Flujo de trabajo de proteómica cuantitativa sin etiquetas para interacciones host-patógenos impulsadas por el descubrimiento

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para perfilar la interacción entre el huésped y el patógeno durante la infección por proteómica basada en espectrometría de masas. Este protocolo utiliza la cuantificación libre de etiquetas para medir los cambios en la abundancia de proteínas tanto del huésped (por ejemplo, macrófagos) como del patógeno (por ejemplo, Cryptococcus neoformans)en un solo experimento.

Abstract

Los logros tecnológicos de la proteómica cuantitativa basada en espectrometría de masas (EM) abren muchas vías no descubiertas para analizar el proteoma global de un organismo en condiciones variables. Esta poderosa estrategia aplicada a las interacciones de patógenos microbianos con el huésped deseado caracteriza ampliamente ambas perspectivas hacia la infección. En este documento, el flujo de trabajo describe la cuantificación libre de etiquetas (LFQ) del infectoma de Cryptococcus neoformans, un patógeno intracelular facultativo facultativo fúngico que es el agente causal de la enfermedad mortal cryptococcosis, en presencia de células de macrófago inmortalizadas. El protocolo detalla las técnicas adecuadas de preparación de proteínas para células patógenas y mamíferos dentro de un solo experimento, lo que resulta en la presentación adecuada de péptidos para el análisis de cromatografía líquida (LC)-EM/EM. La naturaleza genérica de alto rendimiento de LFQ permite un amplio rango dinámico de identificación y cuantificación de proteínas, así como transferibilidad a cualquier entorno de infección de patógeno huésped, manteniendo una sensibilidad extrema. El método está optimizado para catalogar perfiles extensos e imparciales de abundancia de proteínas de un patógeno dentro de condiciones que imitan infecciones. Específicamente, el método demostrado aquí proporciona información esencial sobre la patogénesis C. neoformans, como la producción de proteínas necesaria para la virulencia e identifica proteínas huésped críticas que responden a la invasión microbiana.

Introduction

La prevalencia de infecciones fúngicas invasivas está aumentando enormemente y está correlacionada con tasas de mortalidad inaceptablemente altas, más comúnmente notificadas en individuos con predisposiciones inmunodeficientes^1. Cryptococcus neoformans es un famoso patógeno fúngico oportunista capaz de sobrevivir intracelularmente dentro de las células de macrófago huésped. La intervención antifúngica inadecuada da como resultado la difusión fúngica y manifestaciones potencialmente mortales de meningitis criptocócica y meningoencefalitis^2,3. El aumento global del estatus inmunodeprimido ha exigido un aumento paralelo en el uso de agentes antifúngicos, en el que muchas especies fúngicas, incluyendo C. neoformans, han evolucionado cada vez más la resistencia hacia^4,5,6. Por lo tanto, es imperativo implementar tecnologías sólidas y eficientes para responder a preguntas biológicas vitales con respecto a la respuesta de la defensa del huésped y la patogénesis microbiana.

La nueva era del avance tecnológico en espectrometría de masas (EM), incluida la generación de potentes tuberías computacionales y bioinformáticas, proporciona la base para una visión integrativa para el análisis a gran escala de la investigación de patógenos de host^7,8. El análisis proteómico convencional impulsado por patógenos comúnmente perfila la vista de la infección desde la perspectiva del huésped o patógeno, incluyendo metodologías integrales tales como perfiles de correlación de proteínas, cromatografía de afinidad combinada con proteómica e interactómica^9. Las investigaciones sobre la virulencia de patógenos peligrosos en un sistema huésped son de inmensa importancia clínica; sin embargo, la aplicación de un análisis de doble perspectiva en un solo experimento se consideraba antes inalcanzable. Por ejemplo, la perspectiva del patógeno hacia la infección a menudo se desborda por proteínas huésped altamente abundantes, lo que resulta en una sensibilidad reducida para la detección de proteínas fúngicas de baja abundancia⁷. Además, la alta complejidad de la muestra invita a muchos objetivos a investigar en un solo sistema experimental y resulta difícil de dilucidar los mecanismos de acción para una proteína patógena específica.

La proteómica ascendente es una técnica popular de EM que permite la preparación manejable de muestras, en la que los péptidos se generan mediante digestión enzimática específica de la secuencia seguida de separación, identificación y cuantificación de cromatografía líquida por MS^10,11. Aquí, presentamos un método que demuestra una estrategia de adquisición dependiente de los datos con el propósito de lograr una cobertura imparcial de un proteoma o 'infectoma' basado en infecciones. En concreto, la cuantificación libre de etiquetas (LFQ) arroja la dependencia de las etiquetas químicas o metabólicas para una identificación robusta y precisa de los cambios en el nivel de proteínas en múltiples proteomas, reduciendo la manipulación y el procesamiento de muestras^{pasos 12,13}. Esta aplicación universal interroga las proteínas producidas en un momento dado dentro de una célula independientemente de cualquier producción de proteína esperada; por lo tanto, se pueden descubrir nuevos conocimientos que son críticos para la infección.

El flujo de trabajo descrito aquí está optimizado para explorar los cambios en el nivel de proteínas de C. neoformans durante las condiciones de imitación de infecciones con células inmunes huésped (Figura 1). En lugar de basarse en el aislamiento y separación de los tipos celulares, este enfoque extrae el proteoma huésped y patógeno juntos, y utiliza la separación bioinformática utilizando dos bases de datos específicas del organismo para distinguir la producción de proteínas específicas de especies. Este método ofrece ventajas para un número ilimitado de muestras que se procesarán sin los costosos pasos de preparación necesarios en estudios de etiquetado o fraccionamiento basados en isótopos. Además, este flujo de trabajo admite protocolos optimizados de extracción de proteínas transferibles a una amplia gama de patógenos fúngicas y bacterianos capaces de atacar e infectar las células inmunes huésped. En general, este protocolo describe los pasos para completar una extracción de proteínas imparcial y procesamiento de muestras para EM de alta resolución, seguido de datos y análisis estadísticos, capaces de proporcionar una gran cantidad de conocimiento de proteínas fúngicas significativas para la infección combinadas con un perfil integral de la respuesta de defensa del huésped.

Protocol

Una línea inmortalizada de macrófagos derivados de ratones BALB/c fueron utilizados para el siguiente protocolo aprobado por el Protocolo de Utilización Animal 4193 de la Universidad de Guelph. En particular, otras cepas de ratones u otras fuentes de células inmortalizadas se pueden aplicar al protocolo descrito con pruebas suficientes para optimizar los parámetros detallados. El siguiente protocolo navegará por los pasos que comienzan con un vial congelado de células de macrófago. Las células se almacenan en 10% FBS (suero bovino fetal), 1% L-glutamina y 5% Pen/Estreptomicina (Penicillin-Streptomicina) mezcla a DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) y 20% DMSO (sulfóxido de dimetil).

1. Cultivo de C. neoformans

1. Usando una caldo de glicerol, cola de agar de tipo salvaje C. neoformans (H99) sobre peptona dextrosa de extracto de levadura (YPD) para aislar colonias individuales.
2. Incuba durante la noche durante 16 h a 37 °C en una incubadora estática.
3. Seleccione una sola colonia de cepa y cultivo de neoformanos de tipo C. en 5 ml de caldo YPD en un tubo de ensayo de 10 ml ligeramente tapado. Actuar en cuadrúplicado.
4. Incuba durante la noche durante 16 h a 37 °C en una incubadora de temblores a 200 rpm.
5. Al día siguiente subcultura cada cultura durante la noche en una dilución de 1:100 en caldo YPD de 3 ml.
6. Mida los valores de densidad óptica (OD_600nm)de la referencia cultural fúngica para determinar la fase de registro medio. Dependiendo del espectrofotómetro, la cepa de tipo salvaje C. neoformans alcanza la fase de registro medio comúnmente después de la incubación de 6 a 8 h en YPD con valores generales de OD_600nm que van de 1.0 a 1.5.
7. Una vez que las células lleguen a la fase de registro medio, tome una alícuota de 10 μL de suspensión de células fúngicas en un tubo limpio de microcentrífuga de 1,5 ml y diluya 1:100 en solución salina estéril de 1x fosfato amortiguado (PBS). Cuente el número de células usando un hemociclo.

2. Cultivo de células de macrófago

NOTA: Asegúrese de que el entorno de trabajo esté esterilizado antes del trabajo de cultivo celular.

1. Preparación del medio de cultivo celular
   1. Medio suplementado con antibióticos: Añadir 10% FBS (suero bovino fetal), 1% L-glutamina y 5% Pen/Estreptococo (Penicilina-Estreptomicina) mezcla a DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium). Filtre el medio a través de un sistema de filtro completo de 0,2 μm y guárdelo a 4 °C.
   2. Medio libre de antibióticos: Siga el protocolo idéntico pero omita la mezcla de pluma/estreptococo.
2. Células de macrófago de siembra
   NOTA: El medio suplementado con antibióticos (2.1.1.) debe calentarse a 37 °C antes del trabajo de cultivo celular.
   1. Descongelar el vial de las células del macrófago rápidamente en el baño de cuentas a 37 °C.
   2. Lave las células de la solución de congelación resuspendiendo las células en un medio con antibióticos de 1 ml.
      NOTA: Se requiere precaución adicional para garantizar que las células no selicen debido a la tubería dura.
   3. Transfiera las células resuspendidas a un tubo estéril de 15 ml.
   4. Células de pellets centrifugando a 400 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
   5. Retire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta serológica o aspirador al vacío.
   6. Pellet suavemente resuspend en 10 ml de medio suplementado con antibióticos.
   7. Pipeta suavemente resuspended células en un plato tratado con cultivo celular de 60 x 15 mm.
   8. Incubar el plato a 37 °C con un 5% de CO₂ durante la noche.
3. Paso inicial de células de macrófago
   NOTA: Las poblaciones de células congeladas normalmente contendrán entre 5 y 10 millones de células por vial (aprox. 1 ml). El día siguiente, las células de macrófago que han sobrevivido al protocolo de siembra se adherirán a la parte inferior del plato de cultivo celular y estarán listas para la transferencia.
   1. Medio caliente suplementado con antibióticos (paso 2.1.1) a 37 °C antes del trabajo de cultivo celular. Asegúrese de que el entorno de trabajo esté esterilizado antes del trabajo de cultivo celular. Visualice las células utilizando un microscopio de luz para garantizar que las células se cumplan y estén sanas.
   2. Retire el medio de cultivo celular del plato, ya sea con una pipeta serológica o un aspirador de vacío.
   3. Agregue suavemente 5-7 ml de PBS estéril a temperatura ambiente (solución salina amortiguada por fosfato) al plato de 60 x 15 mm.
   4. Incline suavemente el plato para lavar las células adherentes.
   5. Retire PBS con una pipeta serológica o un aspirador de vacío.
   6. Añadir 1 ml de PBS frío (almacenado a 4 °C) a las células, inclinar el plato para distribuir PBS sobre todas las células, y dejar reposar a temperatura ambiente durante 1 minuto.
   7. Libere las células tocando suavemente el plato, pipeteando PBS frío contra las células, o usando un raspador de células.
   8. Agregue 9 ml de medio con antibióticos al plato.
   9. En un nuevo plato de 60 x 15 mm, agregue 9 ml de medio recién complementado con antibióticos y 1 ml de células resuspended del plato original.
   10. Una vez que se ha llenado el número de placas de passaging deseadas, se pueden descartar las células resuspended del plato original.
   11. Incubar el nuevo plato en los ajustes mencionados anteriormente (paso 2.2.8).
   12. Realice la passaging posterior cuando las células hayan alcanzado el 70-80% de confluencia (aproximadamente cada 2 días dependiendo de la línea celular y el medio utilizados).
       NOTA: Las células de macrófago deben pasarse un mínimo de cinco veces antes de los experimentos de infección. Dependiendo de la línea celular, los experimentos de infección deben realizarse por 25 a 30 pasajes. Después de 25 a 30 pasajes, las células deben congelarse o desecharse. La sección 2.4 o 2.5 se puede elegir en función de los planes experimentales. La sección 2.4 se utilizará para las siguientes secciones.
4. Semillas de células de macrófago antes de la infección
   1. Realice los pasos del protocolo de passaging 2.3.1 a 2.3.7.
   2. El uso de un hemocítómetro o contador de células automatizado determina la densidad celular (células/ml).
   3. Transfiera 0,3 x^{10 6} células de macrófago a un solo pozo de una placa de cultivo celular de 6 pozos.
   4. Ajuste el volumen total de pozo a 1 ml utilizando medio suplementado con antibióticos (paso 2.1.1).
   5. Repita los pasos 2.4.3 y 2.4.4 hasta que se hayan llenado 8 pozos (4 pozos llenos en dos placas separadas).
   6. Opcionalmente, llene los dos pozos restantes con 1 ml de PBS a temperatura ambiente para mantener los niveles de humedad durante la incubación.
   7. Permitir que las células crezcan en condiciones de incubación mencionadas en el paso 2.2.8 para 2 d antes de la infección.
5. Sembrar células de macrófago el día de la infección
   1. Realice los pasos del protocolo de passaging 2.3.1 a 2.3.7.
   2. El uso de un hemocítómetro o contador de células automatizado determina la densidad celular (células/ml).
   3. Semillas 1.2 x 10⁶ células de macrófago en un solo pozo de una placa de cultivo celular de 6 pozos.
   4. Ajuste el volumen total de pozo a 1 ml utilizando medio suplementado con antibióticos (2.1.1).
   5. Repita 2.4.3 y 2.4.4 hasta que se hayan llenado 8 pozos (4 pozos llenos en dos placas separadas).
   6. Opcionalmente, llene los dos pozos restantes con 1 ml de PBS a temperatura ambiente para mantener los niveles de humedad durante la incubación.
   7. Incubar células en condiciones mencionadas en el paso 2.2.8 para 3 h para permitir que las células se adhieran a los pozos.

3. Infección de células de macrófago con C. neoformans

NOTA: Al alcanzar un 70-80% de confluencia, habrá aproximadamente 1,2 x 10⁶ células de macrófago por pozo. Para lograr la multiplicidad deseada de infección (MOI) de 100:1, se requieren 1,2 x 10⁸ células fúngicas para cada reacción. Las culturas deben establecerse en consecuencia en cuadruplicato biológico.

DESCARGO DE RESPONSABILIDAD: Un MOI de 100:1 ha logrado resultados deseables en nuestro grupo de investigación y está destinado como una sugerencia a los lectores. Puede ser necesario un MOI más bajo para cepas más infecciosas de C. neoformans o para líneas celulares de macrófago menos resistentes. La verificación de la infección (sección 3.5) se puede utilizar para determinar el MOI ideal para determinados C. neoformans – combinaciones de macrófago.

1. Preparación de células fúngicas
   1. Siga el paso 1 para el crecimiento de C. neoformans a la fase de registro medio.
   2. Recoger y centrifugar células a 1.500 x g durante 10 minutos, lavar suavemente pellet con PBS estéril a temperatura ambiente, y repetir para un total de tres lavados.
   3. Células resuspend en medio de cultivo celular libre de antibióticos (paso 2.1.2) para lograr una concentración de 1,2 x 10⁸ células/ml.
2. Preparación de células de macrófago
   1. Visualice cada pozo en la placa de 6 pozos para asegurarse de que las células han alcanzado el 70-80% de confluencia. Alternativamente, las células se pueden medir para lograr aproximadamente 1,2 x 10⁶ células de macrófago por pozo.
   2. Siga los pasos 2.3.1 a 2.3.4.
3. Co-cultivo de C. neoformans y células de macrófago
   1. Agregue 1 ml de las células C. neoformans resuspended (paso 3.1.3) a 4 pozos que contengan células de macrófago preparadas en la sección 3.2.
      NOTA: El número de placas necesarias deberá calcularse antes de comenzar el experimento. Añadir 1 ml de medio libre de antibióticos (paso 2.1.2) a pozos vacíos.
   2. Permitir que las células se incuban en condiciones enumeradas (paso 2.2.8) durante 3 h.
   3. Retire el medio de cultivo celular de la placa con una pipeta serológica o un aspirador de vacío.
   4. Agregue suavemente 1 ml de PBS estéril a temperatura ambiente.
   5. Incline suavemente la placa para lavar las células extracelulares C. neoformans no unidas o no fagocitos.
   6. Retire PBS usando una pipeta serológica o aspirador al vacío, repita para un total de tres lavados. Repita 3.3.4 a 3.3.5 dos veces más.
4. Macrófagos no infectados
   1. Del mismo modo, utilice 4 pozos de una placa de 6 pozos para servir como muestras solo de macrófago. Añadir 1 ml de medio libre de antibióticos (paso 2.1.2) a estos pozos.
   2. Repita los pasos del 3.3.2 al 3.3.6.
5. Verificación de la infección
   NOTA: Utilizando un ensayo de citotoxicidad, se puede medir el dominio de la infección. El siguiente protocolo destacará la aplicación de un producto de citotoxicidad para medir la liberación de LDH (lactato deshidrogenasa). También se pueden utilizar otros productos de citotoxicidad.
   1. Preparación de la infección de C. neoformans de células de macrófago
      1. Repite los pasos 1, 2 y 3 (hasta 3.5). El ensayo LDH se puede realizar en triplicado, si se prefiere.
      2. Siguiendo el paso 3.3.6, agregue 1 ml de medio libre de antibióticos (2.1.2) a cada pozo en la placa de 6 pozos.
      3. Repita los pasos 2.4.3 y 2.4.4 hasta que se hayan llenado 3 pozos más 3n pozos (donde n es el número de puntos de tiempo medidos).
      4. Incubar células en condiciones enumeradas en el paso 2.2.8.
      5. En los puntos de tiempo seleccionados (por ejemplo, 1, 3, 6, 12 y 24 horas) recoger sobrenadante para la medición de la liberación de LDH de acuerdo con las instrucciones del fabricante
      6. Al mismo tiempo, las células de macrófago no infectadas se usarán a un valor determinado para la citotoxicidad máxima.
      7. Calcule la citotoxicidad de la siguiente manera:
         

4. Colección de muestras

1. Co-cultura y colección de macrófago no infectado
   1. Añadir 1 ml de PBS frío a las células (de 3.3.6 y 3.4.2) y dejar reposar a temperatura ambiente durante 1 min.
   2. Libere las células de la placa tocando suavemente la placa o canalizando suavemente pbs frío contra las células.
      NOTA: El raspador de células debe evitarse, ya que esto podría causar lisis de las células.
   3. Pipeta resuspended células en un tubo de 15 ml.
   4. Centrífugas a 400 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente, y retire el sobrenadante.
   5. Células de proceso (como se detalla en el paso 5) inmediatamente o flash congelado en nitrógeno líquido y almacenado a -80 °C para su procesamiento posterior.

5. Proteoma celular

NOTA: Se debe optimizar suficiente lisis para el tipo de célula analizado (es decir, la cantidad de ciclos y amplitudes depende del tamaño del pellet celular y del porcentaje de potencia del modelo sonicador de sonda).

1. Lisis celular de macrófago infectada
   1. Células peletadas resuspend (paso 4.1.5) en 300 μL de 100 mM Tris-HCl (pH 8.5) que consiste en un comprimido de cóctel inhibidor de la proteasa recién disuelto.
      NOTA: Un comprimido de cóctel inhibidor de la proteasa se añade a 10 ml de frío helado 100 mM Tris-HCl (pH 8.5) antes de comenzar el experimento.
   2. Sondear células sonicadas en un baño de hielo durante 15 ciclos de 30 s encendidos y 30 s apagados, para liar las células.
   3. Células centrífugas brevemente para 30 s a 400 x g,cuidado de no formar un pellet, sólo para eliminar líquido en los lados de los tubos seguido de la transferencia de la muestra a un tubo de microcentrífuga lo-bind de 2 ml.
   4. Añadir 1:10 volumen de 20% SDS a una concentración final de 2%.
   5. Añadir 1:100 volumen de 1 M dithiothreitol (TDT) a una concentración final de 10 mM y mezclar la muestra a fondo mediante pipeteo, seguido de incubación en un bloque de calefacción térmica a 95 °C durante 10 minutos a 800 rpm de agitación. A continuación, frío a temperatura ambiente (el enfriamiento se puede hacer en hielo).
   6. Añadir 1:10 volumen de 0.55 M iodoacetamida (IAA) para obtener una concentración final de 55 mM y mezclar la muestra a fondo por pipeteo. Incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 20 minutos.
   7. Añadir 100% acetona para obtener una concentración final de acetona del 80% y almacenar la muestra durante la noche a -20 °C para precipitar proteínas.
2. Digestión de proteínas
   1. Al día siguiente, recoger el pellet precipitado por centrifugación durante 10 minutos a 10.000 x g y 4 °C. Deseche el sobrenadante y lave el pellet con 500 μL de acetona al 80%. Repita para un total de dos lavados. Pellet seco al aire a temperatura ambiente después de los lavados.
   2. Resolubilizar pellet proteico en 100 μL de 8 M urea/40 mM HEPES, para asegurar una solubilización completa, vórtice o sonicato en un baño de agua helada durante 15 ciclos de 30 s encendido y 30 s de descuento.
      NOTA: El ajuste del volumen de urea/HEPES se determina en el tamaño del pellet de celda precipitado, si se producen alteraciones todos los volúmenes aguas abajo deben ajustarse adecuadamente.
   3. Cuantifique la concentración de proteínas utilizando un ensayo proteico (por ejemplo, ensayo proteico BCA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y ajuste para la medición de fondo mediante la normalización en blanco con HEPES de 8 M urea/40 mM.
   4. Añadir 300 μL de bicarbonato de amonio de 50 mM para obtener una concentración final de 2 M de urea.
      NOTA: Oportunidad de normalizar la concentración de proteínas para mediciones aguas abajo, sugerida para digerir 100 μg de proteína y almacenar la muestra no digerida restante por congelación repentina en nitrógeno líquido y luego almacenar a -20 °C a corto plazo, o a -80 °C para largo plazo.
   5. Añadir 2:50 (v/w) relación enzima-proteína de la mezcla de trippsina /Lys-C proteasa en hielo y suavemente toque tubo para mezclar, incubar durante la noche a temperatura ambiente.
   6. Después de la incubación, detenga la digestión añadiendo 1:10 solución de parada de volumen (20% acetonitrilo, 6% ácido trifluoroacético) y muestras de centrífuga a 10.000 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
   7. Recoger sobrenadante(consta de péptidos digeridos)y desechar cualquier residuo peletado o precipitarse.
3. Desalting peptídica
   1. Active una punta de extracción C18 Stop And Go (STAGE) (que consiste en 3 capas de resina C18 en una punta de pipeta de 200 μL) añadiendo 100 μL de acetonitrilo al 100% y centrífuga a 1.000 x g durante 2 minutos.
   2. Equilibrar la punta C18 STAGE añadiendo 50 μL de acetonitrilo buffer B (80% (v/v), ácido acético del 0,5% (v/v) ) y centrífuga a 1.000 x g durante 2 minutos.
   3. Eequilibrar la punta C18 STAGE añadiendo 200 μL de acetonitrilo buffer A (2% (v/v), ácido trifluoroacético del 0,1% (v/v), ácido acético del 0,5% (v/v) y centrífuga a 1.000 x g durante 3-5 minutos.
   4. Añadir ~ 50 μg de muestra digerida en la punta C18 STAGE y centrífuga a 1.000 x g durante 3-5 minutos, o hasta que la muestra haya pasado a través de la columna de giro. Flash congelar la muestra digerida restante en nitrógeno líquido y almacenar a -20°C, hasta que sea necesario.
   5. Lave la punta C18 STAGE con 200 μL de buffer A y centrífuga a 1.000 x g durante 3-5 min.
   6. Añadir 50 μL Buffer B a la punta C18 STAGE y centrífuga a 500 x g durante 2 min. Recoger péptidos elutados en tubos PCR de 0,2 ml.
   7. Seque los péptidos elutados en una centrífuga de vacío durante 30-40 minutos a la velocidad máxima. Las muestras completamente secas pueden almacenarse a temperatura ambiente o a -20 °C hasta que se procesen.
      NOTA: Péptidos secos y desalados son envíos de muestras apropiados a instalaciones de espectrometría de masas para su procesamiento y pueden enviarse a temperatura ambiente.

6. Espectrometría de masas

1. Reconstituir péptidos en 10 μL Buffer A y medir la concentración necesaria para inyectar ~1.5 a 3 μg péptidos en la columna MS. La cantidad de muestra dependerá de la instrumentación.
2. Utilice un gradiente predeterminado de acetonitrilo (aprox. 5-60 %) 0,5% de ácido acético durante el tiempo deseado (por ejemplo, 2 h) para separar péptidos por cromatografía líquida de alto rendimiento, seguido de ionización de electrospray en el espectrómetro de masas.
3. Adquiera exploraciones de EM utilizando un espectrómetro de masa de alta resolución en modo de adquisición dependiente de datos(m/z 300 a 1650).
   NOTA: El porcentaje de degradado y la longitud están determinados por el experimento y el usuario. La configuración precisa del espectrómetro de masa depende de la instrumentación, el experimento y la preferencia del usuario.

7. Análisis de datos

NOTA: Los datos de MS se pueden procesar con numerosas canalizaciones bioinformáticas. En este protocolo, describimos el procesamiento utilizando las plataformas MaxQuant y Perseus disponibles públicamente, pero recomendamos a los usuarios individuales que evalúen las herramientas bioinformáticas adecuadas para el análisis, la preferencia y el uso.

1. Cargue archivos de datos no procesados (directamente desde el instrumento MS) mediante el software MaxQuant. Identificar proteínas bajo los parámetros de búsqueda maxquant modificados; mínimo de dos péptidos únicos necesarios para la identificación de proteínas utilizando un enfoque de señuelo objetivo para una tasa de descubrimiento falsa del 1%, implementar la cuantificación libre de etiquetas con la coincidencia entre corridas, incorporar el archivo FASTA de organismos obtenido de la base de datos UniProt (es decir, Cryptococcus neoformans H99, Mus musculus)para identificar y cuantificar los péptidos actuales con el motor de búsqueda de Andrómeda. Consulte las herramientas públicas en línea de MaxQuant para obtener tutoriales detallados (consulte Tabla de materiales).
2. Cargue el archivo de salida MaxQuant ('proteingroups.txt') en Perseus.
3. Filtre filas que contengan posibles falsos positivos y contaminantes, así como solo modificadas por péptidos de sitio con el 'Filtrar filas basadas en columna categórica'.
4. Transforme los valores de datos en la escala del registro_2.
5. Cree grupos de conjuntos de datos proporcionando anotación categórica a las filas.
6. Filtre el dataset por valores válidos para definir un corte para la detección de proteínas.
   NOTA: Para un análisis riguroso y robusto se sugiere una tasa de identificación del >50%. Por ejemplo, si se procesaran cuatro réplicas, se seleccionaría un número mínimo de tres valores válidos.
7. Si es preferible, impute los datos reemplazando los valores que faltan de la distribución normal.
   NOTA: Los valores imputados están optimizados en función de la distribución normal y proporcionan una intensidad aleatoria de LFQ para reemplazar los marcadores de posición 'NaN' para simular mediciones de abundancia típicas. Esta imputación proporciona una plataforma para el análisis estadístico descendente que requiere datos cuantificables.
8. Añadir anotaciones a las filas de proteínas (por ejemplo, nombres de proteínas, términos de ontología génica).
   NOTA: Este flujo de trabajo de Perseus generado es ahora un marco sólido para el procesamiento bioinformática adicional, el análisis estadístico y la visualización de datos, consultar herramientas públicas en línea de Perseus para tutoriales detallados (consulte Tabla de materiales).

Results

El protocolo descrito anteriormente permite la identificación y cuantificación de proteínas derivadas tanto del patógeno fúngico, C. neoformans,como del huésped, células de macrófago, en un solo experimento. Tras el co-cultivo, las células se recogen y procesan juntas y se separan bioinformáticamente en función de perfiles péptidos específicos de cada especie. Este es un enfoque poderoso para definir la interacción de la relación huésped-patógeno durante la infección. El número de proteínas identificadas a parti...

Discussion

Los pasos críticos en el protocolo incluyen la preparación de células de macrófago y la recolección de muestras de co-cultivo para el procesamiento de proteínas con una interrupción mínima de las células. Es importante realizar pasos de lavado, inoculación y eliminación de células de macrófago adherentes de forma suave y cuidadosa para evitar la lisis innecesaria de las células antes de la recolección. Establecer el MOI correcto para el experimento también es crítico, ya que la inoculación con un MOI excesivamente alto p...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mM Tris-HCl, pH 8.5	Fisher Scientific	BP152-1	mantener a 4° C
60 x 15 mm Plato, Nunclon Delta	ThermoFisher Scientific	174888
placa de cultivo celular de 6 pocillos	ThermoFisher Scientific	140675
Acetonitrilo, grado MS	Pierce	TS-51101
Ácido Acético	Sigma Aldrich	1099510001
Acetona	Sigma Aldrich	34850-1L
Amonio bicarbonato (ABC)	ThermoFisher Scientific	A643-500	Prepare una solución ABC de 50 mM, estable a temperatura ambiente durante un máximo de un mes.
Bel-Art™ Sistema de recolección de aspirador de vacío HiFlow	Fisher Scientific	13-717-300	No es esencial, las pipetas serológicas se pueden utilizar para eliminar medios.
Resina C18	3M Empore	3M2215
Raspadores de células	VWR	10062-906	No es esencial, se pueden utilizar otros métodos para liberar células de macrófagos.
Concentrador centrífugo de vacío	Eppendorf	07-748-15
Unidad de filtración completa	VWR	10040-436
Tubos cónicos de halcón (15 mL)	Fisher Scientific	05-539-12
Countess II Contador de células automatizado	ThermoFisher Scientific	AMQAX1000	No es esencial, el hemocitómetro puede utilizarse como alternativa.
CytoTox 96 Ensayo de citotoxicidad no radiactiva	Promega	G1780
Ditiotritol (DTT)	ThermoFisher Scientific	R0861	Prepare una solución madre a granel de 1 M de DTT, congelada rápidamente y almacenada a -20 °C; C hasta su uso. Deseche después de cada uso (no congele y descongele repetidamente).
DMEM, glucosa alta, Suplemento GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	10566016
Suero Fetal Bovino (FBS)	ThermoFisher Scientific	12483020	Inactivar el calor incubando a 60 grados; C durante 30 minutos. Preparar 50 ml de alícuotas y congelar rápidamente. Descongelación antes de la preparación del medio
Hemocitómetro	VWR	15170-208
HEPES	Sigma Aldrich	H3375	Preparación de 40 mM HEPES/8 M de urea en solución madre a granel, ultracongelada, almacenar a -20 grados; C hasta su uso. Deseche después de cada uso (no congele y descongele repetidamente).
Sistema de cromatografía líquida de alta resolución	ThermoFisher Scientific	LC140	La longitud del gradiente se basa en la complejidad de la muestra, se recomienda un gradiente de 120 minutos para muestras de infeccio.
Espectrómetro de masas de alta resolución	ThermoFisher Scientific	726042
Yodoacetamida (IAA)	Sigma Aldrich	I6125	Prepare una solución de stock a granel de 0,55 M, congelada rápidamente, almacene a -20 grados; C hasta su uso. Deseche después de cada uso (no congele y descongele repetidamente).
L-glutamina	ThermoFisher Scientific 25030081		Puede ser alícuota y congelar para su almacenamiento. Descongele antes de la preparación de los medios.
Tubos de microcentrífuga LoBind	Eppendorf	13-698-794
MaxQuant	https://maxquant.org/		MaxQuant es una plataforma pública que ofrece tutoriales, como la Escuela de verano MaxQuant, que describe los pasos del análisis computacional de grandes conjuntos de datos MS
Microcentrífuga	Eppendorf	13864457
Penicilina : Estreptomicina 10k/10k	VWR	CA12001-692	Puede ser alícuota y congelado para su almacenamiento. Descongele antes de la preparación de los medios.
Columnas de separación de péptidos	ThermoFisher Scientific	ES803
Perseus Software	http://maxquant.net/perseus/
solución salina tamponada con fosfato	VWR	CA12001-676	No se requiere Puchase. También se puede preparar PBS, pero se debe realizar una filtración estéril antes de su uso.
Ensayo de proteínas Pierce BCA	ThermoFisher Scientific	23225
Pipeta, serológica desechable (10 mL)	Fisher Scientific	13-678-11E
pipeta, serológica desechable (25 mL) Basix	Fisher Scientific	14955235
Sonciador de sonda	ThermoFisher Scientific	100-132-894
Comprimido cóctel inhibidor de proteasa	Roche 4693159001
Dodecil sulfato de sodio	ThermoFisher Scientific	28364 20	% (c/v)
Espectrofotómetro (Nanodrop)	ThermoFisher Scientific	ND-2000
STAGE centrífuga de vuelco	Sonation	STC-V2
Agitador térmico	VWR	NO89232-908
Ácido trifluoroacético	ThermoFisher Scientific	85183
Mezcla de tripsina/proteasa Lys-C, Perforación de grado MS		A40007	Mantener a -20 °C.
Baño ultrasónico	Bransonic	A89375-450	Almacenado en cámara frigorífica (4C)
Urea	Sigma Aldrich	U1250-1KG	Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea en solución de stock a granel, congelada rápidamente, almacene a -20 & grados; C hasta su uso. Deseche después de cada uso (no congele y descongele repetidamente).
Extracto de levadura caldo de peptona dextrosa	BD Difco	BM20