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Detección Temprana De Floraciones De Cianobacterias Y Cianotoxinas Asociadas Usando Estrategia De Detección Rápida

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DOI:

10.3791/61889

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25 de febrero de 2021

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1TheBlueChemistryLab, Department of Pharmacy, University of Naples Federico II, 2Department of Public Health, University of Naples Federico II, 3Department of Engineering, University Parthenope

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Una estrategia rápido-multidisciplinaria para la detección temprana de floraciones de las cianobacterias y de cianotoxinas asociadas se describe aquí. Permite la detección de cianobacterias y cianotoxinas relacionadas en muestras de agua y en matrices orgánicas, como muestras de bivalvos, en 24 h.

Resumen

La detección rápida de cianobacterias y cianotoxinas se logra utilizando una estrategia de detección rápida (FDS). Solo se necesitan 24 h para desentrañar la presencia de cianobacterias y cianotoxinas relacionadas en muestras de agua y en una matriz orgánica, como los extractos de bivalvos. Fds combina técnicas de teledetección/proximal con análisis analíticos/bioinformáticos. Los puntos de muestreo se eligen mediante un monitoreo multidisciplinario, multiescala y multiparasital en un espacio físico tridimensional, incluida la teledetección. La observación microscópica y el análisis taxonómico de las muestras se realizan en el entorno de laboratorio, lo que permite la identificación de especies de cianobacterias. A continuación, las muestras se extraen con disolventes orgánicos y se procesan con LC-MS/MS. Los datos obtenidos por MS/MS se analizan utilizando un enfoque bioinformático utilizando la plataforma en línea Global Natural Products Social (GNPS) para crear una red de moléculas. Estas redes se analizan para detectar e identificar toxinas, comparando los datos de los espectros de fragmentación obtenidos por espectrometría de masas con la biblioteca GNPS. Esto permite la detección de toxinas conocidas y análogos desconocidos que aparecen relacionados en la misma red molecular.

Introducción

Las floraciones de cianobacterias han surgido como un problema ambiental en todo el mundo en los últimos 15 años1,2. Las floraciones de cianobacterias se deben al crecimiento excesivo de microorganismos llamados cianobacterias. Son un conspicuo grupo de microorganismos fotosintéticos que se han adaptado para vivir en una gran variedad de ambientes, incluyendo áreas tropicales y aguas extremadamente frías. Son conocidos por producir grandes floraciones que cubren las superficies del agua, especialmente en respuesta a un enriquecimiento masivo de nutrientes, el llamado proceso de eutrofización3.

Por lo tanto, las cianobacterias son excelentes bioindicadoras de la contaminación del agua4,5,6. También pueden producir una amplia gama de compuestos naturales con interesantes propiedades farmacológicas7,8. El problema ambiental relacionado con las cianobacterias son las propias floraciones. Las floraciones pueden bloquear la luz solar a las gramíneas submarinas, consumir oxígeno en el agua provocando la muerte de los peces, producir escoria superficial y olores, e interferir con la alimentación filtrante de los organismos9.

Además, y aún más grave, en una combinación específica de factores como la temperatura, los nutrientes (fósforo y nitrógeno), la luz solar (para la fotosíntesis) y el pH del agua, las floraciones de cianobacterias desencadenan la producción de toxinas; por lo tanto, se vuelven perjudiciales para los seres humanos y los animales. La clase más estudiada de cianotoxinas es la producida por los géneros Microcystis. Se trata de péptidos cíclicos conocidos bajo el nombre general de microcistinas (MCs): siendo la microcistina-LR la más estudiada como capaz de producir hepatotoxicidad severa10. Los animales y los seres humanos pueden estar expuestos a los MCs por la ingestión de agua potable o alimentos contaminados. La Organización Mundial de la Salud (OMS) sugirió un valor total de microcistina-LR de 0,001 mg/L como pauta11. Sin embargo, esto se relaciona solamente con una variante (es decir, MC-LR) fuera de más de 100 microcystins que se han aislado hasta ahora.

Los métodos combinados previamente reportados, como la teledetección con el análisis MALDI-TOF MS12,13,14,15,se han centrado en la detección de concentración de MCs. Los métodos más recientes utilizan sensores de baja resolución que son efectivos para detectar solo amplias extensiones de floración; también son capaces de revelar sólo las toxinas para las que se dispone de normas. Además, la mayoría de estos procedimientos consumen mucho tiempo, y el tiempo es un factor dramático para la detección temprana de la floración para prevenir o minimizar los problemas de seguridad. La estrategia multidisciplinar aquí propuesta proporciona una rápida detección de floración de cianobacterias y cianotoxinas, después de sólo 24 h16.

En el marco del programa denominado MuM3, "Monitoreo Multidisciplinario, Multiescala y Multi-paramétrico en el espacio físico tridimensional (3D)"17,18,una Estrategia de Detección Rápida (FDS) combina las ventajas de varias técnicas: 1) teledetección para detectar la floración; 2) observación microscópica para detectar especies de cianobacterias; y 3) análisis analíticos/bioinformáticos, a saber, redes moleculares basadas en LC-HRMS, para detectar cianotoxinas. Los resultados se obtienen dentro de las 24 h.

El nuevo enfoque es útil para vigilar amplias zonas costeras en poco tiempo, evitando numerosos muestreos y análisis, y reduciendo el tiempo y los costes de detección. Esta estrategia es el resultado del estudio y aplicación de diferentes enfoques para el seguimiento de las cianobacterias y sus toxinas y combina las ventajas de cada una de ellas. En concreto, el análisis de los resultados, procedentes del uso de diferentes plataformas (satélite, aeronaves, drones) y sensores (MODIS, infrarrojo térmico) para el análisis de teledetección, como de diversos enfoques metodológicos para la identificación de especies de cianobacterias (microscopio, espectroscopia UV-Vis, análisis 16S) y toxinas (análisis LC-MS, redes moleculares), permitió seleccionar el método más adecuado tanto para los fines específicos como generales. La nueva metodología fue experimentada y validada en campañas de monitoreo posteriores en las costas de Campania (Italia), en el marco del programa de monitoreo de la agencia de protección ambiental de Campania.

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Figura 1:Estrategia FDS. An overview of Fast Detection Strategy for cyanobacteria and cyanotoxins. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Protocolo

1. Teledetección y proximal: adquisición y análisis de datos

NOTA: En este caso, los datos de detección remota/proximal se utilizan para un primer estudio de macrozonas y para seleccionar puntos específicos de las zonas costeras que se van a muestrear. En el esquema MuM3 framework17, el flujo lógico se basa en un modelo de supervisión jerárquico que incluye varios niveles denominados capas de información. La información de cada nivel se basa en los datos adquiridos utilizando uno o más sensores transportados a bordo de plataformas situadas a diferentes altitudes. Cada nivel define una escala espacial en función de la altitud de la medida19. Existe la posibilidad de múltiples sensores en cada nivel. Algunos ejemplos son: imágenes de infrarrojo cercano visible (VNIR) e infrarrojo térmico (TIR)20 en satélites, aeronaves, helicópteros, UAV21 y en la superficie; análisis físicos, químicos y biológicos, etc.22 en la superficie y en respuesta rápida utilizando el laboratorio móvil. Los datos adquiridos por cada sensor se procesan y combinan para calcular índices multiespectrales (por ejemplo, índice de vegetación de diferencia normalizada (NDVI), índice de agua de diferencia normalizada (NDWI), índice de clorofila, etc.), por lo que los datos en bruto se convierten en parámetros y formatos más útiles (por ejemplo, mapa temático).

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Figura 2:Análisis de teledetección/proximal para muestreo (pasos 1-2). Enfoque multinivel y multisensor para la detección de floración de cianobacterias. La adquisición de datos se realiza por satélite (A), aeronave (B) y / o drone (C). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

  1. Recuperación de datos de detección remota y proximal
    1. Recupere datos de los diversos conjuntos de datos de teledetección públicos y privados, producidos especialmente para la recuperación basada en contenido y la clasificación de escenas. Las fuentes típicas de conjuntos de datos utilizadas en este paso incluyen: productos Landsat proporcionados por el Servicio Geológico23de los EE. UU., Productos Sentinel-2,3 proporcionados por la NASA24y Copernicus Open Access Hub25,MODIS-Aqua26.
    2. Identifique los productos disponibles para el área específica, el rango de fechas y considere el límite derivado de la nubosidad. Definir: A) la región de interés utilizando la interfaz gráfica de usuario y la selección de polígonos; B) el rango de fechas y la cobertura de nubes utilizando los campos de filtro de consulta de texto.
      NOTA: Incluso si muchos informes científicos citan que un valor aceptable de nubosidad es <20%, en este tipo de investigación, es importante prestar atención a la nubosidad real solo en la superficie del agua, por lo que un valor de efectividad para esta región es <5%.
    3. Elegir productos derivados de las plataformas que mejor se ajusten a las necesidades específicas de la misión. De cada combinación de especificaciones técnicas de satélite y carga útil, es posible obtener varias colecciones de productos. Por ejemplo, los productos de datos EOSDIS24 de la NASA se procesan en varios niveles que van desde el nivel 0 hasta el nivel 4: los productos de nivel 0 son datos sin procesar a resolución completa del instrumento, mientras que en niveles más altos los datos se convierten en parámetros y formatos más útiles. Por lo general, los niveles 0-1 están disponibles, mientras que los productos en los niveles 2-4 necesitan un procesamiento específico relacionado con objetivos de investigación específicos, por lo que su disponibilidad es limitada en el tiempo y la región cubierta.
    4. Descargue el conjunto de datos elegido de observaciones satelitales. En detalle, seleccionando entre la lista de resultados de la acción anterior, descargue un producto de conjunto de datos completo (por ejemplo, un grupo de archivos geo-tiff, uno para cada banda, más información y otros metadatos) o solo una sola banda específica.
      NOTA: Para la descripción específica de cada acción básica incluida en el procedimiento del paso 1, por favor refiérase también a Huan-Huan Chen et al. 202027.
  2. Preprocesamiento y procesamiento de datos para el análisis y transformación en parámetros y formatos más útiles para permitir un primer cribado de la macroáise.
    Nota : las siguientes acciones (paso 1.2) están dedicadas al procesamiento de datos finalizado para transformar los datos sin procesar procedentes de niveles inferiores en información y, a continuación, en información útil (niveles superiores). Este paso consiste en procesar los datos sin procesar de cada sensor (por ejemplo, niveles de producto 0-1) y transformar en productos de nivel superior (por ejemplo, niveles 2-4) y, posteriormente, en capas de información para generar parámetros y formatos más útiles (por ejemplo, mapa temático).
    1. Preproceso de datos sin procesar que implican calibración geométrica y radiométrica. Esta acción se podría realizar utilizando un software específico que, de forma automática o semiautomática (no supervisada o supervisada), proporciona un conjunto de herramientas conectadas para el procesamiento de ráster con el fin de realizar una clasificación fácil respetando un flujo de trabajo correcto.
      NOTA: En esta investigación, se utilizan dos herramientas gratuitas de código abierto: Q-GIS 3.1428 combinado con el complemento de clasificación semiautomática (SCP). El plugin SCP29 permite la clasificación semiautomática de imágenes de teledetección, proporcionando un conjunto completo de herramientas para la descarga de imágenes gratuitas, el preprocesamiento, el postprocesamiento y el cálculo de ráster.
    2. Procesar datos calibrados calculando índices multiespectrales. Normalmente, esta acción se realiza utilizando una herramienta de calculadora ráster. El cálculo de un índice multiespectral define una correlación entre diferentes bandas/capas que, como resultado, genera una nueva capa que podría gestionarse en una plataforma SIG. Por ejemplo, a partir del sensor de imagen terrestre operacional (OLI) de Sentinel y Landsat, es posible calcular índices multiespectrales como el Índice de vegetación de diferencia normalizada (NDVI). El índice de vegetación se utiliza entonces para estimar el contenido de clorofila30,31.
    3. Analizar los resultados obtenidos a partir de la estimación del índice de contenido de clorofila representado como en los mapas temáticos de color falso y definir el área crítica con alta concentración de clorofila. En este estudio, se genera un mapa de clorofila-a utilizando el conjunto de datos del sensor MODIS32,montado en las plataformas satelitales Terra y Aqua. Los puntos de muestreo se localizan donde se registran valores anormales.
      NOTA: La bandera de floración de algas (que definen cada punto específico) se eleva en el dominio de teledetección cuando la concentración de Chl-a supera los 20 mg/L33.

2. Muestreos guiados

NOTA: La elección de los puntos de muestreo está impulsada por el análisis de la capa de detección remota /proximal que permite seleccionar puntos en grandes áreas costeras. Teniendo en cuenta que el muestreo podría ser peligroso para los operadores debido a la toxicidad de las microcistinas, se necesitan procedimientos de muestreo de seguridad. En particular, es necesario para proteger a los operadores de la inhalación de aerosoles y el contacto con la piel. Luego, realice el muestreo siguiendo el procedimiento que se detalla a continuación.

  1. Use gafas para la protección de los ojos, máscara FFP2 para prevenir la inhalación de aerosoles y guantes de seguridad para evitar el contacto con la piel.
  2. Recoger 0,5 L de agua por triplicado en cada sitio.
  3. Mida la salinidad de cada muestra utilizando un refractómetro. Ponga una gota de la muestra en el refractómetro y lea el valor de salinidad en términos de partes por mil (ppt - ‰).
  4. Al final de la toma de muestras, primero lávese las manos; luego a su vez retire los guantes, la máscara y las gafas teniendo cuidado de no tocar la superficie externa del equipo de protección personal.
  5. Lleve la muestra al laboratorio a temperatura ambiente.

3. Identificación de especies de cianobacterias mediante observaciones microscópicas e identificación taxonómica

  1. Centrifugar cada muestra (≈0,5 L) a 11.200 x g durante 5 min.
  2. Extracto de sobrenadantes de la siguiente manera: verter 500 mL de butanol en cada muestra y utilizando un embudo, transferir la mezcla a extraer en el embudo separador. Coloque el embudo separador en posición vertical en la abrazadera del anillo para permitir que ambas capas se separen. Deje que la fase acuosa se drene en un matraz erlenmeyer. Repita este paso tres veces. Luego, concentre las fases orgánicas al vacío y sopesárlas.
  3. Recoja pellets del paso 3.1 y analcéelos a un aumento de 400x y 1,000x con un microscopio óptico equipado con una cámara digital de 18 MP para microscopio. Busque la presencia de cianobacterias en base a sus características morfológicas: el color azul verdoso, la forma celular y el tamaño permiten reconocer cianobacterias entre otros microorganismos.
  4. Identificar la especie mediante análisis taxonómico mediante observación microscópica, según el procedimiento descrito en Komarék et al. 201434.
    NOTA: Se puede realizar un análisis metagenómico complementario 16S para identificar taxones de cianobacterias3.
  5. Diluir una alícuota de los pellets con 10 mL de agua de mar/agua dulce de medios BG11, según su salinidad, para su cultivo.

4. Identificación de cianotoxinas

  1. Extracción de muestras con disolventes orgánicos
    1. Ponga cada muestra de pellet en un frasco y sonice durante 5 minutos usando un baño de hielo. Luego, agregue 50 mL de MeOH fresco y agite suavemente. Filtre la solución con un filtro de papel y recoja el filtrado en un matraz inferior redondo. Repita este paso dos veces. A continuación, extraiga los pellets añadiendo 50 mL de mezcla de MeOH/DCM dos veces (1:1, 50 mL), y dos veces utilizando 100% DCM (x2, 50 mL)35. Etiquete cada matraz inferior redondo, respectivamente, como "Extracto de MeOH", "Extracto de MeOH/DCM" y "Extracto de DCM" y concéntrelo al vacío.
    2. Analice cada extracto orgánico (MeOH, MeOH/DCM, DCM) por LC-HRMS/MS.
  2. Análisis LC-HRMS/MS
    1. Preparación de muestras LC-HRMS y LC-HRMS/MS: disuelva cada muestra utilizando MeOH ≥ 99,9% para obtener una concentración final de 10 mg/mL.
    2. Analice cada muestra utilizando un espectrómetro de masas ESI de alta resolución junto con un sistema HPLC (sistema LC-HRMS/MS). Trabajar en la HPLC con una columna C18 de 5 μm (100 x 2,10 mm), a temperatura ambiente. Utilice una elución de gradiente conH2O (complementado con HCOOH al 0,1%) y MeOHat 200 μL min-1. El programa de gradiente es: 10% MeOH durante 3 min, 10% a 100% MeOH durante 30 min, 100% MeOH durante 7 min. Use MeOH como control.
    3. Adquisición de datos. Recopilar datos en el modo de adquisición dependiente de datos (DDA): los 10 iones más intensivos de un espectro de masas de barrido completo tienen que ser sometidos a un análisis de espectrometría de masas en tándem de alta resolución (HRMS/MS). Adquiera exploraciones HRMS/MS para iones seleccionados con fragmentación CID, un ancho de aislamiento de 2.0, energía de colisión normalizada de 35, Activación Q de 0.250 y un tiempo de activación de 30 ms.
  3. Análisis bioinformáticos y redes moleculares
    1. Analice los patrones de fragmentación para cada ion intenso utilizando un software específico de MS.
    2. Utilice MS-Cluster para agrupar los datos (tolerancia de masa principal de 1,0 Da y tolerancia de iones de fragmentos MS/MS de 0,5 Da). Se eliminan los espectros de consenso que contienen menos de 2 espectros.
    3. Analizar los datos de MS/MS por GNPS (Global Natural Products Social36)para redes moleculares.
    4. Por pares comparar espectros de consenso y también con los reportados en las bibliotecas GNPS-Mass-Ive.
    5. Visualizar la red obtenida37.
      NOTA: Para redes moleculares por favor refiérase a Sigrist et al. 202038.

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Figura 3:Pasos fds en el laboratorio (3-4). Representación visual de las principales actividades realizadas en laboratorio tras el muestreo (pasos 3 y 4). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Resultados

En un primer estudio3,cuatro sitios con impacto antropogénico a lo largo de la costa de Campania en el suroeste de Italia se observaron utilizando el satélite Landsat 8 y aviones durante el verano de 2015. El sensor operacional Landsat 8 land imager (OLI) y la cámara multiespectral de la aeronave permitieron crear imágenes del Índice de Agua de Diferencia Normalizada (NDWI) para las áreas, por lo tanto, para revelar la presencia de comunidades de cianobacterias. La composición de la comunidad de cianobacterias se determinó a través de análisis espectrofotométricos para la detección del pigmento cianobacteriano fiocianina (PC). A continuación, el análisis metagenómico complementario 16S permitió identificar taxones de cianobacterias. La indexación y clasificación simplificada de imágenes multiespectrales a través de plataformas satelitales/aéreas en combinación con análisis metagenómicos fueron eficaces para detectar la presencia de cianobacterias pertenecientes a géneros asociados con fuertes condiciones eutróficas (como Leptolyngbya sp., Pseudooscillatoria sp.), en una etapa temprana de floración.

En un segundo estudio14,el enfoque fds se probó durante la primavera /verano de 2017. Los datos satelitales se utilizaron como único nivel de teleobservación. En detalle, los datos adquiridos por el sensor MODerate Image Spectroradiometer (MODIS), montado en plataformas satelitales Terra y Aqua, permitieron la cuantificación de la clorofila-a (Chl-a) en los cuerpos de agua a lo largo de las costas de Campania e impulsaron la elección de diez puntos de muestreo. Las muestras se procesaron en laboratorio mediante observación microscópica e identificación taxonómica, y luego se extrajeron con disolventes orgánicos. Los extractos orgánicos fueron procesados por el análisis de LC-MS-MS. Los datos obtenidos por ms-ms fueron analizados utilizando un enfoque bioinformático, utilizando la plataforma GNPS para crear una red de moléculas. La red fue analizada para detectar e identificar toxinas comparando los datos de los espectros de fragmentación obtenidos por espectrometría de masas con la biblioteca GNPS. Esto permitió detectar toxinas conocidas y análogos desconocidos que aparecerán relacionados en la misma red molecular. Específicamente, Lyngbyatoxin A, dermatotoxinas lipofílicas, fue detectado en todas las muestras de agua y bivalvos; en el racimo molecular de Lyngbyatoxin A, los nodos no relacionados con ningunos compuestos sabidos de la familia de los lyngbyatoxins estaban también presentes, sugiriendo la presencia de análogos desconocidos del lyngbyatoxin. No se detectó ningunas microcystins y otras toxinas en las muestras. Todos los resultados fueron obtenidos en el plazo de 24 hombre-horas.

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Figura 4:Resultados representativos de FDS. Un ejemplo de aplicación de la estrategia FDS en la costa de Campania (Italia). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Discusión

Durante los últimos años, nuestro equipo probó y validó varios enfoques diferentes que permitieron desentrañar la presencia de cianobacterias y cianotoxinas en cuerpos de agua y bivalvos. La nueva estrategia desarrollada representa el resultado de estos estudios. Las técnicas y tecnologías óptimas que se ajustan al alcance de la detección rápida, se reúnen bajo el sombrero de un procedimiento único que maximiza la eficacia de cada paso. El área objetivo, la extensión de la floración y la etapa de crecimiento son la fuerza impulsora para la elección de métodos y tecnologías adecuados para usar.

Cuando la detección rápida de cianobacterias y cianotoxinas es la prioridad, la estrategia se racionaliza reduciendo el número total a cuatro pasos principales: (1) Detección remota y proximal y análisis de datos para un primer estudio, localización de sitios y definición de patrón de floración y extensión; (2) Muestreo guiado; (3) Observación microscópica y análisis taxonómico; (4) Análisis químico y redes moleculares de datos LC-MS para la desreplicación de las muestras de agua y la detección rápida de cianotoxinas.

En cuanto al primer paso, incluso si la disponibilidad de datos adquiridos por una cadena completa de plataformas que cubren todas las capas del enfoque de monitoreo jerárquico sería la mejor solución para restituir una visión completa del escenario analizado, a menudo solo una capa de información puede impulsar la acción de la encuesta de área y centrarse efectivamente en los puntos calientes para realizar acciones de muestreo in situ. De acuerdo con las experiencias reportadas en las que se adquirieron datos utilizando satélites, aeronaves, helicópteros, UAV, la solución que se ajusta totalmente a las necesidades requeridas por la estrategia de detección rápida es el uso de los únicos productos satelitales.

Además, las capas de información que derivan de las misiones realizadas por plataformas que vuelan a altitudes más bajas que los satélites (por ejemplo, aeronaves, helicópteros, UAV) restituyen información con gran resolución, pero estas son muy costosas y también requieren más tiempo para completar el proceso de adquisición completo que también incluye la definición y aprobación del plan de vuelo.

Una vez seleccionados los puntos a ser muestras (paso 2), los análisis analíticos/bioinformáticos (redes moleculares de datos LC-MS) son la herramienta para la desreplicación rápida de las muestras de agua y la detección rápida de cianotoxinas (pasos 3 y 4). El análisis metagenómico 16S toma al menos 2 semanas de trabajo. Además, incluso cuando se identifican especies de cianobacterias que son genéricamente tóxicas, no se demuestra su producción de toxinas. Por la misma razón, la observación microscópica no es suficiente para revelar la presencia de cianobacterias tóxicas. Por supuesto, el análisis de la EM y las redes moleculares tienen algunas limitaciones; son bastante eficaces si los compuestos de interés (por ejemplo, toxinas) están bien ionizados en las condiciones aplicadas, si están en cantidad suficiente para ser detectados. Con el fin de la detección y monitoreo de toxinas de cianobacterias conocidas, las redes moleculares basadas en LA EM representan en realidad una de las tecnologías más robustas y confiables.

Por lo tanto, este enfoque demuestra ser bastante útil cuando se necesita una detección rápida de cianobacterias y cianotoxinas relacionadas; además, la cuantificación tanto de la floración de cianobacterias como de la toxina en el espacio y el tiempo también es posible mediante esta estrategia para prevenir los problemas de las comunidades de salud que podrían surgir por las grandes floraciones tóxicas de cianobacterias.

Divulgaciones

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.

Agradecimientos

Esta investigación fue financiada por "Centro di Riferimento Regionale per la Sicurezza Sanitaria del Pescato (CRiSSaP)" en el marco del proyecto "Attività pilota di Monitoraggio di Cianobatteri nella fascia costiera della regione Campania", y realizada en cooperación con la Agencia de Protección Ambiental de la Región de Campania, Italia (ARPAC), "Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno/Osservatorio Regionale per la Sicurezza Alimentare" (IZSM/ORSA), Universidad de Nápoles "Federico II" - Departamento de Medicina Veterinaria y Producción Animal, ref. prof. A. Anastasio).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
10X MezclaÁcido nicotínico 100 mg/100 mL; PABA 10 mg/100 mL; Biotina 1 mg/100 mL; Tiamina 200 mg/100 mL; B12 1 mg/100 mL; Ácido fólico 1 mg/100 mL; i-inositol 1 mg/100 mL; Ca-pantotenato 100 mg/100 mL
1-BuOHSigma-Aldrich33065.2.5L-R
BG11 soluciónNa2EDTA 20 mg/L; Citrato de amonio férrico 120 mg/L; Ácido cítrico · 1H2O 120 mg/L; CaCl2· 2H2O 700 mg/L, MgSO4· 7H2O 1,5 g/L, K2HPO4· 3H2O 800 mg/L, NiSO4(NH4)2SO4· 6H2O (0,1 mM de stock) 5 mL; Na2SeO4 (0,1 mM de existencias) 2 mL, Nitsch's Solution 20 mL
CentrífugaHermleZ36HK
CHCl3Honeywell32211.2.5L
H2OSigma-Aldrich34877.2.5L
Kinetex C18 cloumnPhenomenex
Espectrómetro de masas ESI de alta resolución LTQ Orbitrap XL acoplado a un sistema de HPLC U3000Microscopio Thermo
MeOHHoneywell32213.2.5L
equipado con una cámara CMOS OMAX de 18 MP Cámara multibandaOptech Biostar B3
Intergraph DMC
SoluciónH3BO3 0,5 g/L
MnSO4· H2O 2.28 g/L
ZnSO4· 7H2O 0,5 g/L
CuSO4· 5H2O 0,025 g/L
COCl2· 6H2O 0,135 g/L
Na2MoO4· 2H2O 0,025 g/L
Refractómero mr 100 ATCAQL
SWBG11 medioBG11 solución madre 50 mL/L; Océano Instantáneo 33 g/L; agua 950 mL/L 10X; Mezcla de vitaminas 100 µ L/L
de vitaminas madre de Nitsch

Referencias

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