Summary
نحن نقدم بروتوكول مفصل لتربية, microinjection من البيض و التزاوج كفاءة من firebrat ثيرامبيا المحلية لتوليد والحفاظ على سلالات متحولة بعد تحرير الجينوم.
Abstract
وdybrat ثيرامبيا المحلية هي الأنواع غير المنيع ، الجناح الذي هو مناسبة لدراسة آليات النمو للحشرات التي أدت إلى إشعاعها التطوري الناجح على الأرض. إن تطبيق الأدوات الوراثية مثل تحرير الجينوم هو المفتاح لفهم التغيرات الوراثية المسؤولة عن التحولات التطورية في نهج إيفو ديفو. في هذه المقالة، ونحن وصف البروتوكول الحالي لتوليد والحفاظ على سلالات متحولة من T. المحلية. نحن نبلغ عن طريقة الحقن الجاف ، كبديل لطريقة الحقن الرطب المبلغ عنها ، التي تسمح لنا بالحصول على معدلات بقاء عالية بشكل ثابت في الأجنة المحقونة. كما أننا نبلغ عن بيئة مثالية لتزاوج البالغين والحصول على الأجيال اللاحقة بكفاءة عالية. وتؤكد طريقتنا على أهمية أخذ البيولوجيا الفريدة لكل نوع في الاعتبار للتطبيق الناجح لطرق تحرير الجينوم على الكائنات الحية النموذجية غير التقليدية. ونتنبأ بأن بروتوكولات تحرير الجينوم هذه ستساعد في تنفيذ T. domestica كنموذج مختبري وعلى زيادة تسريع تطوير وتطبيق أدوات جينية مفيدة في هذا النوع.
Introduction
ينتمي ثيرامبيا المحلية إلى واحدة من أكثر أوامر الحشرات القاعدية ، Zygentoma ، التي تحتفظ بدورة حياة غير اثيرية وغير جناحية. هذه الحالة الفينوغرافية القاعدية وخصائص الأجداد هذه الأنواع هي نموذج جذاب لدراسة الآليات الكامنة في نجاح الحشرات على الأرض، والتي تغطي أكثر من 70٪ من الأنواع الحيوانية الموصوفة1. T. المحلية منذ فترة طويلة تستخدم أساسا لدراسة خصائص الأجداد من علم وظائف الأعضاء الحشرية بسبب ميزات مناسبة كنموذج مختبري، مثل دورة حياة قصيرة نسبيا (2.5-3.0 أشهر من الجنين إلى البالغين الإنجابية؛ الشكل 1أ) وتربية سهلة. في العقود الثلاثة الماضية، تم توسيع استخدامه للتحقيق في خصائص الأجداد من مختلف الصفات مثل خطة الجسم، والتمايز العصبي، والإيقاعات circadian2،3،4.
ويمكن أن يؤدي تطبيق الأدوات الجينية المتقدمة في مجال ت. محلي() إلى زيادة التعجيل بهذه المساهمات في مجال بحثي واسع. تم الإبلاغ عن التدخل الناجح للرنا (RNAi) -بوساطة الجينات في الأجنة والحوريات والبالغين في T. المحلية4,5,6. لا تزال كفاءة RNAi النظامية تعتمد على الأنواع بشكل كبير - على سبيل المثال ، فهي عالية بشكل عام في coleoptera في حين أنها منخفضة في أمر lepidoptera7. ولم يتم بعد تقييم كفاءة ومدة الضربة القاضية لـ RNAi في T. domestica. بالإضافة إلى RNAi، وقد أبلغنا سابقا ناجحة CRISPR / Cas9-بوساطة الجينات بالضربة القاضية في T. المحلية8. وقد تم تطبيق نظام CRISPR / Cas على نطاق واسع لتحرير الجينوم في الحشرات خاصة بالنسبة للجين المستهدف بالضربة القاضية. ويمكن توسيع استخدامه لتطبيقات أخرى مثل مقايسة مراسل الجينات ، وتتبع نسب الخلية ، والتلاعب في النشاط النسخي عن طريق طرق في المنشآت الخارجية بعد إنشاء بروتوكول لتسليم مكونات نظام CRISPR / Cas في النوى9. جنبا إلى جنب مع الجمعية الجينومالمنشورة 10، والاستخدام على نطاق واسع وزيادة تطوير تحرير الجينوم CRISPR / Cas القائم على CAS في T. المحلية من شأنه أن يسهل الدراسات التي تركز على الآليات التطورية وراء النجاح التكيفي المعلقة للحشرات. هنا، نحن وصف بروتوكول مفصل للجنين microinjection والتزاوج الكبار T. المحلية لتوليد سلالة متحولة باستخدام CRISPR / Cas9. وبالنظر إلى هذه الطريقة الجديدة، فإننا نناقش أهمية النظر في البيولوجيا الفريدة للأنواع النموذجية غير التقليدية للتطبيقات الناجحة لهذه التقنيات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1- صيانة مستعمرات المختبرات
- لصيانة الأنواع البرية وفئات السكان المتحولة ، استخدم حاوية بلاستيكية كبيرة (460 مم × 360 مم × 170 مم) مع طعام أسماك اصطناعي منتظم ، والمياه في أكواب بلاستيكية مع ثقب تهوية على الجزء العلوي ، وورق مطوي لإخفاء الحشرات ، والقطن ذو الطبقات لوضع البيض (الشكل 2A). الحفاظ على جميع الثقافات المحلية T. داخل حاضنات 37 درجة مئوية وتعيين الرطوبة النسبية (RH) داخل كل حاوية إلى 60٪ -80٪.
ملاحظة: لأن T. المحلية تمتص بخار الماء من الغلاف الجوي11،لا حاجة إمدادات المياه المباشرة. يتم الحفاظ على RH المناسبة بسبب وجود بخار الماء من أكواب بلاستيكية تحتوي على ثقب التهوية على الجزء العلوي أو من أكواب بدون غطاء داخل كل حاوية. ليست هناك حاجة لترطيب داخل حاضنة بأكملها التي تحتوي على الثقافات. ويرد في الشكل 1المدة التقريبية لكل مرحلة من مراحل النمو في ظل الحالة الموصوفة في هذا البروتوكول. ويمكن تعديل سرعة النمو عن طريق تغيير درجة الحرارة و / أو RH12. - إضافة الطعام بشكل دوري. إضافة الماء قبل أن يجف.
- نقل السكان إلى حاوية نظيفة جديدة على الأقل كل 3 أشهر نظرا لأن الكبار التوقف عن وضع البيض في بيئة قذرة و / أو سكان كثيفة (انظر المناقشة).
2. جمع البيض وصغر الاضاءة
- تصميم دليل RNA (GRNA)
- تصميم تسلسل الجيش الملكي النيبالي لكل هدف المطلوبة و BLAST تسلسل GRNA ضد تجميع الجينوم للتحقق من مواقع التعرف على خارج الهدف ممكن.
- توليف وتنقية gRNAs وفقا لتعليمات الشركة المصنعة8.
ملاحظة: على سبيل المثال، في حالة استهداف ATP-ملزمة كاسيت الناقل الجين الأبيض، تم تصميم تسلسل الهدف 20 BP واثنين من تخليق الحمض النووي oligonucleotides 5'-TAATACGACTTATAGTAAGTGGTGTGGAC-3' و 5'-TTCCTCTAAAAAACGCCACCAACACTTA-3' تم طلب. تم إعداد قالب الحمض النووي عن طريق تجميع هذين القلة تليها تضخيم البوليستر PCR ثم يتم في المختبر في نسخ من القالب مع بوليميراز T7 RNA.
- إعداد مستعمرات جمع البيض
- نقل حوالي 20 من الذكور و 20 أنثى من البالغين إلى حاوية متوسطة الحجم (200 مم × 150 مم × 90 ملم) مع الطعام وإمدادات المياه وورق مطوي وقطعة صغيرة من القطن الطبقات لوضع البيض(الشكل 2B).
- اقامة عدة مستعمرات للحصول على عدد كبير من الاجنة المرحلية في فترة زمنية قصيرة لاستخدامها في تحرير الجينوم.
ملاحظة: من المتوقع أن يتم جمع حوالي 20-40 بيضة من مستعمرة بعد 8 ساعات عند 37 درجة مئوية. وعادة ما يستغرق الأمر بضعة أيام للبالغين المنقولين لبدء وضع البيض ، وربما بسبب التكيف مع بيئة جديدة.
- في يوم الحقن، استبدل القطن داخل الحاويات بأخرى جديدة.
- ضع شريطًا مزدوج الوجه مقاس 76 مم × 5 مم على شريحة زجاجية عادية مقاس 76 مم × 26 مم.
- بعد ثماني ساعات، وجمع البيض من القطن الطبقات عن طريق فصل الطبقات باستخدام ملقط.
- محاذاة البيض على الشريط على الوجهين باستخدام فرشاة الطلاء الرطب والحفاظ على مسافة 2 مم بين البيض. يجب أن تكون جميع البويضات موجهة بحيث يواجه المحور الطولي للبيضة جانب الحقن (الشكل 3A). اضغط بلطف أسفل البيض مع فرشاة الطلاء لعقد شركة أثناء الحقن.
ملاحظة: في هذا البروتوكول، تنمو الفطريات بسرعة في البيض المحقون التالف في حالة رطبة ودافئة. من المهم الحفاظ على المسافة بين البيض لمنع التلوث عبر والتوسع في الفطريات. - اخلطي بروتينات GRNA و Cas9 إلى تركيز نهائي يبلغ 100 نانوغرام/ميكرولتر و500 نانوغرام/ميكرولتر على التوالي. استخدام الماء المقطر لتخفيف. احتضان المزيج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتعزيز تكوين مجمع ribonucleoprotein ومن ثم الحفاظ على مزيج على الجليد.
ملاحظة: يمكن إضافة أحمر محايد بتركيز نهائي بنسبة 1٪ إلى محلول الحقن لمراقبة الكمية المحقونة. - قم بتحميل 2 ميكرولتر من محلول GRNA/Cas9 في الشعرية الدموية في حقن الزجاج باستخدام أداة تحميل صغيرة. تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء في المحلل قبل الحقن. إذا لزم الأمر، اضغط على الإبرة لإزالة الفقاعات.
ملاحظة: في هذه التجربة، يتم استخدام إبرة جاهزة للحصول على طرف إبرة دقيقة(الشكل 3B). ويمكن استخدام إبرة محلية الصنع ذات شكل مماثل بدلاً من ذلك. - إصلاح الشعرية حقن الزجاج، محملة سابقا مع الحل GRNA / Cas9، إلى حامل مجهزة المتلاعب وربط حامل إلى الحقن المجهري الإلكترونية.
- تحسين شكل طرف إبرة عن طريق كسر قليلا مع ملقط لمنع انسداد والحصول على أفضل المتانة في جميع أنحاء سلسلة من الحقن (مثال على إبرة مناسبة يظهر في الشكل 3C).
ملاحظة: من المستحسن تغيير إبرة عندما يكون مسدودا. من الممكن الاستمرار في الحقن بنفس الإبرة إذا تم كسرها مرة أخرى مع ملقط ، ولكن تلميحًا أوسع يؤدي إلى مزيد من تلف البيض ويخفض معدل بقائهم على قيد الحياة. كما T. المحلية البيض لينة وهشة، والحفاظ على طرف إبرة غرامة هو المفتاح للحصول على معدل البقاء على قيد الحياة عالية بعد الحقن. - أدخل الإبرة عند نقطة الوسط للمحور الطولي للبويضة ويحقن كمية طفيفة من المحلل (انظر الشكل 3D-H للرجوع إليه في كمية الحقن). ضبط تكوين الحقن المجهري الإلكترونية أثناء الحقن، اعتمادا على شكل طرف إبرة.
ملاحظة: من المستحسن أن تمارس ضغط مستمر أثناء الحقن، وإلا فإن محتويات البيضة اللاصقة يمكن أن تتدفق بسهولة إلى الإبرة الزجاجية وقد تسدها. قد يكون الحل إما لحقن مع نبض ضغط قصير أو مع ضغط مستمر، اعتمادا على كمية السائل حقن. نضع في اعتبارنا أنه عندما تلميح إبرة لديه فتحة واسعة، يتم حقن الكثير من الحل في البيضة، مما يسبب الفتك (الشكل 3F-H). في هذه الحالة ، والحفاظ على تدفق السائل المستمر عن طريق الضغط المستمر ، ثم أدخل الإبرة في البيضة واسحبها على الفور. إذا كان يسبب الكثير من الفيض أو رشقات نارية البيض، وتغيير الإبرة. - احتفظ بالبويضات المحقونة في حاوية بالحجم المناسب لعدد البيض المحقون (<20 بيضة: طبق صغير؛ >20 بيضة: حاوية متوسطة الحجم) مع 60٪ -80٪ RH و37 درجة مئوية.
3. التزاوج
- تحقق من البيض المحقون بشكل دوري والتخلص من البيض التالف بالملباب لتجنب النمو الفطري(الشكل 3I, J). في حالة الكثير من الفطريات ينمو على البيض، وتنظيف سطح البيض مع ETOH 70٪.
- قبل الفقس (حوالي 10 أيام في 37 درجة مئوية بعد وضع البيض) ، تراجع الشريحة الزجاجية مع البيض المحقون في مسحوق التلك لمعطف سطح الشريط على الوجهين. وهذا سوف تجنب التراص من الحوريات فقست. نقل الشرائح الزجاجية المغلفة بالمسحوق إلى حاوية متوسطة الحجم مع الطعام والماء وورق مطوي لإخفاء الحشرات.
- إزالة الشرائح الزجاجية بعد أن فقست الحوريات. دورياً يتم توفير الطعام حتى يبلغوا سن الرشد.
ملاحظة: يستغرق حوالي 2.0-2.5 أشهر للأفراد للوصول إلى مرحلة البلوغ بعد أن يفقس(الشكل 1A). يتم الحكم على مرحلة الكبار على أساس ovipositor متطورة في الإناث(الشكل 1B). - لمصاحبة الأفراد، ونقل أكبر عدد ممكن من البالغين الإناث من النمط البرية اللازمة من مستعمرة مختبر إلى حاوية متوسطة الحجم واحتضان لهم لمدة 14 يوما على الأقل في 37 درجة مئوية للتأكد من أنهم عذراء.
ملاحظة: ليس من الضروري جمع الإناث العذراء من مستعمرة مختبر لأن الكبار T. المحلية لديها دورة متكررة من الزخرد والتزاوج تسمى "دورة الإنجاب والذوبان"، خلالها الإناث رمي الحيوانات المنوية بعيدا مع كل molt والتزاوج مرة أخرى في دورة الإخصاب المقبل13. - نقل إما ذكر أو أنثى G0 الكبار التي تطورت من البيض حقن و wildtype الكبار (ق) إلى طبق بلاستيكي صغير (Ø 100 مم × 40 مم) مع الغذاء، ورقة مطوية، وقطعة صغيرة من القطن لوضع G1 البيض(الشكل 2C'؛ طبق التزاوج). الحفاظ على أطباق التزاوج في وعاء أكبر مع 60٪ -80٪ RH(الشكل 2C).
ملاحظة: يمكن تضمين العديد من البالغين من الأنواع البرية في طبق لزيادة فرصة التزاوج الناجح ، على الرغم من تحقيق معدلات نجاح عالية مع الاقتران واحد إلى واحد.
4 - جينوتيبينغ
- تصميم أزواج التمهيدي PCR لكل رنا لتضخيم منتج 100-200 BP التي تشمل الموقع المستهدف من قبل GRNA. انفجار كل تسلسل التمهيدي ضد تجميع الجينوم للتحقق من خصوصيته (مثال يظهر لاستهداف الجين الأبيض في الشكل 4A).
- تحقق من التحول الجرثومي للبالغين G0.
- بعد خمسة أيام من وضع البيض ، وجمع البيض G1 الفردية من كل زوج G0 الكبار في أنابيب 0.2 مل (بيضة واحدة لكل أنبوب ؛ تخزين العينات التي تم جمعها في -20 درجة مئوية لتخزين على المدى الطويل). فصل طبقات القطن لجمع البيض.
ملاحظة: يوصى بالنمط الجيني على الأقل 12 حوريات G1 من كل زوج تزاوج لتقييم نجاح انتقال الخط الجرثومي (انظر نتائج التمثيل). - أضف 15 ميكرولتر من محلول 0.25 ملغ/مل بروتينيات K (مذاب في مخزن Tris-EDTA) لكل أنبوب، وعينات متجانسة لفترة وجيزة مع المسواك، واحتضان في 55 درجة مئوية لمدة 3 إلى 16 ساعة.
- تعطيل البروتينات K عن طريق وضع العينات في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
- إضافة 90 ميكرولتر من الماء المقطر إلى كل أنبوب ويخلط جيدا. استخدم 2 ميكرولتر من الماكر في مزيج تفاعل PCR 10 ميكرولتر يحتوي على ال التمهيديات المصممة في الخطوة 4.1.
ملاحظة: يوصى باستخدام بوليميراز الحمض النووي الأمثل للقوالب الخام للوصول إلى ما يكفي من تضخيم البوليميراز البوليميراز. - لتحليل منتجات PCR ، قم بإجراء مقايسة تنقل heteroduplex (HMA) بنظام كهربائي صغير(الشكل 3B؛ انظر Ohde et al., 2018)8.
ملاحظة: يمكن تقييم الطفرات مع طريقتين بديلتين: (1) HMA مع البوليمرات هلام القياسية, مثل 8٪ بولياكريلاميد14; (2) هضم منتجات PCR مع T7 endonuclease تليها agarose هلام الكهربائي15. - احتفظ فقط بحوريات G1 الناتجة عن البالغين G0 التي تحتوي على طفرات في الخط الجرثومي والتخلص من التشوهات الأخرى.
- بعد خمسة أيام من وضع البيض ، وجمع البيض G1 الفردية من كل زوج G0 الكبار في أنابيب 0.2 مل (بيضة واحدة لكل أنبوب ؛ تخزين العينات التي تم جمعها في -20 درجة مئوية لتخزين على المدى الطويل). فصل طبقات القطن لجمع البيض.
- genotyping الفردية من الحوريات G1 / البالغين
- عزل الحوريات G1 في لوحات 24-جيدا مع التعرق أو فرشاة الطلاء. ضع 24 بئرا في وعاء أكبر (على سبيل المثال، حاوية متوسطة الحجم المستخدمة في هذا البروتوكول) مع إمدادات المياه كما هو موضح أعلاه للحفاظ على RH من 60٪ -80٪(الشكل 1D). الحفاظ على إمدادات الأغذية الأسماك العادية الاصطناعية(الشكل 1D').
ملاحظة: على الرغم من أن هذه الخطوة يمكن أن يؤديها في أي نقطة من مراحل حورية والبالغ, فمن المستحسن لتنفيذ ذلك بعد بلوغ سن البلوغ وقبل الاقتران (> 2.5 أشهر بعد الحقن; الشكل 1B) لأنه من الأسهل للحفاظ على firebrats في وعاء كبير. مطلوب تربية الفردية لتتبع نوع وراثي لكل حورية G1 على الخطوات التالية. G1 الحوريات من نفس G0 الكبار يمكن أن يكون لها طفرات مختلفة. - قرصة وسحب cerci وceلدال من حورية / الكبار باستخدام ملقط وجمعها في أنبوب 0.2 مل تحتوي على 50 ميكرولتر EtOH (تخزين العينات التي تم جمعها في -20 درجة مئوية لتخزين على المدى الطويل).
ملاحظة: يتم جمع عينات الأنسجة في EtOH لأنه يمنع فقدان هذه العينات الصغيرة بسبب الكهرباء الساكنة. إذا كان المرء يحتاج إلى وقف حركة الحشرات ، يُعين الحورية / البالغين على الجليد عند أخذ عينات الأنسجة. لأن T. المحلية لا يمكن البقاء على قيد الحياة بعد التبريد على المدى الطويل على الجليد، لا تخدير لهم لأكثر من دقيقة ونقلها على الفور مرة أخرى إلى درجة حرارة الغرفة. الاجتثاث من cerci وخيوط السد يسبب أي زيادة في الوفيات. - ضع أنابيب العينة مع الأغطية مفتوحة على كتلة حرارية لمدة 15 دقيقة عند 70 درجة مئوية لتتبخر EtOH.
- كرر الخطوات 4.2.2-4.2.5 لgenotyping.
- إرسال منتجات PCR التي يتم فيها ملاحظة نمط نطاق متحولة إلى خدمة تسلسل سانجر القياسية.
- احتفظ بالحوريات G1/البالغين مع الطفرات المطلوبة وتجاهل الآخرين (انظر الشكل 4C للحصول على نتيجة التسلسل التمثيلي).
- عزل الحوريات G1 في لوحات 24-جيدا مع التعرق أو فرشاة الطلاء. ضع 24 بئرا في وعاء أكبر (على سبيل المثال، حاوية متوسطة الحجم المستخدمة في هذا البروتوكول) مع إمدادات المياه كما هو موضح أعلاه للحفاظ على RH من 60٪ -80٪(الشكل 1D). الحفاظ على إمدادات الأغذية الأسماك العادية الاصطناعية(الشكل 1D').
- عبر البالغين التي تحتوي على الطفرات المطلوبة في طبق التزاوج والحصول على الأجيال القادمة لإنشاء سلالة متحولة homozygous.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في أيدينا، يمكن حقن حوالي 100 بيضة بشكل جيد مع الشعيرية حقن واحد عندما يكون لديه تلميح كافية (الشكل 3C). حقن مجمع gRNA/Cas9 ribonucleoprotein في الأجنة داخل أول 8 ساعة بعد وضع البيض النتائج في indels في موقع يستهدف GRNA. وهذا يسبب طفرات البجلية في بعض خلايا الجيل المحقون (G0) وبالتالي يتم الحصول على الأنماط الظاهرية الفسيفساء متحولة عادة في G0. على سبيل المثال، عندما تم استخدام هذا البروتوكول لحقن GRNA التي تم تصميمها لاستهداف الجين الأبيض، 32.6٪ من الحوريات G0 عرض خسارة جزئية لتصبغ في عيونها المركبة والمناطق الظهرية (الشكل 5)8.
باستخدام طريقة الحقن الجاف الموصوفة حاليا، عندما يتم حقن 80-120 البويضات معدل البقاء على قيد الحياة من الأجنة المحقونة يصل إلى 40٪ -60٪. وهذا على النقيض من طريقة الحقن الرطب السابقة، التي يتم فيها حقن البيض والحفاظ عليه على صفيحة أغاروز، مما يؤدي أحياناً إلى معدل بقاء أقل من 10٪.
وقد تم تقييم التحول في الخط الجرثومي للبالغين G0 والأفراد المتحولين G1 بواسطة PCR الجينومي متبوعاً بHMA. في HMA، وtype البرية و متحولة أليل في كل تركيبة ممكنة، والذي ينتج عادة في أربعة عصابات متميزة على الكهربائي هلام (اثنين من التجانس واثنين من heteroduplexes)14. في عينات G1، أنماط الفرقة التفاضلية بين النمط البري والعينات المتحولة هي واضحة يمكن تمييزها(الشكل 4B). تم العثور على التحول germline في 39.1٪ من البالغين G0 عندما استهدفنا الجين الأبيض 8. في تجربتنا، فإن نسبة الأفراد المتحولين في حوريات G1 من زوج G0 واحد تتراوح بين 25٪ إلى 100٪.
لتقييم تأثير بيئة التزاوج لدينا على نجاح التزاوج ، عبرنا البالغين من النوع البري في طبق التزاوج وحصلنا على معدل نجاح 95.8٪ (23/24 زوجًا).
الشكل 1: دورة حياة T. المحلية. (أ) المدة التقريبية لكل مرحلة تنموية في T. المحلية. (ب) عرض دورسال لأنثى بالغة. يشير Arrowhead إلى ovipositor متطورة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: البيئات الاصطناعية المستخدمة في هذا البروتوكول. ( أ) حاوية كبيرة لمستعمرات المختبرات، (ب) حاوية متوسطة الحجم لجمع البيض، (ج) أطباق التزاوج مع إمدادات المياه في حاوية كبيرة،(C') طبق تزاوج، (D) لوحة 24-well مع إمدادات المياه في الحاوية متوسطة الحجم. يتم تكبير المنطقة محاصر في (D ') لإظهار شخص محلي T. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الحقن الجاف لبيض T. المحلي. (أ) بيض محاذاة على شريحة زجاجية. يشير السهم الأسود إلى النقطة التي يتم فيها إدخال إبرة. (B) شكل طرف إبرة زجاجية تستخدم للحقن. (C) إبرة الزجاج نفسه قبل (أعلى) وبعد (أسفل) كسر طرف. كانت الإبر مليئة بـ 1٪ أحمر محايد. يشير رأس السهم إلى طرف الإبرة. شريط مقياس هو 1 مم.(D) البيض غير المُنَجَه. (ه) مثال جيد للحقن. السهم يشير إلى نقطة الحقن. (F-H) الحل هو تفيض من موقع حقن (F) أو من الجانب المقابل (G) من البيضة المحقونة ؛ الكثير من حجم الحقن تسبب في انفجار (H). يشير Arrowhead إلى محتوى البيض المفيض. (ط) عادة ما تكون متطورة في وقت متأخر من الجنين. يشير رأس السهم إلى العين المركبة الملونة. (J) تقلصن تضررت البيض بعد 3 أيام من الحقن. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: جينوتيبينغ الأفراد G1. (أ)تم تصميم التمهيديات PCR لتضخيم منطقة الجينوم 120 BP التي تشمل الموقع المستهدف GRNA. (B) يتم الكشف عن عدة نطاقات من الحمضات DNAs المتجانس والهيترودوليكس في عينات تحور بينما تظهر نطاقات مفردة في عينات غير مبدلة. L: سلم الحمض النووي، U: عينات غير تغير، M: عينات تحور. (C) نتيجة تمثيلية من التسلسل المباشر للمنتجات PCR من عينات من نوع البرية و متحولة heterozygous. يتم عرض تسلسل من النمط البري و متحولة ( 
) أليل على القمة. تم استخدام التمهيدي الأمامي الموضح في (A) ككتيب تسلسلي. يشار إلى تسلسل متحولة heterozygous (أسفل) من قبل اثنين متداخلة متواليات من موقع الانقسام المتوقعة (السهم). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: فقدان الفسيفساء من التصبغات في العين المركبة وفي المنطقة الظهرية بعد استهداف الجين الأبيض مع حقن البروتين GRNA/Cas9. (A) وايلد تيبي و (B) أبيض GRNA / Cas9 حقن البروتين الأولى في النجوم الحوريات. يشار إلى الخسارة الجزئية من تصبغات سوداء ووردية في العينين (رأس السهم) وفي منطقة الظهر (السهم). شريط مقياس هو 200 μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بالنسبة للجيل الناجح من المتحولة T. domestica المرغوب فيها مع CRISPR/Cas9 ، من المهم أولاً جمع عدد كاف من الأجنة المرحلية للحقن. للحصول على مجموعة ثابتة من عدد كاف من البيض المحلي T. ، فإن المفتاح هو تحديد حجم مناسب للحاوية ليكون لها كثافة سكانية أقل لأنها ستساعد على الانتهاء بنجاح من سلسلة من سلوكيات التزاوج المعقدة ، والتي تتكرر بعد كل 13 من البالغين. ذكر T. المحلية الكبار ينقل الحيوانات المنوية بشكل غير مباشر إلى أنثى عن طريق الحيوانات المنوية. Sweetman (1938) وذكرت أن الأمر يستغرق الذكور البالغين 20 إلى 35 دقيقة من بدء سلوك التزاوج لوضع من الحيوانات المنوية12. ومن المرجح أن اضطراب التفاعل بين زوج التزاوج من قبل أفراد آخرين يمنع الإخصاب الناجح ، والذي يمكن أن يحدث بشكل أكثر تكرارًا في بيئة كثيفة.
على الرغم من جمع البيض 8 ساعة بعد استبدال القطن داخل حاوية لجمع ما يكفي من البيض في بروتوكول لدينا، يمكن تحقيق كفاءة أعلى من تحرير الجينوم عن طريق جمع البيض وحقنها في غضون فترة زمنية أقصر (على سبيل المثال، 4 ح بعد وضع البيض) عندما تكون المواد المحقونة أكثر فرصة ليتم تسليمها إلى نسبة كبيرة من النوى. يمكن حقن عدد كاف من البيض في غضون فترة زمنية أقصر من خلال (1) زيادة عدد أو حجم الحاويات إذا كان الفضاء يسمح، أو (2) تكرار نفس الإجراء للحصول على عدد كاف من البيض عن طريق الحقن.
ويعتبر موقع الحقن عموما أن تكون مهمة لنجاح التحول في الجراثيم الحشرات. ت. بيضات محلية عادة ما تكون بيضات بيض بيضي الشكل وتحتوي على شريط جرثومي في عمود واحد من محورها الطولي. من المستحسن حقن خليط GRNA/Cas9 عند نقطة الوسط من محور طول البيض لأنه من الصعب تحديد القطب حيث يتم تشكيل شريط جرثومي في الأجنة المبكرة بسبب الشكل المتغير لبيضة T. المحلية. على الرغم من أن الحل GRNA / Cas9 لا يتم حقنه مباشرة إلى موقع تشكيل الفرقة الجرثومية ، فقد حققنا تحول الخط الجرثومي في ما يصل إلى 39.1 ٪ من البالغين G08.
أثناء الحقن المجهري للبيض ، من المهم استخدام طرف إبرة دقيقة للحصول على معدل بقاء مرتفع ، كما هو الحال بالنسبة لنماذج الحيوانات الأخرى. حصلنا على معدل البقاء على قيد الحياة أعلى بعد الحقن مع الإبر الجاهزة مما كانت عليه عند استخدام الإبر الزجاجية محلية الصنع في البيض T. المحلية. ومع ذلك، يمكن تحقيق معدل البقاء على قيد الحياة عالية مماثلة عن طريق تكرار شكل إبرة غرامة مع الإبر محلية الصنع (كما هو مبين في الشكل 3B، C). وفقا لخبرتنا، طريقة الحقن الجاف النتائج في معدل البقاء على قيد الحياة أعلى من طريقة الحقن الرطب المبلغ عنها سابقا8. وجدنا أن حضانة البيض في بيئة جافة هو المفتاح لهذا التحسن، والاستفادة من حقيقة أن البيض T. المحلي والحوريات في وقت مبكر هي مقاومة للجفاف. وهذا وفقا للتقارير السابقة التي تشير إلى أن هذا النوع يفضل بيئة جافة خاصة خلال المراحل التنموية المبكرة وأن البيئة الرطبة يمكن أن تكون ضارة حتى16. بدلا من لوحة بلاستيكية، يمكن استخدام هلام agarose لمحاذاة سريعة من البيض. ومع ذلك، فإن نقل البويضات المحقونة إلى سطح جاف يؤدي إلى معدل نجاة أعلى.
في الختام ، تؤكد طريقتنا على أهمية أخذ البيولوجيا الفريدة من T. المحلية في الاعتبار لنجاح تحرير الجينوم: الحفاظ على بيئة متناثرة لجمع عدد كاف من البويضات والبيئة الجافة للحصول على معدل بقاء أعلى للأجنة المحقونة. يتم استخدام البروتوكولات الأساسية للحقن والتزاوج وصيانة الثقافة المبلغ عنها هنا ليس فقط لتوليد سلالات متحولة مع تحرير الجينوم ، ولكن أيضًا لتطبيقات الأدوات الوراثية الأخرى مثل RNAi وTransgenesis وستساعد على فهم الآليات التي تقوم عليها التطور المبكر للحشرات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم TO و TD من قبل أرقام منحة JSPS KAKENHI 19H02970 و 20H02999 على التوالي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plate | Corning | 83-3738 | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 µg | Integrated DNA Technologies | 1081060 | |
| Anti-static cleaner | Hozan | Z-292 | for removing static electricity from a 24-well plate |
| Barrier Box 20.7L | AS ONE | 4-5606-01 | Large container |
| FemtoJet 4i | Eppendorf | 5252000013 | Electronic microinjector |
| Femtotip II, injection capillary | Eppendorf | 5242957000 | Glass injection capillary |
| High Pack 2440mL | AS ONE | 5-068-25 | Middle-sized container |
| Incubator | Panasonic | MIR-554-PJ | for 37 °C incubation. No need to humidify inside the incubator. |
| KOD Fx Neo | Toyobo | KFX-101 | PCR enzyme for genotyping. Optimized for an amplification from crude templates. |
| Magnetic stand | Narishige | GJ-8 | for holding the micromanipulator |
| Microloader | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | MM-3 | |
| Microscope | Olympus | SZX12 | for microinjection. More than 35X magnification is sufficient for the microinjection |
| MultiNA | Shimadzu | MCE-202 | Microchip electrophoresis system |
| NiceTac | Nichiban | NW-5 | Double-sided tape to place eggs on a glass slide |
| Paint brush (horse hair) | Pentel | ZBS1-0 | |
| Plant culture dish | SPL Life Sciences | 310100 | Mating dish and water supplies for a large and middle-sized containers |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade Lyophilizate from Pichia pastoris | Roche | 3115836001 | |
| SZX 12 microscope | Olympus | SZX 12 | More than 35X magnification is sufficient for the microinjection |
| Talcum powder | Maruishi | 877113 | |
| Tetra Goldfish Gold Growth | Spectrum Brands | Artificial regular fish food |
References
- Species 2000, ITIS Catalogue of Life, 2019 Annual Checklist. Roskov, Y., et al. , Available from: http://www.catalogueoflife.org/annual-checklist/2019 (2019).
- Peterson, M. D., Rogers, B. T., Popadić, A., Kaufman, T. C. The embryonic expression pattern of labial, posterior homeotic complex genes and the teashirt homologue in an apterygote insect. Development Genes and Evolution. 209, 77-90 (1999).
- Farris, S. M. Developmental organization of the mushroom bodies of Thermobia domestica (Zygentoma, Lepismatidae): Insights into mushroom body evolution from a basal insect. Evolution and Development. 7, 150-159 (2005).
- Kamae, Y., Tanaka, F., Tomioka, K. Molecular cloning and functional analysis of the clock genes, Clock and cycle, in the firebrat Thermobia domestica. Journal of Insect Physiology. 56, 1291-1299 (2010).
- Ohde, T., Masumoto, M., Yaginuma, T., Niimi, T. Embryonic RNAi analysis in the firebrat, Thermobia domestica: Distal-less is required to form caudal filament. Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 105, 99-105 (2009).
- Ohde, T., Yaginuma, T., Niimi, T. Nymphal RNAi analysis reveals novel function of scalloped in antenna, cercus and caudal filament formation in the firebrat, Thermobia domestica. Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 108, 101-108 (2012).
- Bellés, X. Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).
- Ohde, T., Takehana, Y., Shiotsuki, T., Niimi, T. CRISPR/Cas9-based heritable targeted mutagenesis in Thermobia domestica: A genetic tool in an apterygote development model of wing evolution. Arthropod Structure and Development. 47, 362-369 (2018).
- Nji, C., et al. CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns. Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).
- Brand, P., et al. The origin of the odorant receptor gene family in insects. eLife. 7, 1-13 (2018).
- Noble-Nesbitt, J. Water balance in the firebrat, Thermobia domestica (Packard). Exchanges of water with the atmosphere. Journal of Experimental Biology. 50, 745-769 (1969).
- Sweetman, H. L. Physical ecology of the firebrat, Thermobia domestica (Packard). Ecological Monographs. 8, 285-311 (1938).
- Nijhout, H. F. Insect Hormones. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (1994).
- Chen, J., et al. Efficient detection, quantification and enrichment of subtle allelic alterations. DNA Research. 19, 423-433 (2012).
- Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases. Nature Genetics. 9, 177-183 (1995).
- Adams, J. A. Biological notes upon the firebrat, Thermobia domestica Packard. Journal of the New York Entomological Society. 41, 557-562 (1933).
