Flujo de trabajo de proteómica cuantitativa sin etiquetas para interacciones host-patógenos impulsadas por el descubrimiento

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para perfilar la interacción entre el huésped y el patógeno durante la infección por proteómica basada en espectrometría de masas. Este protocolo utiliza la cuantificación libre de etiquetas para medir los cambios en la abundancia de proteínas tanto del huésped (por ejemplo, macrófagos) como del patógeno (por ejemplo, Cryptococcus neoformans)en un solo experimento.

Abstract

Los logros tecnológicos de la proteómica cuantitativa basada en espectrometría de masas (EM) abren muchas vías no descubiertas para analizar el proteoma global de un organismo en condiciones variables. Esta poderosa estrategia aplicada a las interacciones de patógenos microbianos con el huésped deseado caracteriza ampliamente ambas perspectivas hacia la infección. En este documento, el flujo de trabajo describe la cuantificación libre de etiquetas (LFQ) del infectoma de Cryptococcus neoformans, un patógeno intracelular facultativo facultativo fúngico que es el agente causal de la enfermedad mortal cryptococcosis, en presencia de células de macrófago inmortalizadas. El protocolo detalla las técnicas adecuadas de preparación de proteínas para células patógenas y mamíferos dentro de un solo experimento, lo que resulta en la presentación adecuada de péptidos para el análisis de cromatografía líquida (LC)-EM/EM. La naturaleza genérica de alto rendimiento de LFQ permite un amplio rango dinámico de identificación y cuantificación de proteínas, así como transferibilidad a cualquier entorno de infección de patógeno huésped, manteniendo una sensibilidad extrema. El método está optimizado para catalogar perfiles extensos e imparciales de abundancia de proteínas de un patógeno dentro de condiciones que imitan infecciones. Específicamente, el método demostrado aquí proporciona información esencial sobre la patogénesis C. neoformans, como la producción de proteínas necesaria para la virulencia e identifica proteínas huésped críticas que responden a la invasión microbiana.

Introduction

La prevalencia de infecciones fúngicas invasivas está aumentando enormemente y está correlacionada con tasas de mortalidad inaceptablemente altas, más comúnmente notificadas en individuos con predisposiciones inmunodeficientes^1. Cryptococcus neoformans es un famoso patógeno fúngico oportunista capaz de sobrevivir intracelularmente dentro de las células de macrófago huésped. La intervención antifúngica inadecuada da como resultado la difusión fúngica y manifestaciones potencialmente mortales de meningitis criptocócica y meningoencefalitis^2,3. El aumento global del estatus inmuno....

Protocol

Una línea inmortalizada de macrófagos derivados de ratones BALB/c fueron utilizados para el siguiente protocolo aprobado por el Protocolo de Utilización Animal 4193 de la Universidad de Guelph. En particular, otras cepas de ratones u otras fuentes de células inmortalizadas se pueden aplicar al protocolo descrito con pruebas suficientes para optimizar los parámetros detallados. El siguiente protocolo navegará por los pasos que comienzan con un vial congelado de células de macrófago. Las células se almacenan en 10% FBS (suero bovino fetal), 1% L-glutamina y 5% Pen/Estreptomicina (Penicillin-Streptomicina) mezcla a DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) y 20% DMSO (sulf....

Results

El protocolo descrito anteriormente permite la identificación y cuantificación de proteínas derivadas tanto del patógeno fúngico, C. neoformans,como del huésped, células de macrófago, en un solo experimento. Tras el co-cultivo, las células se recogen y procesan juntas y se separan bioinformáticamente en función de perfiles péptidos específicos de cada especie. Este es un enfoque poderoso para definir la interacción de la relación huésped-patógeno durante la infección. El número de proteínas identificadas a parti.......

Discussion

Los pasos críticos en el protocolo incluyen la preparación de células de macrófago y la recolección de muestras de co-cultivo para el procesamiento de proteínas con una interrupción mínima de las células. Es importante realizar pasos de lavado, inoculación y eliminación de células de macrófago adherentes de forma suave y cuidadosa para evitar la lisis innecesaria de las células antes de la recolección. Establecer el MOI correcto para el experimento también es crítico, ya que la inoculación con un MOI excesivamente alto p.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mM Tris-HCl, pH 8.5	Fisher Scientific	BP152-1	mantener a 4° C
60 x 15 mm Plato, Nunclon Delta	ThermoFisher Scientific	174888
placa de cultivo celular de 6 pocillos	ThermoFisher Scientific	140675
Acetonitrilo, grado MS	Pierce	TS-51101
Ácido Acético	Sigma Aldrich	1099510001
Acetona	Sigma Aldrich	34850-1L
Amonio bicarbonato (ABC)	ThermoFisher Scientific	A643-500	Prepare una solución ABC de 50 mM, estable a temperatura ambiente durante un máximo de un mes.
Bel-Art™ Sistema de recolección de aspirador de vacío HiFlow	Fisher Scientific	13-717-300	No es esencial, las pipetas serológicas se pueden utilizar para eliminar medios.
Resina C18	3M Empore	3M2215
Raspadores de células	VWR	10062-906	No es esencial, se pueden utilizar otros métodos para liberar células de macrófagos.
Concentrador centrífugo de vacío	Eppendorf	07-748-15
Unidad de filtración completa	VWR	10040-436
Tubos cónicos de halcón (15 mL)	Fisher Scientific	05-539-12
Countess II Contador de células automatizado	ThermoFisher Scientific	AMQAX1000	No es esencial, el hemocitómetro puede utilizarse como alternativa.
CytoTox 96 Ensayo de citotoxicidad no radiactiva	Promega	G1780
Ditiotritol (DTT)	ThermoFisher Scientific	R0861	Prepare una solución madre a granel de 1 M de DTT, congelada rápidamente y almacenada a -20 °C; C hasta su uso. Deseche después de cada uso (no congele y descongele repetidamente).
DMEM, glucosa alta, Suplemento GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	10566016
Suero Fetal Bovino (FBS)	ThermoFisher Scientific	12483020	Inactivar el calor incubando a 60 grados; C durante 30 minutos. Preparar 50 ml de alícuotas y congelar rápidamente. Descongelación antes de la preparación del medio
Hemocitómetro	VWR	15170-208
HEPES	Sigma Aldrich	H3375	Preparación de 40 mM HEPES/8 M de urea en solución madre a granel, ultracongelada, almacenar a -20 grados; C hasta su uso. Deseche después de cada uso (no congele y descongele repetidamente).
Sistema de cromatografía líquida de alta resolución	ThermoFisher Scientific	LC140	La longitud del gradiente se basa en la complejidad de la muestra, se recomienda un gradiente de 120 minutos para muestras de infeccio.
Espectrómetro de masas de alta resolución	ThermoFisher Scientific	726042
Yodoacetamida (IAA)	Sigma Aldrich	I6125	Prepare una solución de stock a granel de 0,55 M, congelada rápidamente, almacene a -20 grados; C hasta su uso. Deseche después de cada uso (no congele y descongele repetidamente).
L-glutamina	ThermoFisher Scientific 25030081		Puede ser alícuota y congelar para su almacenamiento. Descongele antes de la preparación de los medios.
Tubos de microcentrífuga LoBind	Eppendorf	13-698-794
MaxQuant	https://maxquant.org/		MaxQuant es una plataforma pública que ofrece tutoriales, como la Escuela de verano MaxQuant, que describe los pasos del análisis computacional de grandes conjuntos de datos MS
Microcentrífuga	Eppendorf	13864457
Penicilina : Estreptomicina 10k/10k	VWR	CA12001-692	Puede ser alícuota y congelado para su almacenamiento. Descongele antes de la preparación de los medios.
Columnas de separación de péptidos	ThermoFisher Scientific	ES803
Perseus Software	http://maxquant.net/perseus/
solución salina tamponada con fosfato	VWR	CA12001-676	No se requiere Puchase. También se puede preparar PBS, pero se debe realizar una filtración estéril antes de su uso.
Ensayo de proteínas Pierce BCA	ThermoFisher Scientific	23225
Pipeta, serológica desechable (10 mL)	Fisher Scientific	13-678-11E
pipeta, serológica desechable (25 mL) Basix	Fisher Scientific	14955235
Sonciador de sonda	ThermoFisher Scientific	100-132-894
Comprimido cóctel inhibidor de proteasa	Roche 4693159001
Dodecil sulfato de sodio	ThermoFisher Scientific	28364 20	% (c/v)
Espectrofotómetro (Nanodrop)	ThermoFisher Scientific	ND-2000
STAGE centrífuga de vuelco	Sonation	STC-V2
Agitador térmico	VWR	NO89232-908
Ácido trifluoroacético	ThermoFisher Scientific	85183
Mezcla de tripsina/proteasa Lys-C, Perforación de grado MS		A40007	Mantener a -20 °C.
Baño ultrasónico	Bransonic	A89375-450	Almacenado en cámara frigorífica (4C)
Urea	Sigma Aldrich	U1250-1KG	Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea en solución de stock a granel, congelada rápidamente, almacene a -20 & grados; C hasta su uso. Deseche después de cada uso (no congele y descongele repetidamente).
Extracto de levadura caldo de peptona dextrosa	BD Difco	BM20