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Artículo de método

Aislamiento de adipocitos viables y fracción vascular estromal a partir de tejido adiposo visceral humano adecuado para análisis de ARN y fenotipado de macrófagos

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DOI:

10.3791/61884

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27 de octubre de 2020

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1Research Division, Instituto Nacional de Perinatologia, 2Department of Immunobiochemistry, Instituto Nacional de Perinatologia, 3Department of Obstetrics, Instituto Nacional de Perinatologia, 4Department of Academic Programs and Continuing Education, Instituto Nacional de Perinatologia, 5Department of Infectology and Immunology, Instituto Nacional de Perinatologia, 6Clinical Research Branch, Instituto Nacional de Perinatologia, 7Department of Nutrition and Bioprogramming, Instituto Nacional de Perinatologia, 8Department of Human Genetics and Genomics, Instituto Nacional de Perinatologia, Mexico City, Mexico

En este artículo

Resumen

Este protocolo proporciona un método eficiente de digestión de colagenasas para el aislamiento de adipocitos viables y células de la fracción vascular estromal-SVF de grasa visceral humana en un solo proceso, incluida la metodología para obtener ARN de alta calidad de los adipocitos y la fenotipificación de los macrófagos SVF mediante la tinción de múltiples marcadores unidos a la membrana para su análisis por citometría de flujo.

Resumen

El tejido adiposo visceral (VAT) es un órgano metabólico activo compuesto principalmente por adipocitos maduros y células de la fracción vascular estromal (SVF), que liberan diferentes moléculas bioactivas que controlan los procesos metabólicos, hormonales e inmunológicos; Actualmente, no está claro cómo se regulan estos procesos dentro del tejido adiposo. Por lo tanto, el desarrollo de métodos que evalúen la contribución de cada población celular a la fisiopatología del tejido adiposo es crucial. Este protocolo describe los pasos de aislamiento y proporciona las pautas de resolución de problemas necesarias para el aislamiento eficiente de adipocitos maduros viables y SVF de biopsias de VAT humanas en un solo proceso, utilizando una técnica de digestión enzimática de colagenasa. Además, el protocolo también está optimizado para identificar subconjuntos de macrófagos y realizar el aislamiento de ARN de adipocitos maduros para estudios de expresión génica, lo que permite realizar estudios de disección de la interacción entre estas poblaciones celulares. Brevemente, las biopsias de VAT se lavan, se pican mecánicamente y se digieren para generar una suspensión unicelular. Después de la centrifugación, los adipocitos maduros se aíslan por flotación del gránulo de SVF. El protocolo de extracción de ARN garantiza un alto rendimiento de ARN total (incluidos los miARN) de los adipocitos para los ensayos de expresión posteriores. Al mismo tiempo, las células SVF se utilizan para caracterizar subconjuntos de macrófagos (fenotipo proinflamatorio y antiinflamatorio) mediante análisis de citometría de flujo.

Introducción

El tejido adiposo blanco está compuesto no solo por células grasas o adipocitos, sino también por una fracción de células no grasas conocida como fracción vascular estromal (SVF), que contiene una población celular heterogénea formada por macrófagos, otras células inmunitarias como células T reguladoras (Tregs) y eosinófilos, preadipocitos y fibroblastos, rodeados de tejido vascular y conectivo 1,2. El tejido adiposo (TA) es considerado actualmente un órgano que regula los procesos fisiológicos relacionados con el metabolismo y la inflamación a través de adipoquinas, citocinas y microRNAs producidos y liberados por diferentes células en el tejido, con efectos autocrinos, paracrinos y endocrinos 3,4. En el ser humano, el tejido adiposo blanco comprende el tejido adiposo subcutáneo (SAT) y el tejido adiposo visceral (VAT), con importantes diferencias anatómicas, moleculares, celulares y fisiológicas entre ellos 2,5. El SAT representa hasta el 80% de la TA humana, mientras que el VAT se localiza dentro de la cavidad abdominal, principalmente en el mesenterio y el epiplón, siendo metabólicamente más activo6. Además, el VAT es un órgano endocrino que secreta mediadores con un impacto sustancial en el peso corporal, la sensibilidad a la insulina, el metabolismo de los lípidos y la inflamación. En consecuencia, la acumulación de IVA conduce a la obesidad abdominal y a enfermedades relacionadas con la obesidad como la diabetes tipo 2, el síndrome metabólico, la hipertensión y el riesgo de enfermedades cardiovasculares, lo que representa un mejor predictor de mortalidad asociada a la obesidad 6,7,8,9.

En condiciones homeostáticas, los adipocitos, macrófagos y otras células inmunitarias cooperan para mantener el metabolismo del VAT a través de la secreción de mediadores antiinflamatorios10. Sin embargo, la expansión excesiva del VAT promueve el reclutamiento de células T activadas, células NK y macrófagos. De hecho, en el VAT magro, la proporción de macrófagos es del 5%, mientras que esta proporción se eleva hasta el 50% en la obesidad, con polarización de macrófagos de fenotipo antiinflamatorio a proinflamatorio, generando un ambiente inflamatorio crónico10,11.

Como consecuencia de la pandemia de obesidad, han surgido una cantidad asombrosa de reportes que abordan diferentes temas de investigación del IVA, incluyendo la biología de los adipocitos, la epigenética, la inflamación, las propiedades endocrinas y las áreas emergentes como vesículas extracelulares, entre otros 8,10,12,13. Sin embargo, a pesar de que el ambiente VAT está definido por la diafonía entre los adipocitos y los macrófagos residentes o entrantes, la mayoría de los estudios se han centrado en una sola población celular, y existe escasa información sobre la interacción de estas células en el VAT y sus consecuencias fisiopatológicas11,14. Además, se realizaron valiosos estudios que abordaron la interacción adipocito-macrófago en la TA utilizando líneas celulares que carecían de las condiciones de cebado in vivo 11,14,15. Una estrategia adecuada para diseccionar la interacción o la contribución particular de estas células en el VAT requiere el aislamiento de ambos tipos celulares a partir de la misma biopsia de grasa para realizar ensayos in vitro que reflejen lo más similares posible las propiedades in vivo que regulan el metabolismo del VAT.

A pesar de que los métodos de disociación no enzimática basados en fuerzas mecánicas para romper la TA aseguran una mínima manipulación, estos métodos no pueden ser utilizados si el objetivo es estudiar las células SVF, ya que tienen menor eficiencia en la recuperación celular y baja viabilidad celular en comparación con los métodos enzimáticos, y se necesita un mayor volumen de tejido16,17. La digestión enzimática mediante colagenasa es un método suave que permite una digestión adecuada del colágeno y de las proteínas de la matriz extracelular de los tejidos fibrosos como WAT18 y se utiliza con frecuencia cuando la tripsina es ineficaz o dañina19. El protocolo proporciona pautas fundamentales de resolución de problemas para el aislamiento eficiente de adipocitos maduros viables y células SVF de biopsias de VAT humanas en un solo proceso, utilizando una técnica de digestión enzimática de colagenasa, que brinda información para garantizar altos rendimientos (cantidad, pureza e integridad) de ARN total de adipocitos maduros, incluidos microARN, para aplicaciones de expresión posteriores. Al mismo tiempo, el protocolo se optimiza para identificar subconjuntos de macrófagos de células SVF mediante la tinción de múltiples marcadores unidos a la membrana para su posterior análisis mediante citometría de flujo20.

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Protocolo

Este protocolo fue aprobado por el IRB del Instituto Nacional de Perinatología (212250-3210-21002-06-15). La participación fue voluntaria y todas las mujeres inscritas firmaron el consentimiento informado.

1. Recolección de tejido adiposo visceral

  1. Obtener biopsias de IVA a través de omentectomía parcial durante la cesárea de mujeres adultas sanas con embarazos únicos a término sin trabajo de parto.
  2. Tras el cierre uterino y la hemostasia, se procede a identificar el epiplón mayor y extenderlo sobre una compresa húmeda. El AT expuesto es el IVA.
  3. Localiza el vaso sanguíneo más grande y traza una línea imaginaria de 7 x 5 cm hasta la base del epiplón mayor.
  4. Identifique una zona avascular y use pinzas de Kelly para perforar el lado externo del VAT.
  5. Use pinzas de Ochsner para sujetar el lado proximal y distal en la zona donde se perforó VAT y use tijeras Metzenbaum para cortar el tejido.
  6. Ata el epiplón mayor con el número 1 de seda negra.
  7. Retire las pinzas de Ochsner y evalúe la hemostasia.
  8. Coloque la biopsia de IVA en un recipiente estéril y transpórtela al laboratorio de inmediato.

2. Digestión enzimática del tejido adiposo visceral y aislamiento de adipocitos maduros y células de la fracción vascular estromal

  1. Pesar la biopsia de IVA y enjuagar con 1x PBS pH 7.4.
  2. Corta 4 g de IVA y utiliza unas tijeras para picar el tejido en trozos pequeños en una bandeja de disección.
  3. Transfiera el IVA picado a un tubo de centrífuga estéril de 50 ml, agregue 20 ml de PBS y agite suavemente para eliminar el exceso de glóbulos rojos.
  4. Deseche el PBS y repita el procedimiento dos veces.
  5. Transfiera el IVA a un nuevo tubo de centrífuga estéril de 50 ml y agregue 25 ml de solución de digestión (colagenasa tipo II al 0,25 %, glucosa al 5 mM, albúmina al 1,5 % en PBS).
  6. Incubar a 37 °C durante 60 min en un agitador orbital a 125 rpm.
  7. Filtre el tejido digerido a través de tres capas de gasa en un nuevo tubo de centrífuga estéril de 50 ml.
  8. Centrifugar a 200 x g durante 5 min a 4 °C.
  9. Se obtienen dos fases, una fase superior que corresponde a los adipocitos maduros, mientras que las células SFV permanecen en el pellet. Transfiera suavemente los adipocitos maduros a un nuevo tubo de centrífuga estéril de 50 ml utilizando una pipeta de transferencia.
  10. Añadir 20 ml de PBS frío, agitar suavemente y centrifugar a 200 x g durante 5 min a 4 °C.
  11. Deseche el PBS y repita el procedimiento dos veces.
  12. Utilice una pipeta de transferencia para transferir suavemente los adipocitos maduros a un tubo de microcentrífuga libre de DNasa-RNasa de 1,5 ml.
  13. Centrifugar a 200 x g durante 1 min a 4 °C y eliminar el exceso de PBS con una micropipeta P200. Repita este paso si es necesario.
  14. Transfiera suavemente 300 μL de suspensión de adipocitos maduros a tubos de microcentrífuga libres de DNasa-RNasa de 1,5 mL. Almacenar los adipocitos maduros a -80 °C hasta la extracción del ARN.
    NOTA: Los adipocitos no forman un gránulo.
  15. Una vez separados los adipocitos (paso 2.9), aspirar la mayor parte de la solución de digestión con una pipeta de transferencia, manteniendo el gránulo de SVF en el fondo del tubo.
  16. Transfiera el gránulo con células SVF a un nuevo tubo de centrífuga de 50 ml utilizando una pipeta de transferencia.
  17. Lave el gránulo celular suavemente, resuspendiendo en 20 ml de 1x PBS frío pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
  18. Centrifugar a 800 x g durante 5 min a 4 °C y desechar rápidamente el sobrenadante por decantación.
  19. Realice un segundo lavado repitiendo los pasos 2.17 y 2.18.
  20. Agregue 5 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos equilibrado a temperatura ambiente (RT) al gránulo SVF y suspenda mediante pipeteo repetido. No haga vórtices.
  21. Incubar durante 5 min a RT y centrifugar durante 5 min a 800 x g. Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta de transferencia y deséchelo correctamente.
  22. Para neutralizar el tampón de lisis, agregue 10 ml de PBS frío 1x y mezcle suavemente hasta que el gránulo celular se disuelva.
  23. Centrifugar a 800 x g durante 5 min para obtener un gránulo SVF y desechar el PBS. Un gránulo blanco debe ser visible en la parte inferior del tubo.
  24. Resuspender las células en 5 mL de 1x PBS en RT mediante pipeteo repetido y filtradas a través de tres capas de gasa en un nuevo tubo cónico de 50 mL. Posteriormente, estas células se utilizarán para la caracterización de subpoblaciones de macrófagos mediante citometría de flujo.

3. Extracción de ARN de adipocitos maduros

  1. Prepare un área limpia, utilizando un aerosol de descontaminación de ARNasa para evitar la degradación del ARN. Utilice un juego de pipetas reservado para procedimientos de ARN. Todos los tubos y puntas empleados deben estar libres de RNasa.
  2. Descongelar la suspensión de adipocitos maduros (sección 2.14) a 4 °C si se ha almacenado a -80 °C.
    NOTA: Evite múltiples ciclos de congelación y descongelación.
  3. Lisar las células añadiendo 1.000 μL de reactivo a base de ácido-guanidinio-fenol y mezclar bien con una micropipeta P1000 para homogeneizar.
  4. Incubar durante 5 minutos en RT para estimular la disociación de los complejos de nucleoproteínas.
  5. Centrifugar el lisado celular durante 5 min a 12.000 x g a RT. Se obtendrán tres fases: una fase superior (amarilla) correspondiente a los lípidos de los adipocitos, una fase media (rosa) correspondiente a los ácidos nucleicos y un pellet (restos celulares).
  6. Retire con cuidado la capa lipídica con una micropipeta P200.
  7. Transfiera la fase media a un nuevo tubo de 2 ml, evitando que los restos de lípidos y los gránulos perturben (aproximadamente 700 μL).

4. Purificación del ARN total, incluidos los microARN

NOTA: Se utiliza un método de purificación de ARN total basado en columnas para obtener ARN total de alta calidad.

  1. Añadir un volumen igual de etanol (95%-100%) a la muestra de la sección 3.7, aproximadamente 700 μL, y mezclar a mano invirtiendo el tubo durante 10 s.
  2. Transfiera 700 μL de la mezcla a una columna insertada en un tubo de recolección, centrifugue y deseche el flujo.
  3. Vuelva a cargar la columna y repita el paso 4.2.
  4. Transfiera la columna a un nuevo tubo de recolección.
  5. Añadir 400 μL de tampón de prelavado a la columna y centrifugar. Deseche el flujo continuo y repita este paso.
  6. Añadir 700 μL de tampón de lavado a la columna y centrifugar durante 2 min.
  7. Transfiera la columna con cuidado a un tubo libre de nucleasa.
  8. Añadir 50 μL de agua libre de nucleasas directamente a la matriz de la columna y eluir el ARN por centrifugación. Preparar alícuotas de 10 μL utilizando tubos de microfugo de 200 μL.
  9. Coloque inmediatamente las alícuotas en hielo y use una de ellas para determinar la concentración y pureza del ARN.
  10. Prepare una alícuota de 5 μL de ARN total ajustada a 100 ng/μL para medir la integridad del ARN y la concentración de microARN.
  11. Conservar a -80 °C hasta su uso.

5. Determinación de la concentración, pureza e integridad del ARN de los adipocitos maduros; Ensayo de cuantificación de microARN

NOTA: Las determinaciones de concentración y pureza de ARN se realizan utilizando un espectrofotómetro UV-Vis; La integridad del ARN y la cuantificación de miARN se realizan utilizando un analizador de control de calidad de ARN.

  1. Lave el lector de muestras con agua de grado molecular y limpie.
  2. Cargue 2 μL de agua de elución (en blanco), cambie la configuración a ARN y haga clic en el botón En blanco .
  3. Cargue 2 μL de muestra y haga clic en el botón Medir .
  4. Una vez completada la lectura, registre las proporciones A260/A280 y A260/A230, así como la cantidad de ARN (ng/μL) (Figura 1A).
    NOTA: El ARN con una relación OD260/OD280 y OD260/OD230 de alrededor de 2,0 se considera puro.
  5. Mida el número de integridad del ARN (RIN) con un kit de integridad del ARN siguiendo las instrucciones del fabricante (Figura 1B).
    NOTA: Un RIN = 10 corresponde a ARN intacto, mientras que un RIN ≤ 3.0 indica un ARN fuertemente degradado. Para microarrays de expresión o RT-qPCR, utilice ARN con RIN ≥ 6.0.
  6. Utilice un pequeño kit de ARN para determinar la concentración y el porcentaje de microARN, siguiendo las instrucciones del fabricante (Figura 1C).
    NOTA: Para evitar la sobreestimación de ARN pequeños y micro, utilice muestras de ARN con RIN ≥ 6.0.

6. Recuento y viabilidad de las células de la fracción vascular estromal

  1. Diluir 10 μL de suspensión celular SVF (sección 2.24) en 90 μL de solución de azul de tripano al 0,4% (dilución final 1:10) y aplicar 10 μL a un hemocitómetro estándar.
  2. Cuente las células viables cuidadosamente, excluyendo las células muertas, en cuatro cuadrados en la esquina de la cámara de conteo.
  3. Determinar la concentración celular presente en la suspensión original: Concentración celular = Recuento total de células/4 x factor de dilución (10) x 10.000 = Células/mL
  4. Para calcular el rendimiento celular (células por gramo de tejido) obtenido, multiplique la concentración celular por el volumen total de la muestra original (en ml) y divida por el peso del tejido digerido (en gramos).
  5. Evalúe la viabilidad celular como el porcentaje de células vivas de la siguiente manera: % de viabilidad = (número de células viables / número total de células) x 100.

7. Caracterización de subconjuntos de macrófagos a partir de la fracción vascular estromal

  1. Transferir un total de 1 x 106 células SVF/ml a un tubo de ensayo de polipropileno de fondo redondo de 5 ml para citometría de flujo y células de pellets por centrifugación a 800 x g durante 5 min a 4 °C.
  2. Agite cuidadosamente el gránulo y vuelva a suspender las células en 100 μL de 1x PBS en RT.
  3. Añadir la concentración óptima pretitulada de cada anticuerpo monoclonal conjugado con fluorocromo específico para un antígeno de superficie celular; mezclar suavemente e incubar durante 15 minutos en la oscuridad a RT.
  4. Añadir un exceso de frío 1x PBS (≈ 1 mL) y centrifugar la SVF a 400 x g durante 5 min a 4 °C.
  5. Deseche los sobrenadantes rápidamente por decantación. Tenga cuidado de no alterar el pellet.
  6. Añadir 500 μL de solución de lisado 1x e incubar 15 min a RT, protegiendo los tubos de la luz directa.
  7. Retirar la solución después de la centrifugación a 400 x g durante 5 min a 4 °C y almacenar a 2-8 °C en la oscuridad hasta la adquisición de datos.
  8. Vórtice las células a fondo a baja velocidad para reducir la agregación antes de adquirirlas.
  9. Vuelva a suspender el gránulo de SVF en 5 ml de líquido de vaina en RT y, posteriormente, filtre a través de tres capas de gasa en un nuevo tubo de ensayo de polipropileno de fondo redondo de 5 ml antes del análisis por citometría de flujo, para reducir la obstrucción de las líneas clasificadoras de células.
  10. Agite cada tubo brevemente antes del análisis.
  11. Adquirir datos de las muestras de interés. Para el análisis de flujo, cuente un mínimo de 10.000 eventos.
    NOTA: Si utiliza un citómetro de flujo de clasificación celular, separe los macrófagos para su aplicación en estudios posteriores.

8. Estrategia de compuerta

  1. Trace la altura o el ancho contra el área de dispersión directa (FSC) para determinar la población de singletes (Figura 2A).
  2. Seleccione celdas que trazan el área de dispersión lateral (SSC) contra FSC, descartando los desechos celulares (Figura 2B).
  3. A partir de las células seleccionadas, identifique las poblaciones que expresan CD45 como células hematopoyéticas (Figura 2C) y las células CD45/CD14 doble positivas como macrófagos (Figura 2D).
  4. A partir de macrófagos CD45+/CD14+, detectar células HLA-DR negativas y positivas (Figura 2E).
    NOTA: Incluya los controles de compensación para el panel de anticuerpos y ajuste la superposición espectral en un citómetro de flujo multicolor adecuado para el panel. Realizamos análisis de citometría de flujo utilizando un citómetro equipado con tres láseres (láser violeta de 405 nm, láser azul de 488 nm y láser rojo de 640 nm) y detectores para los fluorocromos indicados.

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Resultados

Este protocolo describe un método enzimático que utiliza la digestión de colagenasa seguida de centrifugación diferencial para aislar, en un solo proceso, adipocitos maduros viables y células SVF de biopsias de IVA obtenidas de gestantes sanas después de una omentectomía parcial. En este caso, utilizamos los adipocitos para la extracción de ARN y el SVF para el fenotipado de macrófagos.

El protocolo de extracción de ARN permitió obtener ARN con una pureza adecuada, alta integridad y microARN a...

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Discusión

El IVA juega un papel crucial en la regulación metabólica y la inflamación. El creciente interés en el papel de los adipocitos y las células inmunitarias en la inflamación crónica asociada a la obesidad ha llevado al desarrollo de diferentes técnicas para separar la FVS y las células grasas presentes en la TA. Sin embargo, la mayoría de las técnicas no permiten obtener estos dos conjuntos diferentes de células viables para aplicaciones posteriores a partir de la misma biopsia de VAT en un solo procedimiento, lo que podrí...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Este estudio contó con el apoyo del Instituto Nacional de Perinatología (números de subvención: 3300-11402-01-575-17 y 212250-3210-21002-06-15) y CONACyT, Fondo Sectorial de Investigación en Salud y Seguridad Social (FOSISS) (subvención número 2015-3-2-61661).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubos de PCR de 0,2 mLAxygenPCR-02-CDNasa y no pirogénicos
AxygenMCT-150-CRNasa, libres de DNasa y no pirogénicas
CorningCLS4101-50EAEnvueltas individualmente en plástico
10 µ L punta de pipeta universalAxygenT-300-L-RRNasa, libre de DNasa y no pirogénica
10 µ L punta de pipeta universalAxygenT-300-R-SRNasa, libre de DNasa y no pirogénica
1000 µ L punta de pipeta universalAxygenT-1000-B-R Tubo desin DNasa y no pirogénico
AxygenMCT-200-CRNasa, libre de DNasa y no pirogénica
200 µ L punta de pipeta universalAxygenT-200-Y-RRNasa, libre de DNasa y no pirogénica
2100 Bioanalyzer InstrumentAgilent
G2939BA-2101 Bioanalyzer PCAgilentG2953CA2100 Expert Software preinstalado en PC
ml Tubo de ensayo de poliestireno de fondo redondoCorning352003 Tapón a presión, estéril
Tubos de centrífuga de 50 mLCorningCLS430828-100EAPolipropileno, fondo cónico y estéril
Reactivo a base de ácido-guanidinio-fenolZymo ResearchR2050-1-200Reactivo TRI o similar
Agilent RNA 6000 Nano KitAgilent5067-1511-Agilent
Kit de ARN pequeñoAgilent5067-1548-APC
/Cy7 anti-humano Anticuerpo CD14 humanoBioLegend3256200,4 mg/106 células, presentes en monocitos/macrófagos, clon HCD14
Baker--250 ml, no estéril
Albúmina sérica bovinaSigma-AldrichA3912-100G Fracción dechoque térmico, pH 5,2, ≥ 96%
Estación de cebado de virutasAgilent5065-9951-Colagenasa
tipo IIGibco17101-015Polvo
D-(+)-GlucosaSigma-AldrichG8270-100GPolvo
Direct-zol RNA MiniprepZymo ResearchR2051Suministrado con 50 mL TRI reagen
Pinzas de disección--Acero, mordazas dentadas y redondas extremos
Bandeja de disección--Acero inoxidable
Alcohol etílicoSigma-AldrichE7023-500ML200  de prueba, para biología molecular
FACS Fluido de vaina de flujo BDBiosciences342003-FACS
Solución de lisisBD Biosciences
349202-FACSAria III Citómetro de flujo/Clasificador de célulasBD Biosciences
648282-FASCDiva SoftwareBD Biosciences642868 v6.0 preinstalado
HemacitómetroSigmaZ359629-1EA-Contador
manual de células---
Tijeras de disección Mayo--
Microcentrífuga--Temperatura ajustable
Espectrofotómetro NanodropThermo ScientificND2000LAPTOP-Agitador
orbital--Temperatura y velocidad ajustables
P10  volumen variable  micropipeta Thermo Scientific-Finnpipeta46420401 a 10 μ L
P1000  volumen variable  micropipeta Thermo Scientific-Finnpipette4642090100 a 1000 μ L
P2  volumen variable  micropipeta Thermo Scientific-Finnpipette46420100,2 a 2 μ L
P200  volumen variable  micropipeta Thermo Scientific-Finnpipette464208020 a 200 μ L
Rack de almacenamiento para tubos de PCRAxygenR96PCRFSP-PE
/Cy5 anti-humano HLA-DR AnticuerpoBioLegend3076080,0625 mg/106 células, presente en macrófagos, clon L243
PE/Cy7 anti-humano CD45 AnticuerpoBioLegend3040160,1 mg/106 células, presente en leucocitos, clon H130
Solución salinatamponada con fosfatoSigma-AldrichP3813-10PAKPolvo, pH 7.4, para preparar soluciones de 1 L
Controlador de pipeta---
Tampón de lisis de glóbulos rojosRoche11 814 389 001Para la lisis preferencial de glóbulos rojos de sangre entera humana
Centrífuga refrigerada--Adaptador para tubos cónicos de 50 mL
Contenedor de muestras estériles---
Pipeta de transferenciaThermo Scientific-Samco204-1STrypan Estéril
AzulGibco15250-061Solución al 0,4%
Bastidores de tubos--Para diferentes tamaños de tubo
Vortex Mini ShakerCientifica SENNABV101-
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL sin Pipetas serológicas de 10 mL de microcentrífuga de 2,0 mL 5 de acero inoxidable,

Referencias

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