Este protocolo proporciona un método eficiente de digestión de colagenasas para el aislamiento de adipocitos viables y células de la fracción vascular estromal-SVF de grasa visceral humana en un solo proceso, incluida la metodología para obtener ARN de alta calidad de los adipocitos y la fenotipificación de los macrófagos SVF mediante la tinción de múltiples marcadores unidos a la membrana para su análisis por citometría de flujo.
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Artículo de método
Aislamiento de adipocitos viables y fracción vascular estromal a partir de tejido adiposo visceral humano adecuado para análisis de ARN y fenotipado de macrófagos
En este artículo
Resumen
Resumen
El tejido adiposo visceral (VAT) es un órgano metabólico activo compuesto principalmente por adipocitos maduros y células de la fracción vascular estromal (SVF), que liberan diferentes moléculas bioactivas que controlan los procesos metabólicos, hormonales e inmunológicos; Actualmente, no está claro cómo se regulan estos procesos dentro del tejido adiposo. Por lo tanto, el desarrollo de métodos que evalúen la contribución de cada población celular a la fisiopatología del tejido adiposo es crucial. Este protocolo describe los pasos de aislamiento y proporciona las pautas de resolución de problemas necesarias para el aislamiento eficiente de adipocitos maduros viables y SVF de biopsias de VAT humanas en un solo proceso, utilizando una técnica de digestión enzimática de colagenasa. Además, el protocolo también está optimizado para identificar subconjuntos de macrófagos y realizar el aislamiento de ARN de adipocitos maduros para estudios de expresión génica, lo que permite realizar estudios de disección de la interacción entre estas poblaciones celulares. Brevemente, las biopsias de VAT se lavan, se pican mecánicamente y se digieren para generar una suspensión unicelular. Después de la centrifugación, los adipocitos maduros se aíslan por flotación del gránulo de SVF. El protocolo de extracción de ARN garantiza un alto rendimiento de ARN total (incluidos los miARN) de los adipocitos para los ensayos de expresión posteriores. Al mismo tiempo, las células SVF se utilizan para caracterizar subconjuntos de macrófagos (fenotipo proinflamatorio y antiinflamatorio) mediante análisis de citometría de flujo.
Introducción
El tejido adiposo blanco está compuesto no solo por células grasas o adipocitos, sino también por una fracción de células no grasas conocida como fracción vascular estromal (SVF), que contiene una población celular heterogénea formada por macrófagos, otras células inmunitarias como células T reguladoras (Tregs) y eosinófilos, preadipocitos y fibroblastos, rodeados de tejido vascular y conectivo 1,2. El tejido adiposo (TA) es considerado actualmente un órgano que regula los procesos fisiológicos relacionados con el metabolismo y la inflamación a través de adipoquinas, citocinas y microRNAs producidos y liberado....
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Protocolo
Este protocolo fue aprobado por el IRB del Instituto Nacional de Perinatología (212250-3210-21002-06-15). La participación fue voluntaria y todas las mujeres inscritas firmaron el consentimiento informado.
1. Recolección de tejido adiposo visceral
- Obtener biopsias de IVA a través de omentectomía parcial durante la cesárea de mujeres adultas sanas con embarazos únicos a término sin trabajo de parto.
- Tras el cierre uterino y la hemostasia, se procede a identificar el epiplón mayor y extenderlo sobre una compresa húmeda. El AT expuesto es el IVA.
- Localiza el vaso sanguíneo más grande y traza una línea imaginaria d....
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Resultados
Este protocolo describe un método enzimático que utiliza la digestión de colagenasa seguida de centrifugación diferencial para aislar, en un solo proceso, adipocitos maduros viables y células SVF de biopsias de IVA obtenidas de gestantes sanas después de una omentectomía parcial. En este caso, utilizamos los adipocitos para la extracción de ARN y el SVF para el fenotipado de macrófagos.
El protocolo de extracción de ARN permitió obtener ARN con una pureza adecuada, alta integridad y microARN a.......
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Discusión
El IVA juega un papel crucial en la regulación metabólica y la inflamación. El creciente interés en el papel de los adipocitos y las células inmunitarias en la inflamación crónica asociada a la obesidad ha llevado al desarrollo de diferentes técnicas para separar la FVS y las células grasas presentes en la TA. Sin embargo, la mayoría de las técnicas no permiten obtener estos dos conjuntos diferentes de células viables para aplicaciones posteriores a partir de la misma biopsia de VAT en un solo procedimiento, lo que podrí.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Este estudio contó con el apoyo del Instituto Nacional de Perinatología (números de subvención: 3300-11402-01-575-17 y 212250-3210-21002-06-15) y CONACyT, Fondo Sectorial de Investigación en Salud y Seguridad Social (FOSISS) (subvención número 2015-3-2-61661).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubos de PCR de 0,2 mL | Axygen | PCR-02-C | DNasa y no pirogénicos |
| Axygen | MCT-150-C | RNasa, libres de DNasa y no pirogénicas | |
| Corning | CLS4101-50EA | Envueltas individualmente en plástico | |
| 10 µ L punta de pipeta universal | Axygen | T-300-L-R | RNasa, libre de DNasa y no pirogénica |
| 10 µ L punta de pipeta universal | Axygen | T-300-R-S | RNasa, libre de DNasa y no pirogénica |
| 1000 µ L punta de pipeta universal | Axygen | T-1000-B-R Tubo de | sin DNasa y no pirogénico |
| Axygen | MCT-200-C | RNasa, libre de DNasa y no pirogénica | |
| 200 µ L punta de pipeta universal | Axygen | T-200-Y-R | RNasa, libre de DNasa y no pirogénica |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | ||
| G2939BA-2101 Bioanalyzer PC | Agilent | G2953CA | 2100 Expert Software preinstalado en PC |
| ml Tubo de ensayo de poliestireno de fondo redondo | Corning | 352003 | Tapón a presión, estéril |
| Tubos de centrífuga de 50 mL | Corning | CLS430828-100EA | Polipropileno, fondo cónico y estéril |
| Reactivo a base de ácido-guanidinio-fenol | Zymo Research | R2050-1-200 | Reactivo TRI o similar |
| Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511-Agilent | |
| Kit de ARN pequeño | Agilent | 5067-1548-APC | |
| /Cy7 anti-humano Anticuerpo CD14 humano | BioLegend | 325620 | 0,4 mg/106 células, presentes en monocitos/macrófagos, clon HCD14 |
| Baker | - | - | 250 ml, no estéril |
| Albúmina sérica bovina | Sigma-Aldrich | A3912-100G Fracción de | choque térmico, pH 5,2, ≥ 96% |
| Estación de cebado de virutas | Agilent | 5065-9951-Colagenasa | |
| tipo II | Gibco | 17101-015 | Polvo |
| D-(+)-Glucosa | Sigma-Aldrich | G8270-100G | Polvo |
| Direct-zol RNA Miniprep | Zymo Research | R2051 | Suministrado con 50 mL TRI reagen |
| Pinzas de disección | - | - | Acero, mordazas dentadas y redondas extremos |
| Bandeja de disección | - | - | Acero inoxidable |
| Alcohol etílico | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | 200 de prueba, para biología molecular |
| FACS Fluido de vaina de flujo BD | Biosciences | 342003-FACS | |
| Solución de lisis | BD Biosciences | ||
| 349202-FACSAria III Citómetro de flujo/Clasificador de células | BD Biosciences | ||
| 648282-FASCDiva Software | BD Biosciences | 642868 v6.0 preinstalado | |
| Hemacitómetro | Sigma | Z359629-1EA-Contador | |
| manual de células | - | - | - |
| Tijeras de disección Mayo | - | - | |
| Microcentrífuga | - | - | Temperatura ajustable |
| Espectrofotómetro Nanodrop | Thermo Scientific | ND2000LAPTOP-Agitador | |
| orbital | - | - | Temperatura y velocidad ajustables |
| P10 volumen variable micropipeta | Thermo Scientific-Finnpipeta | 4642040 | 1 a 10 μ L |
| P1000 volumen variable micropipeta | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642090 | 100 a 1000 μ L |
| P2 volumen variable micropipeta | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642010 | 0,2 a 2 μ L |
| P200 volumen variable micropipeta | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642080 | 20 a 200 μ L |
| Rack de almacenamiento para tubos de PCR | Axygen | R96PCRFSP-PE | |
| /Cy5 anti-humano HLA-DR Anticuerpo | BioLegend | 307608 | 0,0625 mg/106 células, presente en macrófagos, clon L243 |
| PE/Cy7 anti-humano CD45 Anticuerpo | BioLegend | 304016 | 0,1 mg/106 células, presente en leucocitos, clon H130 |
| Solución salina | tamponada con fosfatoSigma-Aldrich | P3813-10PAK | Polvo, pH 7.4, para preparar soluciones de 1 L |
| Controlador de pipeta | - | -- | |
| Tampón de lisis de glóbulos rojos | Roche | 11 814 389 001 | Para la lisis preferencial de glóbulos rojos de sangre entera humana |
| Centrífuga refrigerada | - | - | Adaptador para tubos cónicos de 50 mL |
| Contenedor de muestras estériles | - | - | - |
| Pipeta de transferencia | Thermo Scientific-Samco | 204-1S | Trypan Estéril |
| Azul | Gibco | 15250-061 | Solución al 0,4% |
| Bastidores de tubos | - | - | Para diferentes tamaños de tubo |
| Vortex Mini Shaker | Cientifica SENNA | BV101 | - |
Referencias
- Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. Adipose-derived stromal vascular fraction cells: update on clinical utility and efficacy. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 25 (2), 145-152 (2015).
- Ibrahim, M. M.
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Reimpresiones y permisos
