder er sektionsstrategien , og om billedopsamlingen er koblet til sektionsgenerering1. I seriel afsnit TEM indsamles sekventielle sektioner på slotgitre, TEM-afbildninger genereres fra disse sekvenser og justeres2,3,4,5. I TEM-tomografi giver vippeserier fra 150-300 nm sektioner på et gitter, og når de kombineres med seriel sektion, en meget høj opløsning, men relativt små mængder6,7,8. AT-tilgangen bruger fysisk sektion med forskellige manuelle og halvautomatiske manerer af sektioner, der er samlet på relativt stor støtte, såsom glasovertræk, silicium wafers eller et specielt bånd. Til billedopsamling analyseres supporten i SEM, med forskellige strategier for billedopsamling er tilgængelige9,10,11,12,13,14,15 . For SBF-SEM opnås fysisk sektion ved hjælp af en minimikrotom med en diamantkniv, der er indstillet direkte inde i SEM-kammeret, med SEM-billedet genereret fra overfladen af harpiksblokken16,17,18,19. For FIB-SEM fjerner ionkilden tynde lag af prøven efterfulgt af automatisk billeddannelse af den eksponerede overflade af SEM20,21. TEM-tomografi og AT generere fysiske sektioner, som kan re-billederes, hvis det er nødvendigt, mens FSBF-SEM og FIB-SEM fjerne afsnittet efter billeddannelse. En nylig kombination af fysiske sektioner afbildet af en multi-beam SEM giver en kombination af metoder, der løser "flaskehals" spørgsmålet om hastigheden af billedet erhvervelse22. Hver af disse teknikker har revolutioneret den måde, EM-data kan indhentes og analyseres på, og hver tilgang har sine praktiske virkninger relateret til et givet forskningsspørgsmål.
I betragtning af præparatets art og omfanget af de ultrastrukturelle dimensioner er det ikke ligetil at forudsige, hvor en bestemt målstruktur er placeret i prøveblokken (Figur1D, E). En løsning til ROI lokalisering er at optage billederne fra hele blokken i den ønskede opløsning fra begyndelsen. Interessestrukturerne kan være i den erhvervede datamængde, når de er væk fra mikroskopet. Anskaffelsestid og datahåndtering i forbindelse med denne strategi er problematisk. Det er ønskeligt at reducere mængden af registrerede data, især hvis INVESTERINGSAFKAST'erne er meget mindre end vævsblokken, dvs. hvis objekter af interesse er specifikke typer celler (ikke hele organer). Forskellige korrelative lys - og elektronmikroskopiteknikker (CLEM) kan lykkes , når fluorescensen bevares og lokaliseres før eller efter tilberedningen inden for samme prøve23,24,25,26,27,28,29. Ikke desto mindre er mange cellulære strukturer genkendelige selv uden fluorescens korrelation, kun baseret på den kendte ultrastruktur. I disse tilfælde mener vi, at lateral screening Array Tomography giver en balance mellem indsatsen investeret i ROI lokalisering og den ultrastrukturelle informationskvalitet. Ved hjælp af denne strategi screenes et undersæt af sektioner på waferen med jævne mellemrum, som kan etableres baseret på INVESTERINGSAFKAST'ets størrelse og natur. Når investeringsafkast er fundet, konfigureres dataindsamlingen i en kontinuerlig række sektioner, der starter før og slutter efter ankersektionen, og indsamler de relevante oplysninger målrettet.
Vi præsenterer protokoller for AT, der forenkler og fremskynder erhvervelsen af regioner eller begivenheder af interesse i mange sektioner og giver bedre afstemt billedvolumener. Lateral screening og erhvervelse af flere skridt producerer data med meget høj opløsning i netop målrettede regioner. Den procedure, vi beskriver, løser flere udfordringer ved 3D EM-dataindsamling, som den giver: kompatibilitet med en bred vifte af prøver uden grundlæggende at ændre arbejdsgangen for prøveforberedelse; målrettet lokalisering af lokaliseringer og SEM-erhvervelser reduceret tid og kræfter under installationen; billedbehandling af områder i flere sektioner med bedre tilpasning af de resulterende diskenheder; og en glat syning og justering procedure for at kompilere forskellige billeder i en syet mosaik billede. Vi valgte at demonstrere styrken af vores metode med flere prøver fra offentliggjorte og igangværende projekter. Vi mener, at denne tilgang i høj grad kan lette generering og erhvervelse af målrettede EM-data, selv for efterforskere med begrænset EM-erfaring.
Protocol
BEMÆRK: Prøveforberedelsesmetoder er beskrevet andetsteds14,30,31og er ikke omfattet af denne publikation. Kort sagt, de viste eksempler var kemisk fastgjort med glutaraldehyd, post-fast med 1% OsO4, derefter behandlet med 1% vandig uranylacetat før indlejring i integrer harpiks. Alternativt kan prøver fremstilles ved hjælp af højtryksfrysning, fryse erstattet med 0,1% uranylacetat i acetone og indlejret i akrylharpiks. Prøveblokke blev udarbejdet ved hjælp af en flad indlejringsmetode, der gør det muligt at se prøven klart, hvilket letter dens orientering for afsnittet (figur 1B).
1. Arraygenereringsprocedure
- Integreret eksempelretning og trimning
- Brug kikkerten/mikroskopet til at identificere og markere investeringsafkast på den indlejrede blokoverflade ved let at ridse blokkens overflade med et barberblad. Dette vil bidrage til at orientere prøven inde i ultramicrotome og vil reducere sektionsoverfladen.
- Prøven fastspændes på ultramikrotomholderen (figur 2A).
- Trim harpiksen omkring prøven, først med barberbladet (groft trimning) og fortsæt med diamantbeskæringsværktøjet (fin trimning; Figur 2A. Brug knive med 20° eller 90° kanthældning for at sikre, at blokkens top- og bundoverflader er parallelle med knivens skærkant.
BEMÆRK: Dette trin er afgørende for seriel sektion og erhvervelse af lige bånd. - Bland xylen og lim i 3:1 proportion. Med en øjenvippe fastgjort til en tandstikker, anvende denne blanding til toppen og de nederste kanter af den trimmede blok. Lad det tørre grundigt.
- Klargør arraymonteringsstøtten A (dvs. siliciumvafler).
- Skær wafer stykket ved hjælp af en wafer kavalerering værktøj (EMS), justere sin størrelse til projektets mål. 2 cm x 4 cm er praktisk til både lys- og elektronmikroskopiobservationer.
- Rengør waferen i destilleret vand for at slippe af med resterne.
- Glødudladning/plasma rengør overfladen ved hjælp af standardudstyr. De præcise parametre afhænger af den anvendte maskine. Start med parametrene for netudladningen og empirisk justere tiden. Dette trin er afgørende for en god spredning af sektionerne på understæbningen, mens sektioner tørrer og ikke bør udelades.
- Klargør arrays monteringsstøtte B (dvs. glasfortræk)
- Hvis du planlægger multiplex immunmærkningsforsøg, skal du overføre prøverne på et coverlip for bedre at opdage fluorescenssignalet. For at forbedre coverslip klæbeevne, skal du bruge en detaljeret gelatine-belægning procedure er beskrevet tidligere9.
- Forøg ledningsevnen ved at overlægge diasene med indium-tinoxid (ITO) eller guld ved fordampning. Opbevar de forberedte dæksler i et rent miljø. Gløden udledes prøverne som beskrevet i 1.2.3.
2. Udsnit af prøven
- At kniv forberedelse
BEMÆRK: For at generere arrays skal du bruge en modificeret kniv (ATS), der er designet til at lette erhvervelsen af lange bånd. Histo-Jumbo knive eller lignende knive udtænkt til generering af sektioner på store støtter kan tjene til AT-sektionsopdelning så godt.- Fastgør nålen til bunden af kniven ved hjælp af det skummende klæbebånd og gennembor det (Figur 2B). Anbring ATS-kniven i ultramikrotomholderen ved 0°. Juster knivens kant parallelt med blokoverfladen ved hjælp af standardproceduren.
- Bring den trimmede blok til kanten af kniven i en position klar til indsnit.
- Placer wafer /coverlip inde i knivbassinet og fyld den med vand til samme niveau som knivkanten. Lad knivens diamantkant befugte ordentligt, og træk om nødvendigt vand tilbage ved hjælp af den tilhørende sprøjte (Figur 2C).
- Arraysektion og overførsel
- Indstil mikrotomen til de ønskede skæreparametre. Med ATS-kniven er rækkevidden på 50-100 nm og en skærehastighed på 0,6-1 mm/ s tilrådeligt. Start afsnit(Figur 2Di).
- Få fat i et bånd af længden, der dækker en målrettet z-volumen og stoppe samlingen. Afhængigt af vævets homogenitet, homogenitet og harpikstype vil båndet være relativt lige (Figur 2D-ii). Mange prøver vil ikke producere lige bånd, på trods af den investerede indsats, og typen af kniv bruges.
- Afhængigt af det endelige mål skal du lave et langt eller flere korte bånd justeret side om side. En 2 cm x 4 cm støtte kan nemt holde 100 til 1.000 sektioner. Arrangementet af båndet på støttetrinnet er et trin, der kræver fingerfærdighed og stabile hænder. Men indlæringskurven for denne færdighed er hurtigt erhvervet.
- Løsriv båndet fra knivkanten ved hjælp af en ren, ikke-klæbrig spids af en øjenvippe limet på tandstikkeren (Figur 2Diii).
- Brug øjenvipperne til forsigtigt at flytte båndet over midten af støttemediet. På dette tidspunkt skal du bruge kloroform eller varmepen til at strække sektionerne, hvis det er nødvendigt. Husk dog, at denne manipulation kan fremkalde båndbrud og deformation.
- Begynd at tømme vandet ved at trække i sprøjten. For mere sarte bånd eller en langsommere vand tilbagetrækning, lad vand dryppe ved at løsne sprøjten fra slangen. Når vandstanden sænkes til waferniveauet, skal du styre båndet og flytte det om nødvendigt ved forsigtigt at skubbe båndet til midten. Efter afregning af båndene på waferoverfladen skal du fortsætte med at dræne, indtil det resterende vand er helt trukket tilbage fra bassinet.
BEMÆRK: Hvis du ikke bruger den nederste vand tilbagetrækning ATS kniv, omhyggeligt reducere vandet fra siderne af ATS kniven for ikke at fremkalde turbulens. - Lad sektionerne stå på støtten inde i badet for at lade tørre helt. Afhængigt af hydrofobicity af støtte og miljømæssig luftfugtighed, vil vand fordampe med en anden hastighed (Figur 2Div). Det er vigtigt at lade prøven tørre langsomt for at mindske eller helt undgå alle folder på prøven.
- Den tørre prøve overføres til en tæt lukket kasse for at beskytte mod snavsforurening, og den anbringes i en 60 °C ovn i mindst 30 min. Hvis det er nødvendigt, counterstain sektioner ved hjælp af tungmetaller til at øge den samlede kontrast.
- Ved afslutningen af proceduren skal kniven forsigtigt rengøres efter producentens anvisninger
BEMÆRK: Overførslen af flere eller serielle sektioner på en wafer (Figur 2E) i forhold til overførslen på et slotnet (Figur 2F) ændrer EM-forberedelsesoplevelsen fuldstændigt. Den uafbrudte afsnit og samling af sektionerne på enkelt support reducerer mængden af sektionsopdel og sektionssamling relaterede fejl, der hyppige i seriel sektionsopsnit. Svarende til 100 sektioner på 1000 μm x 500 μm indsamlet på en wafer svarer til 33 slotgitre (figur 2G).
3. Prøveobservation
BEMÆRK: I dette afsnit beskrives arbejdsgangstrinnene som implementeret ved hjælp af en kommercielt tilgængelig software (se Materialetabel). Enhver billedopsamlingssoftware på enhver SEM, der er udstyret med de korrekte detektorer, kan bruges, men de specifikke brugerhandlinger vil variere og vil ofte være mere manuelle.
- Få et oversigtskort over SEM-billeder, der afslører sektionsplaceringer på waferen. Et indbygget optisk kamerabillede hjælper med at definere en SEM-billedmosaik, der dækker et bånd af sektioner eller alle sektioner. Opret mosaikken ved at klikke med musen lige på kameraet billedet af prøven og starte automatisk erhvervelse.
BEMÆRK: Meget grove billeddannelsesindstillinger, dvs. 1-2 μm pixelstørrelse og 1 μs, er tilstrækkelig. Denne proces er illustreret i supplerende materiale (side 2-7). - Find sektioner med funktionen Automatisk registrering af sektionssøgning, eller find dem manuelt. Sektionsplaceringer og dispositioner hentes automatisk med denne software baseret på billedmatchning. For illustration af denne proces henvises til supplerende materiale (side 8 - 15).
- Hvis oversigtsbillederne ikke viser ROI'er klart, skal du anskaffe billeder af sektioner med højere opløsning. Brug funktionen Sektionseksempel til at oprette og hente billeder automatisk. Denne proces er illustreret i Supplerende Materiale, side 16-18. Billedbehandlingsindstillinger skal vælges i henhold til arten og størrelsen af det investeringsafkast, som brugeren søger efter.
- Hvis du vil finde optimale indstillinger, skal du aktivere Live Imaging i mikroskopstyringssoftwaren og navigere til ét investeringsafkast. Ændre billedindstillingerne, indtil billederne viser INVESTERINGSAFKAST tydeligt, men billedopsamlingen er ikke for lang.
- Definer billedområder
BEMÆRK: Der foreslås flere forskellige strategier.- Hvis der kun er nogle få sektioner, der skal afbildes, skal du bruge billederne af sektioner, der er oprettet indtil videre, til at navigere til de relevante sektioner og bruge Zoomable Viewer, der viser alle erhvervede billeder på deres oprindelige relative placeringer, til at se på alle sektioner. Når der er fundet en sektion, der skal afbildes i høj opløsning, skal du oprette et billedområde med klik-træk. Vælg billedindstillinger i høj opløsning, og gem indstillingerne i en skabelon. Genbrug denne skabelon til yderligere sektioner.
- Hvis du vil finde særligt små eller svære at opdage sjældne hændelser, skal du bruge Lateral Screening-tilgangen. Opret manuelt et billedområde med billedindstillinger i høj opløsning på hver tiende sektion eller på et afsnit pr. bånd, og hent billederne. Gennemgå de billeder og markere sektioner, der indeholder investeringsafkast i softwaren eller tage en note.
- Start fra sektioner, der indeholder investeringsafkast, skal du navigere frem og tilbage gennem sektionssættet og oprette billedområder med høj opløsning på de samme relative placeringer, så længe strukturen stadig er synlig i sektionen. Dette kan gøres manuelt eller ved hjælp af den procedure, der er beskrevet i de næste trin.
- Hent billeder i mere end ti på hinanden følgende sektioner. Klik på Startplaceringsjustering efter zoom på billedet for at øge præcisionen af registrerede sektionsplaceringer som beskrevet i manualen. Dette reducerer billedseriens position variabilitet. Proceduren er illustreret og forklaret i supplerende materiale side 19-21.
- Klik på en sektion for at definere et billedområde, mens du holder Alt-tasten nede, og vælg Opret feltsætmatrix i genvejsmenuen, der åbnes, når museknappen slippes. Softwaren opretter derefter billedområder på samme relative placering i alle sektioner, der er fundet eller markeret tidligere. Det er muligt at begrænse billeddannelse til et bestemt område af sektioner med skyderen Sektionsspænd.
BEMÆRK: Denne procedure kan gentages med et vilkårligt antal billedområder og gør det derfor muligt at optage mange små billeder i høj opløsning i stedet for at optage et enkelt større billede på hvert afsnit. - Når det er oprettet, skal du konfigurere pixelantal, pixelstørrelse, fliselayout, pixelbotid osv. i hver billedserie efter behov. Når billeddiagnostiske serier er oprettet og konfigureret, vises de alle i et job cue.
- Konfigurer automatiske funktioner, og start afbildningsopsamling
- Opret en separat billedserie til automatiske funktioner ved hjælp af den samme metode som beskrevet i forrige trin. Flyt billedserien til en placering på den sektion, der indeholder strukturer med stor kontrast.
- Indstil billedserien til 1024 x 884 pixel, og vælg en pixelstørrelse svarende til den højeste opløsning, der blev brugt i den billedserie, der blev konfigureret i de foregående trin. Kontroller Autofokus og Automatisk stigmatiseringpå listen over automatiske funktioner.
- Vælg efter sektion i anskaffelsessekvenskontrolelementerne, og kontroller, at billedet af automatiske funktioner er det første element på listen. Start billedopsamlingen ved at klikke på knappen Kør ud for jobkøen. Disse procedurer er illustreret i supplerende materiale, side 22-23.
BEMÆRK: Det er ikke nødvendigt manuelt at fokusere manuelt på hvert afsnit. Under optagelsessessionen udføres de automatiske funktioner, hver gang mikroskopet går videre til en ny sektion, før alle andre billeder optages i dette afsnit.
4. Datajustering og -analyse
- Dataeksport
- Sørg for, at data gemmes i .tif format, så der ikke er behov for en dedikeret eksportfunktion. Sorter data i en mappestruktur, der svarer direkte til lagene og elementerne i lagtræet.
- Når billedmosaikker er optaget, skal du bruge stitchall-funktionen til automatisk at sy alle fliser.
- Stakjustering og beskæring i Fiji
SEDDEL. Mange softwarepakker (gratis og kommercielle) kan bruges til at arbejde med Array Tomography data. Nedenstående trin vises med open source-program Fiji32, fordi det er bredt tilgængeligt og indeholder alle de nødvendige funktioner.- Importer en stak billeder (eller syede billeder) til Fiji som en virtuel stak.
- Hvis kontrast/lysstyrke skal normaliseres, skal du vælge Udvidet kontrast... fra menuen Proces. Angiv mættede pixel til 0,1 eller mindre, og kontroller Udfør alle udsnit.
- Vælg Registrering | Lineær stakjustering med SIGTEFT.
- Vælg Rigid eller Affine i rullemenuen Forventet transformation. Ellers skal du beholde standardindstillingerne. Start justeringen ved at klikke på OK.
BEMÆRK: Indlæsning af data som Virtual Stack giver Fiji mulighed for at håndtere stakke af enhver størrelse. Outputtet af justeringen oprettes i RAM. Dette kan dog begrænse den maksimale størrelse på stakke, der kan behandles. I så fald skal du bruge Registrer virtuelle stakskiver, som er en mappe-til-mappe-implementering af den samme registreringsalgoritme. Når registreringen er fuldført, skal du indlæse outputdataene som en virtuel stak. - Beskær billedstakken ved at klikke på Beskær, så den kun indeholder investeringsafkast.
- Gem stakken som et enkelt .tif billede eller en række .tif billeder.
BEMÆRK: Kritiske trin i matrixtomografi vises i figur 3.
Representative Results
Eksemplerne nedenfor har til formål at demonstrere alsidigheden af de anbefalede arbejdsgange. Casestudieillustrationer er projekter, som vi havde svært ved at opnå tilfredsstillende resultater for med andre teknikker. Vi valgte Drosophila voksen til at illustrere typiske udfordringer, man kan støde på med mange typer prøver. Dette rørformede organ på ca. 6 mm langt, 500-1000 μm i tværsnit, er opdelt i forskellige regioner med en unik funktion og cellulær sammensætning (Figur 4A)33. Afhængigt af sektionsretningen varierer dimensionerne af tarmprofilen og dens udseende på sektionen. Enten tværgående eller langsgående orienterede sektioner er relativt store, og kun et par kan placeres på et enkelt TEM-gitter (Figur 2F). Kun en lille del af vævet kan afbildes i FIB, og for SBF-SEM svarer vanskeligheden til eventuelle ikke-homogene prøver. AT giver en effektiv afvejning til analyse af sådanne prøver og flad indlejring letter ROI lokalisering. Omhyggelig trimning af overskydende harpiks omkring det valgte område (Figur 4B) er vigtigt for en effektiv opsamling af arrays fra det relevante område (Figur 4C). Hundredvis af sektioner kan indsamles på en enkelt wafer sekventielt eller tilfældigt (Figur 4D). Afhængigt af forskningsspørgsmål vil prøvescreening og erhvervelse kræve en anden strategi, som vi vilkårlige opdeles i flere scenarier. For at illustrere forskellige præsenterede scenarier på en mere målrettet måde valgte vi flere casestudier fra det forskellige forskningsprojekt.
Analyse af talrige tilfældigt fordelte store strukturer 1-10 μm rækkevidde (Figur 4E)
Ofte er ultrastrukturelle data nødvendige for at validere en hypotese, der opstod fra flere eksperimentelle tilgange, der sammenligner en standard og eksperimentelt ændret tilstand. I disse tilfælde indsamles flere sektioner typisk tilfældigt på gitre og screenes for at lokalisere og afbilde interesseområderne. Denne taktik er normalt mindre systematisk og begrænset til et lille antal analyserede sektioner. Vi foreslår optagelse af oversigter over snesevis / hundredvis af mellemopløsningsafsnit fra et givet bånd (Figur 4D). For typiske sektioner på 70 nm vil 200 sektioner strække sig over ca. 14 μm, som vil indeholde mange celler, enten helt eller delvist, afsluttet inden for en halv time. Som det første skridt registreres oversigten over hele båndet med lav opløsning, og oversigten hjælper med at udelade de sektioner, der viser forberedelsesgenstande (f.eks. folder, snavs). Derefter kan erhvervelsen udføres manuelt eller automatisk direkte på udvalgte dele af sektionen eller en hel sektion ved hjælp af enkelt- eller mosaikbilleddannelse efterfulgt af syninger (Figur 4E). Derefter kan billeder fra det valgte område erhverves ved hjælp af parametre med høj opløsning. For eksempel kan mitokondrier, kerner og mikrovilli drage fordel af en sådan statistisk forbedret metode (Figur 4Ei-iii).
Analyse af flere små, sparsomt fordelte strukturer 500-1.000 nm rækkevidde (Supplerende Film 1)
I dette scenario kan investeringsafkast ikke blot identificeres i en scanning med oversigt over lav forstørrelse, og der er behov for billeder i høj opløsning. I konventionelle TEM-prøver er det nødvendigt at zoome ind og ud af sektionen, indtil den nødvendige funktion er fundet. Ofte er billeddannelse flere uafhængige steder i flere prøver mere relevant statistisk end generering af et enkelt stort volumen. I sådanne tilfælde vokser kompleksiteten af manuel erhvervelse eksponentielt. Selvom flere TEM-løsninger muliggør automatiske opkøb eller screening af flere gitre, gør størrelsen af nettet og seriesektionsudfordringerne ofte tilgangen uforenelig for mange prøver. I lignende tilfælde genererer vi et komplet kort over mellemopløsning over et samlet investeringsafkast i flere sektioner ved en opløsning, der er tilstrækkelig til at identificere interessestrukturerne. Under dette laterale screeningstrin er det tilrådeligt at springe flere sektioner ad gangen med det formål at ramme mindst en del af interessestrukturen, når de nærmer sig tilfældigt. Dette vil i høj grad afhænge af strukturens overordnede dimensioner: f.eks. hvis strukturens samlede størrelse er 500 nm og sektionerne er 50 nm tykke, vil mindst ni sekventielle sektioner i træk sandsynligvis indeholde en del af interessestrukturen. På denne måde skal springet af 6-7 sektioner være effektivt til at finde mange forskellige slags strukturer i flere områder. Automatisk erhvervelse af de løste mosaikkort over udvalgte sektioner muliggør omhyggelig screening af disse sektioner efter deres erhvervelse. Når et sådant kort med høj opløsning er anskaffet, kan flere investeringsafkast beskæres eller bruges til at definere yderligere lokale billedbehandlingsområder på INVESTERINGSAFKAST (Supplerende film 1). Golgi, centrioles, vejkryds, mikrotubuler, forskellige typer vesikler er gode eksempler på de strukturer, der kan drage fordel af dette scenario (Supplerende Movie 1).
Analyse af sparsomt fordelte store ROI'er i store stikprøver (Figur 4F-4H)
Dette scenario involverer sjældne hændelser, som ofte beskrives som "en nål i en høstak", hvor problemet ikke er i ROI identifikation, men dens lokalisering. For mange prøver korrelativ tilgang er ikke en gyldig mulighed, men ofte ROI har en afslørende ultrastruktur, og når lokaliseret, kan identificeres med høj pålidelighed. For disse prøver er det vigtigt at anvende erhvervelse på flere niveauer, begyndende med de forscreenede prøver med snesevis til hundredvis af sektioner ved mellemlang opløsning. I den software, der bruges her, er der to forskellige strategier for at opnå billedsæt af flere sektioner: Optagelse af Preview-billederne i en højere opløsning eller erhvervelse af et array-feltsæt med passende indstillinger (Figur 4F). Forskellige specialiserede celletyper iDrosophila tarm er tilfældigt fordelt (f.eks stamceller, enteroendokrine celler), og tynde sektioneret ved tilfældig orientering. Alligevel kan de visuelt skelnes efter screening af de billeder, der er opnået ved hjælp af parametre i høj opløsning enten fra enkelte sektioner eller som en samling af serielle billeder (Figur 4G). Efter justeringen kan stakkene gengives ved hjælp af forskellige softwareløsninger (Figur 4H, Supplerende film 2).
Scenarie 1: Tarmorganoider (Figur 5A)
Organoider er hurtigt ved at blive et af de mest banebrydende værktøjer i moderne biovidenskab. Denne næsten fysiologiske 3D-stamcelledelte organmodel muliggør en nøjagtig undersøgelse af en række in vivo biologiske processer, herunder vævsfornyelse, reaktion på lægemidler og regenerativ medicin. Nyligt introducerede mini-gut rør34 åbne en ny generation af organoid teknologi, der ligner in vivo væv fysiologi, celle-type sammensætning, og homøostase, muliggør brede perspektiver for sygdom modellering, host-mikrobe interaktion, og opdagelse af lægemidler. Men når ultrastrukturel karakterisering er påkrævet, lokalisering af forskellige celletyper i så stort væv ved hjælp af tilfældige prøver kan være udfordrende. Også, i variable "infektion" assays, Er det afgørende at sikre, at analysen afslører forskellige udviklingsstadier, der påvirker vævet. For sådanne undersøgelser er statistisk signifikant dækning af stikprøven central, men alligevel svær at opnå ved hjælp af den traditionelle TEM-on-grid-tilgang. AT-scenario 1 er gavnligt i sådanne tilfælde: mange sekventielle sektioner kan genereres på en wafer (Figur 5Aii) og screenes ved hjælp af lavopløsningsparametre for at lokalisere de generelle interesseområder(figur 5Aiii; pile). Disse områder kan målrettes til yderligere analyse ved hjælp af avancerede anskaffelsesparametre (Figur 5Aiv og Figur 5Av). Når der registreres en relevant struktur (typisk en klynge på 5-10 sektioner en gang i hver 100-300 sektioner), er det nemt at koncentrere sig om hver af interessestrukturerne og erhverve enkelte billeder manuelt eller bruge automatiseringsfunktionerne til at erhverve billedmængder på tværs af flere sektioner.
Scenarie 2: Drosophila pupal notum ( Figur5B)
Undersøgelse af celledeling og de mekanismer, der styrer progression gennem cellecyklussen, er afgørende for at forstå både standard og ændrede processer i flercellede organismer. De oplysninger, der findes, stammer ofte fra encellede systemer. Denne løsning mangler dog den kritiske kontekst af 3D-interaktioner mellem cellerne i et væv. En enkeltcellet monolag af notum, udviklingen bagsiden af Drosophila larven, er en perfekt model for samspillet mellem epitelcellerne generelt og celledelingen i særdeleshed35. Det er en etableret model for molekylære og cellulære interaktioner undersøgelser ved hjælp af kombinationen af de data, der er tilgængelige ved fluorescerende mikroskopi og genetiske manipulationer. Abscission, det sidste trin i celledelingen, sikrer den endelige adskillelse mellem to dividerende celler, og karakterisere de strukturelle ændringer, der opstår under abscission, er afgørende for vores forståelse af mitose. Mitotiske divisioner i notum er dog ikke lette at lokalisere på det ultrastrukturelle niveau: cellerne er relativt store sammenlignet med abscissionszonen (Figur 5B). Forholdet mellem abscissionszonens samlede størrelse og overfladen af den sektion, der skal dækkes, er stort (Figur 5Bi). Selvom det er muligt at lokalisere abscissionszonen ved hjælp af TEM- eller SBF-SEM-metoderne36, er opgaven besværlig. Med dette scenario kan de automatiske oversigtsbilleder med middel opløsning af spring på 20-40 sektioner bruges til at lokalisere skillecellerne (Figur 5Bii). Når sådanne celler er identificeret, tjener sektionerne som anker til nærmere undersøgelse af sektionerne i nærheden, og der kan findes og udvælges adskillige skilleceller til yderligere analyse. På denne måde kan abscissionszonen placeres og afbildes i sin helhed (Figur 5Biii). Afhængigt af spørgsmålet kan der indsamles enkelte billeder i høj opløsning eller 3-7 billedsekvenser for at dække strukturens dybde (Figur 5Biv).
Scenarie 3: Mus tanycyt neuroner (Figur 5C)
Musen giver en veletableret model for hjernens udvikling og er veldokumenteret på forskellige niveauer, herunder af EM. Selv om forskellige automatiserede serie-blok-ansigt metoder er blevet brugt i vid udstrækning til at studere hjernevæv, der er tilfælde, hvor AT er bedre tilpasset til at indsamle de nødvendige data. Hypothalamus er en veletableret neurovidenskabsmodel, en del af hjernen, der indeholder flere neuronale typerfunktioner. Hypothalamus tanycytter repræsenterer en bestemt delmængde af ependymogliale celler foring bunden af den tredje ventrikel, med usædvanligt lange processer (op til 300 μm) og store endfeet (~ 5 μm)37. Dette gør dem ubelejlige for analysen af enten TEM eller FIB metoder. Opgaven kompliceres yderligere, når flere uafhængige tanycytter skal lokaliseres og analyseres. En af metoderne til at lette denne opgave kan være semikorrelativ målretning, hvor fluorescenskortet opnås fra de fluorescerende mærkede prøver, før de fastsættes og integreres til EM. Afsnittet udføres på det område, der er fanget ved at kombinere positionelle oplysninger fra fluorescensprøven og den flade indlejrede plastkopi. Derefter kan AT scenario 3 bruges: De højt niveau oversigt mosaikbilleder genereres for at afsløre regionerne med tanycyte endfeet klynger. Efterfølgende bruges automatiseringsfunktioner i softwaren til at konfigurere erhvervelsen af sekvenser af billederne fra et eller flere områder i et enkelt billede eller flisebelagt tilstand. Disse billeder kan analyseres separat, som justerede stakke eller gengives efter det.
At-metodens effekt tillader den relativt ubesværet "opgradering" af data fra 2D til 3D: kortene er tilgængelige fra den primære erhvervelse, og mængderne kan fås fra det valgte område og dets nærhed. Den resulterende stak kan justeres og efterfølgende gengives. Det er vigtigt på forhånd at bestemme, hvilken opløsning og billedkvalitet der er nødvendig for at finde INVESTERINGSAFKAST. Billedbehandling bør gøre det muligt at genkende investeringsafkast, men ikke ud over denne værdi, fordi anskaffelsestiden skaleres proportionalt med pixelbotid og den inverse kvadrat pixelstørrelse.
Figur 1: Udfordringer ved EM-prøveforberedelse og volumenopsamling. (A) Tabet af fluorescens og svind sker på grund af en høj tungmetalkoncentration og dehydrering under prøveforberedelse. i) En skematisk tegning af en prøve observeret under LM ii) den samme prøve, der er fremstillet til EM, og som bliver fuldstændig uigennemsigtig og mister ca. 10 % af volumenet. (B) Prøveindlejring udføres typisk ved hjælp af epoxy eller akrylharpikser. Traditionelle blokke (i) kan med succes anvendes til homogene prøver, der ikke kræver en bestemt orientering. Flade blokke ii) er nyttige, når det er vigtigt at målrette og orientere sig under mikroskopet, et præcist område, der er rettet mod indsnitning, f.eks. (C) Af hele prøvevolumen er kun en begrænset brøkdel repræsenteret på en enkelt sektion på 50 nm, hvilket giver et 2D-billede af en 3D-prøve, ofte i en ukendt retning. (D) For at illustrere problemet med at registrere alt for store mængder versus præcis målretning, valgte vi tre koncentriske terninger med ansigterne på 1000, 500 og 50 μm er organiseret til at omfatte en hypotetisk 1000 x 500 x 500 μm prøve (mørk rødbrun). Hvis sådanne hypotetiske prøve terninger er grundigt opdelt med 50 nm skiver, til at dække hele volumen, vil det kræve i alt 20.000, 10.000, og 1.000 skiver, og 800 tb, 100 tb, og 100 gb, i overensstemmelse hermed (billedbehandling opløsning 5 nm x 5 x 50 nm, 8 bit data). Dette viser, hvor vigtigt det er kun at planlægge indsamlingen af EM-data for at opnå den nødvendige minimumsmængde. (E) At dække et stort prøveareal i høj opløsning udgør et problem svarende til det store volumen. Flisering flere billeder i høj opløsning i én er en nyttig løsning på et sådant problem. Men at dække en 1 mm x 1 mm overflade ved hjælp af 2024 x 1048 rammen i 10.000x forstørrelse vil kræve et stort antal fliser, som kan blive udfordrende at sy. Hvis sektionerne desuden er varierende komprimerede eller forvrængede under skæring, bliver de resulterende datastakke næsten umulige at justere. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Arbejdsgangen for direkte generering af sektioner på stor støtte. (A) Til stram trimning ved hjælp af trimværktøjet fastgøres blokke inde i mikrotomholderen. Dette trin hjælper med at sikre parallelle sider af en blok og reducerer også tom harpiks omkring prøven. (B) En modificeret kniv til at sektioner erhvervelser. En stor båd letter overførslen af sektionerne og deres manipulation under prøvesektion og overførsel på støtten. Et stort bassin muliggør manipulation af sektionerne; drænsystemet begrænser båndenes bevægelse under dræningstrinnet, den flade bund gør gradvis tørring af støtten pålidelig. (C) Kniven, klar til indsnit med en glød-udledt wafer placeret i bunden af bassinet og vand jævnet med jorden til kanterne. Konstruktionen af kniven holder nålen indlejret uden at forstyrre støtten. (D) Arraygenerering, topvisning på afsnittet mikrotom. (i) De første afsnit er normalt let at få, da de holder sig til hinanden og danner et almindeligt bånd. (ii) Når der føjes flere sektioner til båndet, og det bliver længere, mister båndet sin stabilitet og kurver ofte. Det er afgørende at holde sekvenssporene organiseret i rækkefølge som forberedelse til billedopsamlingstrinnet. Iii) Når et bånd af sektioner når den ønskede længde, løsnes det forsigtigt fra knivkanten ved hjælp af en øjenvippe. iv) Vand drænes fra bassinet waferen forbliver inde, indtil den er helt lufttørret. Dette trin er vigtigt, da det hjælper med at rette sektionerne og undgå dannelsen af mikrofolderne. Waferen anbringes i ovnen ved 60 °C i mindst 30 min for at fastgøre sektionerne ved støtte. (E) Eksempel vafler med de overførte sektioner. Selvom det er praktisk at opnå lige og præcise bånd, forhindrer faktiske prøver dannelsen af sådanne ideelle bånd i de fleste tilfælde. Ikke desto mindre er selv "sjuskede" bånd meget informative for det store antal sager, og betydningen af det "pæne" bånd vil afhænge af en forskningsstrategi, som sektionerne indsamles for. Skaler søjle 1 cm. (F) Eksempel slotgitre med de serielle sektioner. Selv når mange sektioner indsamles på et gitter, er det stadig en lille brøkdel af, hvad der kan indsamles på en enkelt wafer. Den færdighed, der kræves for at mestre overførslen af sektionerne på et gitter (især slotgrid), udgjorde en betydelig flaskehals til mastering af elektronmikroskopiprøvepræparat. Skalastang 500 μm. (G) Uanset hvilken sektionssamlingsmetode der blev anvendt, er AT-tilgangens styrker den relative lethed ved generering af sekventielle sektioner sammenlignet med samlingen på nettet. Hvis en 1000 μm x 500 μm prøveblok overvejes, er der ikke noget problem at passe omkring 100 sektioner på en 2 cm x 4 cm wafer (i). De samme størrelse sektioner på et slot gitter vil kun passe tre sektioner / gitter på maksimum (ii). Vi leverer et skaleret billede for at vise, hvor mange gitre der kan være nødvendige for at dække det samme antal sektioner, uden at nævne vanskeligheden ved at indsamle serielle sektioner på nettet. Skalalinje = 1 cm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Kritiske trin i arbejdsprocessen til matrixtomografi. Skematisk for arbejdsprocessen for automatisk anskaffelse af billedstakke med høj opløsning. Alle forberedende trin er automatiserede (grønne gearsymboler) og kræver ikke, at nogen handlinger udføres manuelt, afsnit for afsnit. Billedstakke kan justeres i enhver billedanalysesoftware, der kan justeres automatisk stiv eller affinjustering. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Tre opkøbsscenarier med Drosophila voksen tarm som demonstrationsmodel. (A) tegning af en dissekeret Drosophila midgut, med tre store regioner udpeget af forskellige farver: forreste, midterste og bageste. (B) Trimmet flad blok, hvor en tarm er orienteret til tværgående afsnit. Bemærk, at den tomme harpiksmængde er omhyggeligt afbalanceret omkring det væv, der indeholder interesseområdet (hvidt rektangel). (C) Tværgående serielektioner flyder på vandoverfladen inde i AT-knivens bassin. Alle billeder blev erhvervet i sekundær elektron SEM-tilstand ved hjælp af spejldetektoren med den omvendte kontrast. (D) Syet mosaikbillede af tværgående serielle sektioner på en wafer. Skalastangen er 1000 μm. (E) Tværsnit gennem Drosophila tarm. Skalastang 20 μm. Billedet er en syet mosaik af 7 x 7 mellemklasse billeder. Insets - højere forstørrelse og opløsning billeder af de specifikke regioner af interesse: (ii) kerne, (iii) børste grænse, og (i) mitokondrier. Skalastang 5 μm for alle. (F) Et mellemklassebillede af en tværgående sektion gennem tarmen, der er rettet mod placeringen af udviklingsceller (kvadrat). Skalalinjen er 20 μm. (G) Den målrettede vifte af seriel sektioner indsamlet baseret på det område lokaliseret under analysen af afsnittet til stede i panel F. Skalalinjen er 10 μm. (H) 3D-modellen gengives baseret på de 50 sektioner staksekvens, der er opnået fra den målrettede serieopsamling i panel G. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Casestudier for AT-anvendelsesscenarierne. (A) Lokalisering af forskellige cellestrukturer i tarmorganoiden. i) Indlejret siliciummikrochip. Skalastang = 200 μm. (ii) Et syet mosaikbillede af 127 tværsnit gennem den centrale del af chippen. Skalastang = 1500 μm (iii) Fire billeder i lav opløsning af en komplet tværgående sektion gennem den del af tarmorganoiden. Pile peger på det potentielle interessested. Skalastang er 20 μm. (iv) Forskellige INVESTERINGSAFKAST, rettet mod mikrografer med lav opløsning udvalgt til yderligere analyse. Skalalinjen = 10 μm. (v) Billede i høj opløsning af den inficerede celle af interesse. Analyse af det samme område i de tilstødende sektioner kan give målrettede 3D-oplysninger, hvis det kræves. Skalastang = 5 μm. (B) Midbody lokalisering i Drosophila melanogaster pupal notum. i) Et skematisk billede af en dissekeret Drosophila puppe. Notum eksponeret for dissektionen (beige) efter fjernelse af den del af den beskyttende neglebånd (brun). Den sorte linje angiver retningen af sektion (ii) Et tværsnit gennem det område, der præsenteres i diagrammet. Billedet kombinerer 3x7 sekventielt taget høj opløsning SEM billeder syet til en mosaik panel. Det sorte rektangel afgrænser det område, der indeholder en skillecelle. Skalalinjen er 15 μm. (iii) Et zoomet billede på skillecellen fra panel ii. Ved denne forstørrelse og opløsning er midbody tydelig (hvide pile). Hele sektionen analyseres for at finde skillecellerne. Springende mellem forskellige bånd af sektioner i 20-30 sektioner intervaller i løbet af den laterale screening trin tillader sto lokalisere talrige dividere cellepar. Skalalinjen er 5 μm (iv), når en skillecelle er lokaliseret, sekventielle billeder af midbody indsamlet fra fire sektioner omkring midten afgrænset af gul firkant i panelet (iii). Skalastang er 1 μm. (C) Tanycytter endfeet lokalisering i mus hypothalamus. i) Fluorescensbillede af en vibratom skive. Tanycytter udtrykker tdTomato fluorescerende protein (rød). Et hvidt rektangel afgrænser interesseområdet. Skalastang 500 μm. ii) Samme vibratomsektion, der er forberedt til EM, vil blive omhyggeligt trimmet omkring det interesseområde, der er baseret på den indirekte korrelation af fluorescerende oplysninger fra panel i). Den stiplede hvide linje repræsenterer det ultratynde snit. Skalastang er 50 μm for begge paneler. iii) Tværsnit gennem vibratom skive i området af interesse. SEM mosaik billede består af 75 syet billeder. Flere sektioner er målrettet ved lateral screening og afbildet med lignende parametre. Sektionerne analyseres "offline" for at finde ROI - tanycyte endfeet. Det sorte rektangel repræsenterer det område, der indeholder den tanycyte endfeet. Dette afsnit vil tjene som et anker for yderligere analyse. Skalastangen er 15 μm. (iv) Høj opløsning, høj forstørrelse billede af tanycyt endfeet omkring et blodkar. Efter den første lokalisering af investeringsafkast på et afsnit opsamles z-sekvensen fra de tilstødende sektioner opstrøms til ankersektionen (panel iii). Skalalinje 5 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Problemer under ultramikrotomi, sektionssamling og sektionsopbevaring kan føre til genstande. (A) Hjerneprøveafsnit på en wafer. De fleste af de tomme harpiks løsrevet fra vævet og foldet på sig selv (sepia). Den stiplede sorte boks angiver et område, der bruges til at indeholde hele sektionen. Skalastang 500 μm. (B) En lille, lokal fold på overfladen af en 50-nm tyk zebrafisksektion. Skalastang 1 μm. (C) Knivmærke på overfladen af en 70nm musehjernesektion. Skalastang 5 μm. (D) Håret (stjernen) på overfladen af waferen, der delvist dækker en zebrafiskmuskelsektion. I gult er vævet målrettet til analysen. I pink, en celle, der anvendes til at tjene som reference for størrelsen af det berørte område. Skala bar 50 μm. (E) Zebrafisk notochord med rynker nederst til højre (sorte pile), hvor tæt neuralt væv (skygget i blåt) grænser til blødere muskelvæv og tom harpiks (sorte pile). Skalastang 10 μm. (F) Volumensegmentering af en stak på 50 billeder som i E, hvilket viser, at denne region viste rynker i de fleste sektioner. Stiplet polygon skitserer det område, der er vist i G. Skalalinjen 10 μm. (G) XY-visning af samme volumensegmentering som i F, og viser rynkerne som korte sorte streger i højre halvdel af blokken. Bemærk, at justeringen af stakken i de resterende dele af vævet ikke påvirkes af rynkerne. Skalastang 5 μm. (H) XZ projektion af samme område som i G, der viser rynkerne i alle 50 sektioner. Skalalinje 5 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende film 1: Et montagebillede i høj opløsning af et tværsnit gennem Drosophila anterior midgut. Mosaikbillede af et omvendt SE-MD SEM-billede. 352 separate billedfliser blev automatisk erhvervet ved 5 nm opløsning og syet til at præsentere hele tværsnit. Det er muligt at zoome ind for flere detaljer og få en udtømmende dækning af dataene ved hjælp af det samme billede. Stramme kryds, microtubuli, forskellige typer vesikler kan være, når du zoomer ind. Skalalinjen er 10 μm. Klik her for at downloade denne film.
Supplerende film 2: Drosophila tarmceller rendering. Halvtreds justerede mosaikbilleder af sektionerne i området for opdeling af tarmceller. IMOD gengivelse af cellekanter (blå, turkis og orange) og kerner (hvid). Klik her for at downloade denne film.
Supplerende materialer. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Elektronmikroskopi giver indsigt i cellernes og organismernes ultrastruktur, for hvilke det ofte er ønskeligt at afbilde strukturer af interesse i deres 3-dimensionelle kontekst. På trods af talrige EM taktik for ultrastrukturelle analyse, er der stadig ingen "guld standard" løsning. Hovedårsagen er den brede vifte af prøver, mange biologiske spørgsmål, som ofte kræver en skræddersyet tilgang. Den foreslåede AT-arbejdsproces er designet til at minimere den tid, der er nødvendig for prøvebehandling, dataindsamling, evaluering og lagring. Desuden giver den modificerede kniv et nyttigt værktøj til at forenkle array erhvervelse. Det kompakte layout af sektioner på wafers er praktisk, både til observation og efterfølgende opbevaring af prøverne. Dette arrangement muliggør "Lateral Screening" af prøver ved vandret at flytte fra bånd til bånd og scanne kun et afsnit på hver, hvilket reducerer den tid, der kræves for at lokalisere et investeringsafkast. Foreslåede scenarier for dataindsamling gør det lettere at målrette mod små og tilfældigt fordelte områder. Når at/SEM er fundet, begrænses den højopløsningsbilleddannelse præcist til mængden af interesse, uanset om den udføres manuelt eller ved hjælp af automatisk funktion. AT for begrænsede mængder kan udfyldes manuelt, hvor operatøren navigerer gennem prøven og definerer billedbehandlingsområder en efter en. Det automatiserede modul af softwaren giver en fleksibel image erhvervelse strategi for billedbehandling af små områder på store sektioner. Automatiseringen i denne software gør det muligt at optage store billeder i høj opløsning på hundredvis af sektioner og opnå lignende mængder som SBFI. Optagelse af oversigtsbilleder af alle sektioner forenkler roi-lokaliseringen og reducerer den tid, der bruges på mikroskopet. Da afsnittene ikke er skadet under registreringen af oversigter og forhåndsvisninger med højere opløsning, tillader AT/SEM at genbruge prøven til at indsamle yderligere data om andre investeringsafkast eller ved en højere opløsning.
Image erhvervelse tid er en af de vigtigste (og dyreste) aspekter af 3D EM og bør derfor overvejes i eksperimentet design. Selvom det ikke er overraskende, at billeddannelse af store områder tager længere tid end billeddannelse af små områder, er det let at undervurdere virkningen: Afhængigt af de valgte billedbehandlingsparametre kan anskaffelsestiden på hvert afsnit variere fra sekunder til timer. Vigtige billedbehandlingsparametre omfatter størrelsen på syns-, opløsnings- og opholdstiden. Hvis der antages en målopløsning på 10nm pr. pixel og 1 μs, skal der billeddannelse et felt på 20 μm x 20 μm, 100 μm x100 μm eller 500 μm x500 μm tager 4 sekunder, 100 sekunder eller 2.500 s at registrere. Vi kan gange disse billedtider pr. sektion med antallet af sektioner for at estimere den tid, der kræves til det komplette billedjob. Lange billedtider pr. sektion kan være acceptable, hvis antallet af sektioner er lille, eller hvis mikroskopværktøjstiden ikke giver anledning til bekymring.
Det er dog nødvendigt at begrænse registreringstiden til et overnatningsjob eller et weekendjob i de fleste tilfælde. Et lige så kritisk aspekt af 3D EM, der bør overvejes, er mængden og strukturen af de resulterende billeddata. Optagelse af ovennævnte billedfelter i 100 sektioner genererer henholdsvis 400 mb, 10 gb eller 250 gb billeddata. de 500 μm x 500 μm billeder udgør det ekstra problem at være større end 2 gb hver. Mange af de softwareprogrammer, der bruges til dataevaluering, kan ikke åbne billeder af denne størrelse.
For at reducere billedtiden er det vigtigt at vælge pixelbotid for at opfylde kravene til signal-til-støj-forholdet til den efterfølgende dataevaluering (f.eks. rekonstruktion, sporing) og begrænse optagelserne til definerede INVESTERINGSAFKAST. AT-udvidelsen af softwaren letter billedopsamling i små områder i serielle sektioner. Softwaren understøtter manuelle og automatiske arbejdsgange og mange halvautomatiske varianter: billedområder kan placeres manuelt og fokuseres på hvert afsnit, eller brugeren kan bruge den automatiske sektionsfinder og positionjusteringsfunktioner. Afhængigt af det automatiseringsniveau, der er valgt og understøttet af eksempeltypen eller billedmålene, kan den tid, der kræves til opsætning af billedopsamling i hundredvis af sektioner, tage en hel arbejdsdag (udført manuelt) eller kun få minutter. I princippet gør Array Tomography det mere udfordrende end andre 3D EM-metoder til at erhverve små INVESTERINGSAFKAST; Upræcise placering i regionen på sammenhængende strækninger skal kompenseres ved at erhverve større arealer. Hvis roi'et f.eks. er 20 μm x 20 μm i størrelse, og billeddannelsesfelternes sektion-til-sektionsposition er 10μm, skal man anskaffe 40 μm x 40 μm billeder for at være sikker på, at investeringsafkast er fuldt optaget i hvert billede på hvert afsnit. Den virkelige billedposition varierer fra 100 μm til <10 μm afhængigt af tilgængeligheden eller kvaliteten af softwarefunktioner til positionsjustering eller brugerens tålmodighed. Med denne software kan 10 μm opnås uden for meget manuel indgriben i de fleste prøver.
Som enhver teknik har AT flere svage punkter, der kan påvirke vellykket dataindsamling, og mange ligner andre sektionsbaserede metoder. Mangel på homogen fordeling af tom harpiks versus væv kan resultere i buede eller brudte arrays. I ekstreme tilfælde kan sektioner frigøre sig fra støtten (Figur 6A). Variabel komprimering eller strækning under skæreprocessen kan oprette folder, der kan forstyrre prøven i variable områder på efterfølgende afsnit (Figur 6B). Knivmærker kan forekomme på overfladen af de indsamlede sektioner ved hjælp af en beskadiget kniv (Figur 6C). Forskelle i sektionsforhold kan medføre lejlighedsvise sektionskomprimerings- og tykkelsesforskelle. Støv- eller snavspartikler kan lande på en sektion og delvis tilsløre interessezonen (Figur 6D). Billedopsamling kan mislykkes på grund af ufuldkomne funktioner med automatisk kontrast, automatisk fokus og automatisk stigmatisering. Placeringen af automatisk oprettede billedområder kan være variabel og kan muligvis ikke registrere investeringsafkast i alle sektioner.
Flere problemer kan opstå på tidspunktet for syninger og tilpasning. Den automatiske syning af mosaikfliser erhvervelser kan mislykkes, for eksempel på grund af den store tomme plads inde i prøven. På grund af en drastisk ændring i form i 3D kan billedstakke være udfordrende at registrere. Specialudviklede programmer (f.eks. IMOD, Fiji, TrackEM2, MIB eller MAPS-AT) kan lette halvautomatisk justering32,38,39,40. Mere udfordrende sektioner kan justeres manuelt ved hjælp af fotoredigeringssoftware. Desværre kan nogle datasæt være umulige at justere korrekt.
Store prøver er udfordrende for TEM serielle sektioner passer på gitre; På den anden side berettiger mange projekter ikke til lang automatisk erhvervelse ved hjælp af FIB/SEM eller SBF-SEM. AT er et ligetil alternativ til en kedelig seriel sektion TEM, hvor indsamling og manipulation af serielle sektioner på en wafer er mere ligetil end med slotgitre. Der blev udviklet flere strategier for at lette indsamlingen af arrays, og vi deler vores metode til at udvide den eksisterende værktøjskasse. I tilfælde, hvor identifikationen af investeringsafkast er udfordrende, giver AT-SEM en grundlæggende fordel med en effektiv screening af prøverne, hvor der kræves organelskalaopløsning på tværs af 50 til 500 sektioner. For større mængder kan de automatiske indsamlings-AT-strategier indsamles effektivt, hvis der kræves flere sektioner. AT prøver kan re-imaged flere gange, lette målrettet billeddannelse af områder med høj opløsning baseret på tidligere erhvervede oversigt billeder. Vi mener, at den målrettede analyse og reduceret oversampling af AT / SEM foreslået her reducerer arbejdskraft og datalagring krav. I sidste ende kan biblioteker af sektioner indsamles og vedligeholdes til senere genbrug og høring. Til volumenerhvervelse tilbyder FIB- eller SBF-SEM-tilgange en fremragende løsning, når investeringsafkast er let at identificere på blokfladen, eller hvis der er behov for store 3D-mængder til analysen. FIB/SBF-SEM er dog mindre effektive, når stakbilledet med høj opløsning skal indsamles fra et defineret investeringsafkast på en målrettet måde. Afslutningsvis vil jeg sige, at de foreslåede metoder til screening af AT-prøver og brugen af oversigtsbilleder med medium opløsning gør det muligt at begrænse billedopsamlingen til de relevante dele af sektionsmatrixen. Præcis sigte med billeddannelsesområder fremskynder time-to-data og forenkler dataevalueringen.
Sammenfattende, selv om begrebet AT / SEM ikke er nyt, dets anvendelse er stadig ikke så udbredt som dens fordele antyder. Samlet set giver den en supplerende procedure til andre eksisterende EM-metoder. AT/SEM er kompatibel med det bredeste udvalg af prøveforberedelsesprotokoller og billedbehandlingsarbejdsgange og kan udføres på enhver FIB/SEM eller SBF-SEM-mikroskop som en ledsagende teknik. I dette papir har vi koncentreret os om AT til registrering af ultrastrukturelle data fra prøver, der er mindre tilbøjelige til at blive behandlet med succes ved andre metoder. Vi håber, at den beskrevne procedure for bekvem indsamling af sektioner og betydeligt automatiserede erhvervelsesstrategier vil hjælpe i de første forsøg for dem, der aldrig har stødt på metoden og vil bidrage til at perfektionere den til dem, der allerede har en vis erfaring.
Disclosures
Forfatteren Tilman Franke er ansat hos Thermo Fisher, der fremstiller elektronmikroskoper og pilotprogrammer, der bruges i artiklen.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke medlemmerne af EM-faciliteten ved universitetet i Lausanne for deres støtte under denne udvikling af forskellige trin i AT-proceduren. Vi vil gerne takke Gareth Griffiths, Marta Rodrigues, Urska Repnik, Christel Genoud, Helmut Gnaegi, Einat Zelinger, Paola Moreno-Roman, Lucy O'Brien og Lindsay Lewellyn for diskussioner under udarbejdelsen af manuskriptet og kritisk læsning. Vi vil gerne anerkende de grupper, der har bidraget med de prøver, der blev brugt til at demonstrere de forskellige scenarier: Matthias Lutolf, Michail Nikolaev, Devanjali Dutta, Till Matzat og Fanny Langlet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cutting | |||
| AT sectioning knife | Diatome | DUATS3530 | Diatome Jumbo knife |
| Diamond knife for trimming 90° | Diatome | DTB90 | Diatome trimming 20° Glass knife |
| Pattex contact adhesive | Pattex | PCL3C | |
| Silicon wafer | Ted Pella | 16015 | Resistance: 1-30 Ohms Type P: (Boron) (1 primary flat) Roughness: 2 nm No SiO2 top coating TTV: = <20 µm Wafer is polished on one side |
| Ultramicrotome | Leica UC6 | Alternative: Leica UC7 | |
| Wafer cleaving kit | EMS | 7642 | EMF, Small Sample Cleaver, CatNo. 7652 |
| Image acquisition | |||
| FESEM | Thermo Fischer Helios | 1072419 | Alternatives: Zeiss, Jeol, Hitachi, TESCAN |
| Maps 3 for SEM with Correlative Workflow & Array Tomography | Thermo Fisher Scientific | 1135932 | Maps provides automation of SEM imaging workflows and allows importing of 3rd party data for CLEM and navigation. |
| Image analysis | |||
| Amira x.y | Thermo Fisher Scientific | 1131599 | Amira is a 3D data visualization and analysis software with several practical functions for Array Tomography data reconstruction. |
| Image processing | Open source | Fiji (http://fiji.sc/#download) | IMOD, MIB (See text for refferences) |
References
- Luckner, M., Wanner, G. From light microscopy to analytical scanning electron microscopy (SEM) and focused ion beam (FIB)/SEM in biology: Fixed coordinates, flat embedding, absolute references. Microscopy and Microanalysis. 24 (5), 526-544 (2018).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transaction of Royal Society of London B Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).
- Zheng, Z., et al. A complete electron microscopy volume of the brain of adult Drosophila melanogaster. Cell. 174 (3), 730-743 (2018).
- Mulcahy, B., et al. A pipeline for volume electron microscopy of the caenorhabditis elegans nervous system. Frontiers in Neural Circuits. 12, 94 (2018).
- Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
- Baumeister, W., Grimm, R., Walz, J. Electron tomography of molecules and cells. Trends in Cell Biology. 9 (2), 81-85 (1999).
- Hoog, J. L., et al. Organization of interphase microtubules in fission yeast analyzed by electron tomography. Developmental Cell. 12 (3), 349-361 (2007).
- Weber, M. S., Wojtynek, M., Medalia, O. Cellular and structural studies of eukaryotic cells by cryo-electron tomography. Cells. 8 (1), 57 (2019).
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).
- Horstmann, H., Korber, C., Satzler, K., Aydin, D., Kuner, T. Serial section scanning electron microscopy (S3EM) on silicon wafers for ultra-structural volume imaging of cells and tissues. PLoS One. 7 (4), 35172 (2012).
- Hayworth, K. J., et al. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Frontiers in Neural Circuits. 8, 68 (2014).
- Kubota, Y., et al. A carbon nanotube tape for serial-section electron microscopy of brain ultrastructure. Nature Communication. 9 (1), 437 (2018).
- Wacker, I. U., et al. Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes. Journal of Visualized Experiments. (133), e57059 (2018).
- Burel, A., et al. A targeted 3D EM and correlative microscopy method using SEM array tomography. Development. 145 (12), (2018).
- Templier, T. MagC, magnetic collection of ultrathin sections for volumetric correlative light and electron microscopy. Elife. 8, 45696 (2019).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).
- Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling. Journal of Neuroscience. 28 (12), 2959-2964 (2008).
- Wanner, A. A., Genoud, C., Masudi, T., Siksou, L., Friedrich, R. W. Dense EM-based reconstruction of the interglomerular projectome in the zebrafish olfactory bulb. Nature Neuroscience. 19 (6), 816-825 (2016).
- Smith, D., Starborg, T. Serial block face scanning electron microscopy in cell biology: Applications and technology. Tissue Cell. 57, 111-122 (2019).
- Kizilyaprak, C., Bittermann, A. G., Daraspe, J., Humbel, B. M.
- Xu, C. S., et al. Enhanced FIB-SEM systems for large-volume 3D imaging. Elife. 6, 25916 (2017).
- Hayworth, K. J., et al. Gas cluster ion beam SEM for imaging of large tissue samples with 10 nm isotropic resolution. Nature Methods. 17 (1), 68-71 (2020).
- Maco, B., et al. Correlative in vivo 2 photon and focused ion beam scanning electron microscopy of cortical neurons. PLoS One. 8 (2), 57405 (2013).
- Russell, M. R., et al. 3D correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy. Journal of Cell Science. 130 (1), 278-291 (2017).
- Lucas, M. S., Gunthert, M., Gasser, P., Lucas, F., Wepf, R. Bridging microscopes: 3D correlative light and scanning electron microscopy of complex biological structures. Methods in Cell Biology. 111, 325-356 (2012).
- Koga, D., Kusumi, S., Bochimoto, H., Watanabe, T., Ushiki, T. Correlative light and scanning electron microscopy for observing the three-dimensional ultrastructure of membranous cell organelles in relation to their molecular components. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (12), 968-979 (2015).
- Peddie, C. J., et al. Correlative and integrated light and electron microscopy of in-resin GFP fluorescence, used to localise diacylglycerol in mammalian cells. Ultramicroscopy. 143, 3-14 (2014).
- Markert, S. M., et al. 3D subcellular localization with superresolution array tomography on ultrathin sections of various species. Methods in Cell Biology. 140, 21-47 (2017).
- Kolotuev, I., Schwab, Y., Labouesse, M. A precise and rapid mapping protocol for correlative light and electron microscopy of small invertebrate organisms. Biology of the Cell. 102 (2), 121-132 (2009).
- Kolotuev, I. Positional correlative anatomy of invertebrate model organisms increases efficiency of TEM data production. Microscopy and Microanalysis. 20 (5), 1392-1403 (2014).
- Kato, M., Kolotuev, I., Cunha, A., Gharib, S., Sternberg, P. W. Extrasynaptic acetylcholine signaling through a muscarinic receptor regulates cell migration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (1), e1904338118 (2021).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Miguel-Aliaga, I., Jasper, H., Lemaitre, B. Anatomy and physiology of the digestive tract of Drosophila melanogaster. Genetics. 210 (2), 357-396 (2018).
- Nikolaev, M., et al. Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis. Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).
- Knoblich, J. A. Mechanisms of asymmetric stem cell division. Cell. 132 (4), 583-597 (2008).
- Daniel, E., et al. Coordination of septate junctions assembly and completion of cytokinesis in proliferative epithelial tissues. Current Biology. 28 (9), 1380-1391 (2018).
- Pasquettaz, R., et al. Peculiar protrusions along tanycyte processes face diverse neural and non-neural cell types in the hypothalamic parenchyma. Journal of Comparative Neurology. , (2020).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
- Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7 (6), 38011 (2012).
- Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy image browser: A platform for segmentation and analysis of multidimensional datasets. PLoS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).
