Medición del flujo sanguíneo auricular en cóclea de ratón utilizando una ventana de vaso abierto y microscopía de fluorescencia intravital

Resumen

Un enfoque de ventana de vaso abierto utilizando trazadores fluorescentes proporciona una resolución suficiente para la medición del flujo sanguíneo coclear (CoBF). El método facilita el estudio de los cambios estructurales y funcionales en CoBF en ratón en condiciones normales y patológicas.

Resumen

La transducción del sonido es metabólicamente exigente, y la función normal de la microvasculatura en la pared lateral es crítica para mantener el potencial endococlear, el transporte de iones y el equilibrio de líquidos. Se informa que diferentes formas de trastornos auditivos implican microcirculación anormal en la cóclea. La investigación de cómo la patología del flujo sanguíneo coclear (CoBF) afecta la función auditiva es un desafío debido a la falta de métodos de interrogatorio factibles y la dificultad para acceder al oído interno. Una ventana de vaso abierta en la pared coclear lateral, combinada con microscopía intravital de fluorescencia, se ha utilizado para estudiar los cambios de CoBF in vivo, pero principalmente en conejillos de indias y solo recientemente en el ratón. Este documento y el video asociado describen el método de ventana de vaso abierto para visualizar el flujo sanguíneo en la cóclea del ratón. Los detalles incluyen 1) preparación de la suspensión de células sanguíneas marcadas con fluorescencia de ratones; 2) construcción de una ventana de vaso abierta para microscopía intravital en un ratón anestesiado, y 3) medición de la velocidad y el volumen del flujo sanguíneo utilizando una grabación fuera de línea de las imágenes. El método se presenta en formato de video para mostrar cómo usar el enfoque de ventana abierta en el ratón para investigar cambios estructurales y funcionales en la microcirculación coclear en condiciones normales y patológicas.

Introducción

La función normal de la microcirculación en la pared coclear lateral (que comprende la mayoría de los capilares en el ligamento espiral y la estría vascular) es de importancia crítica para mantener la función auditiva¹. La CoBF anormal está implicada en la fisiopatología de muchos trastornos del oído interno, incluida la pérdida de audición inducida por ruido, la hidropesía del oído y la presbiacusia 2,3,4,5,6,7,8,9.

Protocolo

NOTA: Esta es una cirugía de no supervivencia. Todos los procedimientos que involucran el uso de animales fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Salud y Ciencia de Oregón (número de aprobación de IACUC: TR01_IP00000968).

1. Preparación de las células sanguíneas marcadas con fluorescencia

1. Anestesiar a los ratones donantes (ratones machos C57BL/6J de edad ~6 semanas) con una inyección intraperitoneal (i.p.) de solución anestésica de ketamina/xilazina (5 mL/kg, ver la Tabla de materiales).
   NOTA: Este protocolo de anestesia es muy confiable y manti....

Resultados

Después de la exposición quirúrgica de los capilares cocleares en la pared lateral (Figura 1), la observación microscópica de fluorescencia intravital de alta resolución de células sanguíneas marcadas con Dil en vasos marcados con FITC-dextrano fue factible a través de una ventana de vaso abierta. La Figura 2A es una imagen representativa tomada bajo FIVM que muestra los capilares de la pared lateral del ápice coclear del ápice d.......

Discusión

Este documento demuestra cómo los capilares en la pared lateral coclear (y en la estría vascular) de un modelo de ratón se pueden visualizar con etiquetado fluoróforo en una preparación de ventana de vaso abierto bajo un sistema FIVM. El modelo de ratón es ampliamente utilizado y preferido como modelo de mamífero para investigar la salud humana y la enfermedad. El protocolo descrito aquí es un enfoque factible para obtener imágenes e investigar CoBF en la pared lateral del ratón (particularmente en la estría vascular) ut.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cloruro de sodio al 0,9%	Hospira	NDC 0409-1966-02	0,6 mL (para 1 mL)
1,1′-Dioctadecil-3,3,3′,3′-tetrametilindocarbocianina perclorato	Sigma Aldrich	468495	20 µ M
3,3′-Perclorato de dioctadeciloxacarbocianinaDio (3,3′-Perclorato de dioctadeciloxacarbocianina	Sigma Aldrich	D4292	20 µ M
Sistema de monitoreo CODA	scientific		CODA Monitor, para monitorear la presión arterial y los latidos del corazón
Coverslip	Fisher Scientific	12-542A
DC Temperature Controller	FHC	40-90-8D
Fiji/ImageJ	NIH		Medición del diámetro del recipiente
FITC-dextrano (2000 kDa)	Sigma Aldrich	FD2000s	40 mg/mL
Inyección de heparina sódica, USP MDV	Mylan	NDC 67457-374-12	5000 unidades USP/mL
Katathesia (100 mg/mL)	Henry Schein	NDC 11695-0702-1	0.2 mL (para 1 mL)
Objetivo de microscopio	Mitutoyo	378-823-5	Modelo: M Plan Apo NIR 10x
ORCA-ER Cámara	Hamamatsu		Modelo: C4742-80-12AG
PBS	Gibco	2085387
Xyzaína (100 mg/ml, 5 veces diluido para su uso)	Lloyd	LPFL04821	0,2 mL (para 1 mL)
Microscopio estereoscópico Zoom	Olympus		Modelo: SZ61, microscopio fluorescente

Kent