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Modelos de cocultivo microfluídico para diseccionar la respuesta inmune en microambientes tumorales in vitro

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DOI:

10.3791/61895

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30 de abril de 2021

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1CNR Institute for Photonics and Nanotechnology, 2Dept. of Oncology and Molecular Medicine, Istituto Superiore di Sanità, 3Istituto di Patologia Generale, Università Cattolica del Sacro Cuore, 4Tumor Immunology and Immunotherapy Unit, IRCCS Regina Elena National Cancer Institute

En este artículo

Resumen

En la era de la inmunoterapia y el perfil genómico unicelular, la biología del cáncer requiere nuevas herramientas in vitro y computacionales para investigar la interfaz tumor-inmune en un contexto espaciotemporal adecuado. Describimos protocolos para explotar cocultivos microfluídicos inmunes al tumor en entornos 2D y 3D, compatibles con el monitoreo dinámico y multiparamétrico de las funciones celulares.

Resumen

Los modelos de enfermedades complejas exigen herramientas de vanguardia capaces de ofrecer información fisiológica y patológicamente relevante y procesable, y revelar procesos que de otro modo serían invisibles. Los ensayos celulares avanzados que imitan de cerca el escenario in vivo se están estableciendo como formas novedosas de visualizar y medir la interacción bidireccional tumor-huésped que influye en la progresión del cáncer. Aquí describimos dos protocolos versátiles para recrear cocultivos 2D y 3D altamente controlables en microdispositivos, imitando la complejidad del microambiente tumoral (TME), bajo inmunovigilancia natural e inducida por terapia. En la sección 1, se proporciona un entorno experimental para monitorear la diafonía entre las células tumorales adherentes y las poblaciones inmunes flotantes, mediante microscopía de lapso de tiempo de campo brillante. Como escenario aplicativo, analizamos los efectos de los tratamientos contra el cáncer, como los llamados inductores inmunogénicos de muerte de células cancerosas sobre el reclutamiento y la activación de las células inmunes. En la sección 2, los microambientes inmunes al tumor 3D se ensamblan en un diseño competitivo. La infiltración inmune diferencial se monitoriza mediante instantáneas de fluorescencia hasta 72 h, para evaluar estrategias terapéuticas combinadas. En ambos entornos, se ilustran los pasos de procesamiento de imágenes para extraer una gran cantidad de parámetros de células inmunes (por ejemplo, migración e interacción de células inmunes, respuesta a agentes terapéuticos). Estos métodos simples y poderosos se pueden adaptar aún más para simular la complejidad del TME que abarca la heterogeneidad y plasticidad de los subtipos de células cancerosas, estromales e inmunes, así como sus interacciones recíprocas como impulsores de la evolución del cáncer. El cumplimiento de estas tecnologías en rápida evolución con imágenes de alto contenido de células vivas puede conducir a la generación de grandes conjuntos de datos informativos, lo que plantea nuevos desafíos. De hecho, el triángulo "co-cultivos/microscopía/análisis avanzado de datos" establece el camino hacia una parametrización precisa del problema que puede ayudar a protocolos terapéuticos a medida. Esperamos que la futura integración de inmune al cáncer en un chip con inteligencia artificial para el procesamiento de alto rendimiento sinergice un gran paso adelante en el aprovechamiento de las capacidades como herramientas predictivas y preclínicas para la oncología de precisión y personalizada.

Introducción

La evolución de las diferentes ramas de la medicina como disciplinas experimentales ha dependido de la capacidad de manipular la población celular y las funciones orgánicas en condiciones controladas1. Tal capacidad tiene sus raíces en la disponibilidad de modelos medibles capaces de recapitular los procesos que ocurren en nuestro cuerpo.

En la era de la inmunoterapia y el perfil genómico unicelular 2, la biología del cáncer necesita aprovechar los modelos emergentes in vitro y computacionales para investigar la interfaz tumor-inmune en un contexto espaciotemporal adecuado 2,3.

El microambiente tumoral4 (TME) es un tejido complejo donde las células cancerosas interactúan continuamente y coevolucionan dinámicamente con los otros componentes celulares (células inmunes, estromales y endoteliales) y no celulares (la matriz extracelular, ECM). La naturaleza dinámica de este complejo paisaje dicta si las células inmunes juegan como amigas o enemigas de las células malignas, lo que afecta fuertemente tanto la progresión de la enfermedad como la respuesta a la terapia. Hoy en día, grandes esfuerzos de oncoinmunólogos, bioinformáticos y expertos en biología de sistemas están convergiendo para abordar la importancia clínica de la heterogeneidad del cáncer 5,6, ya sea en el espacio (es decir, en distintas regiones tumorales) y el tiempo (es decir, en distintas etapas de progresión tumoral)5,6, y para caracterizar el fenotipo y la función del cáncer y las células inmunes a nivel de una sola célula. Como ejemplo de esta sinergia, las técnicas avanzadas de visión artificial se utilizan ahora de forma rutinaria para el mapeo espacial del infiltrado inmune en muestras histológicas 7,8.

En el frente de los modelos experimentales, uniendo estudios en animales y métodos tradicionales in vitro, los avances en microfluídica y técnicas de cocultivo dan acceso a diferentes clases de modelos celulares de microingeniería como organoides, sistemas microfisiológicos 9,10,11 (MPS) y órganos en chip12,13,14 (OOC). Comparten el rasgo común de ampliar la visión general de los ecosistemas celulares y expandir el potencial in vitro para controlar los factores microambientales mientras explotan la microscopía de alto contenido15 y los enfoques de procesamiento de imágenes.

Hoy en día, los sistemas MPS y OOC de última generación han comenzado a incluir aspectos inmunológicos, incorporando diferentes subtipos de células inmunes en tejidos y cocultivos existentes, para explorar y medir una variedad de procesos como enfermedades inflamatorias, cicatrización de heridas, inmunidad mucosa y respuesta a toxinas o productos alimenticios diarios16. Los modelos TME-on-a-chip 10,11,12,13,14,15,16,17, también integrados con microvasos perfusibles 18,19,20,21, se han desarrollado para investigar las interacciones dependientes del tipo celular, las perturbaciones físicas y químicas y la actividad citotóxica de linfocitos infiltrantes22, así como agentes inmunomoduladores clínicamente relevantes23.

Aquí, proporcionamos protocolos versátiles, que abarcan desde células de carga en chips hasta herramientas de procesamiento de imágenes, para explotar cocultivos microfluídicos avanzados inmunes al tumor en configuraciones 2D (sección 1) y 3D (sección 2)16, compatibles con el monitoreo dinámico y multiparamétrico24 y la visualización de funciones celulares. Esto se logra manteniendo la facilidad de uso y flexibilidad tanto en la gestión de muestras como en el análisis de datos, aprovechando el software gratuito de Fiji y sus cajas de herramientas25,26.

El dispositivo microfluídico, descrito en la sección 1, está diseñado para realizar cocultivos 2D de cáncer adherente y células inmunes flotantes. Esta plataforma fue validada para la medición in vitro del comportamiento de las células inmunes en presencia de mutaciones genéticas27 y/o inmunodeficiencias28. Aquí, ilustramos los pasos para rastrear las células inmunes en imágenes de campo claro de lapso de tiempo, explotando un método semiautomático basado en Trackmate (un complemento implementado en el software de Fiji). Este procedimiento permite la extracción de descriptores cinemáticos de migración inmune 29 y respuesta (es decir, tiempos de interacción) a células cancerosas diana, tratadas o no con inductores de muerte celular inmunogénica27.

Es importante destacar que estos parámetros, extraídos de imágenes de series temporales, se pueden procesar con maquinaria matemática avanzada. Como ejemplo de la potencialidad de este enfoque, nuestros grupos publicaron recientemente un análisis basado en métodos matemáticos de procesos estocásticos y mecánica estadística para modelar las propiedades de la red celular y proporcionar una descripción parametrizada del comportamiento de las células inmunes (es decir, caminata aleatoria sesgada o no correlacionada, movimiento altamente o no coordinado30,31).

La configuración 3D, proporcionada en la segunda sección, se basa en un protocolo de cocultivo para recrear TME inmunocompetentes más complejos incrustados en dos regiones de gel con diferentes combinaciones de tipos de células y medicamentos de manera competitiva. Aquí, se describen los pasos de procesamiento de imágenes para medir, en diferentes puntos temporales, la infiltración de células inmunes teñidas en células de melanoma A375M humano cultivadas dentro de Matrigel, para evaluar combinaciones de agentes antitumorales32. La línea A375M, una línea celular derivada de A375P caracterizada por un fenotipo altamente metastásico, fue elegida para evaluar su capacidad metastásica en presencia de células inmunes32.

Los modelos descritos pueden ser totalmente compatibles con diferentes fuentes celulares (líneas celulares murinas y humanas inmortalizadas o primarias, organoides, xenoinjertos, entre otros). En estudios recientes de nuestro laboratorio, al combinar microscopía de video de alto contenido con análisis de imágenes, se aplicó el diseño 3D competitivo para investigar: i) una respuesta inmune antitumoral (citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) y diseccionar el papel de los fibroblastos en la resistencia a la terapia con trastuzumab en modelos en chip de cáncer de mama HER2+ 33; ii) la acción de las células mieloides (es decir, macrófagos asociados al cáncer) en los mecanismos de evasión tumoral y reclutamiento de células T34; iii) la eficacia de los regímenes inmunoterapéuticos, específicamente basados en células dendríticas condicionadas por interferón α (IFN-DC), cultivadas con células de cáncer de colon tratadas con fármacos en matrices de colágeno, y evaluar el movimiento eficiente y los eventos de fagocitosis subsiguientes35; iv) la migración quimiotáctica de eosinófilos derivados de la médula ósea hacia células de melanoma tratadas o no tratadas con IL-3336.

Estos modelos avanzados podrían servir como ventanas de observación para comprender el papel de la textura inmune en la metástasis del cáncer y los mecanismos de resistencia, pero se requieren esfuerzos para traducir los hallazgos a las clínicas, cerrando la brecha con la investigación básica37.

Como escenario emergente, aprovechar el poder de la microscopía automatizada de alto contenido junto con el uso de microsistemas más relevantes fisiológicamente está abriendo nuevos desafíos potenciales para el manejo, procesamiento e interpretación de cientos, e incluso miles, de Gigabytes de datos multiparamétricos, que se pueden generar a partir de una sola campaña experimental. Esto implica un vínculo directo de los experimentos OOC con algoritmos basados en inteligencia artificial 38,39,40,41,42 (AI) tanto para el análisis automatizado avanzado como para la generación de características que pueden alimentar a su vez modelos in silico de interacción cáncer-inmune 43, con nuevas aplicaciones emocionantes en el horizonte, como el desarrollo de ensayos predictivos de detección de medicamentos 44.

Un flujo de esfuerzos cada vez mayor se centra en el diseño de modelos de enfermedades junto con la optimización de estrategias para implementar las pantallas de perturbación a gran escala con lecturas multiómicas de una sola célula. Sin duda, esto ayudará al desarrollo y, con suerte, a la implementación clínica, acompañada de un grado apropiado de estandarización del método, de un enfoque sistemático de oncoinmunología en un chip para obtener nuevos conocimientos sobre los trastornos inmunes y los mecanismos de diseminación del cáncer.

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Protocolo

1. Diseño de chip para cocultivos 2D de células adherentes y flotantes

NOTA: El diseño de cocultivo 2D (Figura 1A-C) se caracteriza por tres cámaras (100 μm de altura) interconectadas por dos conjuntos de matrices de microcanales (500 x 12 x 10 μm3, L×W×H). La cámara intermedia forma dos compartimentos cerrados sin salida que bloquean las células inmunes flotantes que se desbordan en el sitio del tumor durante el paso de carga 2.5. Este tipo de dispositivo es útil para mediciones bidimensionales en tiempo real de la motilidad unicelular (adherente o flotante) y de las interacciones célula-célula 16,27,28,30,31. Un estudio típico de migración celular (realizado de varias horas a varios días) combina microscopía de células vivas con algoritmos de procesamiento de imágenes45, para traducir las secuencias de imágenes adquiridas en características numéricas25. A partir de los patrones migratorios, se pueden estimar varios indicadores biofísicos, como el desplazamiento y la velocidad de las células, así como la duración de las interacciones entre las células inmunes y las células diana24.

  1. Preparación de células cancerosas y PBMC
    1. Cultivo de células cancerosas
      NOTA: MDA-MB-231 triple negativo [receptor de estrógeno (ER)-, receptor de progesterona (PR)-, y receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2)-] las células de adenocarcinoma de mama humano se cultivan rutinariamente en un medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado con 10% (v/v) de suero fetal bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, 100 UI mL−1 de penicilina G sal sódica y 100 μg mL−1 de sulfato de estreptomicina (medio de crecimiento), en condiciones de cultivo estándar (37 °C y 5%CO2).
      1. Para optimizar el crecimiento del cultivo celular, colocar en placa células MDA-MB-231 en matraces de 75 cm2 a una densidad de 1 × 106 células mL-1 en 12 a 15 ml de medio de crecimiento.
      2. Cuando las células alcancen el 75-80% de la confluencia, deseche el medio de crecimiento, lave las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS) precalentada para eliminar completamente el FBS y luego sepáralas con tripsina precalentada (1 a 2 min a 37 °C).
      3. Agregue medio de crecimiento para inactivar la actividad enzimática de tripsina y recolectar células desprendidas. Lave las celdas dos veces durante 5 minutos a 1.100 x g a temperatura ambiente (RT).
      4. Contar células en un portaobjetos de conteo de células mediante la prueba de exclusión de colorante Trypan Blue y luego volver a sembrarlas para cultivo de mantenimiento (para no más de 6 pasajes desde la descongelación) o para procedimientos experimentales.
      5. Para experimentos microfluídicos, sembrar 1 × 10 6 células en placas de6 pocillos en 3 ml de medio de crecimiento y tratar con 25 μM de doxorrubicina (DOXO) o un volumen igual de disolvente DOXO (PBS) como control.
      6. Cuatro a 6 horas después, lave las células tratadas con DOXO dos veces con PBS precalentado durante 5 minutos a 1.100 x g en RT.
      7. Contar las células de control tratadas con DOXO y PBS como se indica anteriormente (véase el paso 1.1.1.5) y establecer el cocultivo con células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en dispositivos microfluídicos.
    2. Aislamiento PBMC
      1. Recoja sangre total venosa (10 ml aproximadamente) de voluntarios sanos en viales heparinizados y mezcle suavemente invirtiendo el tubo de 2 a 4 veces47.
      2. Diluir sangre 1:1 con PBS y colocar sobre 10 mL de gradiente de densidad medio Lymphoprep en un tubo de 50 mL.
        NOTA: Asegúrese de hacer las capas muy suave y lentamente para permitir que la sangre y Lymphoprep formen dos capas distintas.
      3. Tubos centrífugos durante 30 minutos a 400 x g a 4 °C en un cucharón abatible sin frenos. Se formarán cuatro capas distintas: (i) plasma en la parte superior, (ii) una capa blanca y turbia que contiene PBMC, (iii) Lymphoprep y (iv) una bolita de eritrocitos y granulocitos.
      4. Aspirar suavemente las PBMC con una pipeta de 2 ml y resuspender inmediatamente en un medio de crecimiento caliente (el mismo utilizado en el paso 1.1.1) y lavar dos veces durante 5 min a 1.100 x g a RT.
      5. Contar las PBMC peletizadas como se indica anteriormente (véase el paso 1.1.1.5) y utilizarlas para procedimientos experimentales o congelarlas para su almacenamiento a largo plazo.
  2. Recubrimiento de las células en chips 2D
    NOTA: Las PBMC no están teñidas en este protocolo. Para caracterizar fenotipos específicos en chip, las subpoblaciones de células inmunes pueden aislarse mediante selección de perlas inmunomagnéticas, teñirse con seguidores de células fluorescentes, remezclarse con la fracción restante no marcada y, por lo tanto, confrontarse con células cancerosas objetivo, como se informó en los experimentos en chip, descritos en Vacchelli et al.27, y en Racioppi et al.34.
    1. Antes de comenzar los experimentos de cocultivo y para facilitar la adición de reactivos, active los chips almacenados mediante un tratamiento de plasma de oxígeno durante unos segundos. Llene inmediatamente los depósitos con agua desionizada o PBS para mantener las superficies PDMS (polidimetilsiloxano) hidrófilas hasta los pasos de recubrimiento.
      NOTA: El PDMS es intrínsecamente hidrófobo, lo que puede dar lugar a dificultades de funcionamiento y al atrapamiento de burbujas de aire en microcanales. Consulte el paso 7 del archivo complementario que proporciona detalles sobre la activación del plasma de oxígeno.
    2. Esterilizar bajo un gabinete UV durante 20 minutos, lavar 2-3 veces con PBS fresco y luego incubar con medios de cultivo durante 1 h. Mantenga las fichas en la incubadora hasta que realice los pasos de enchapado.
    3. Retire el exceso de medios de los seis depósitos. Tenga cuidado de evitar succionar los medios de comunicación de las principales cámaras de cultivo.
    4. Aplicar lentamente 1 × 105 células cancerosas resuspendidas en 10-20 μL de medio de crecimiento en el reservorio superior izquierdo y luego en el pocillo inferior (Figura 1A, reservorios 1 y 2). Espere 5 minutos para permitir que las células se adhieran a la cámara tumoral. Algunas células se asentarán y se adherirán en los reservorios.
      NOTA: Inserte la suspensión celular junto a las aberturas del canal. Este procedimiento se aplica a las células cancerosas MDA-MB-231, otras líneas requerirán optimización de la densidad celular. Para mejorar la unión de las células cancerosas, se puede realizar una funcionalización de recubrimiento de superficies (por ejemplo, poli-L-lisina, fibronectina). Consulte los protocolos publicados anteriormente para los pasosde recubrimiento 16, 48,49,50.
    5. En el lado derecho, pipetear suavemente 1 × 106 PBMC resuspendidos en 50 μL de medio de crecimiento en pocillos 3 y 4 (véase la figura 1A, depósitos 3 y 4).
      NOTA: Después de fluir, PBMC se distribuirá en la cámara intermedia creando un "frente", que representa el punto de partida del experimento.
    6. Llene los seis reservorios con hasta 100-150 μL de medio de crecimiento. Bajo un microscopio, verifique que las células se hayan distribuido correctamente en los compartimentos de cultivo como se muestra en la Figura 1D-E. Los volúmenes finales pueden variar con el tamaño de los depósitos. Ajuste los volúmenes para que sean iguales en todos los pozos.
    7. Vuelva a colocar los chips en la incubadora durante aproximadamente 1 h para estabilizar el sistema antes de la grabación de lapso de tiempo. Añadir medio fresco cada 3 días, ya que puede estar sujeto a pérdidas por evaporación.
      NOTA: El sistema es compatible tanto con el análisis de células vivas / muertas como con el perfil dinámico de secreción de citoquinas multiplex de medios acondicionados. Para los análisis de quimiocinas, se puede acceder a alícuotas de sobrenadantes de hasta 200-250 μL mediante la recolección de medios de los dos reservorios de cada compartimento. Los ensayos clásicos de perfiles de citoquinas ELISA y Luminex requieren aproximadamente 50 μL de sobrenadantes. Consulte 51,52 ejemplos de estudios de otros laboratorios que realizan perfiles de citoquinas en modelos OOC.
  3. Adquisición en lapso de tiempo de cáncer y células inmunitarias no marcadas
    NOTA: Normalmente, 3 chips están dispuestos en un solo portaobjetos de microscopio (consulte la Figura 1A para el chip 2D y la Figura 4B para el chip 3D). Utilizando soportes de escenario que asignan 4 portaobjetos, los cocultivos pueden ser adecuados para ser monitoreados por microscopía automatizada de alto contenido para analizar grandes lotes de condiciones experimentales. Los chips se pueden montar fácilmente en portaobjetos con un grosor igual a 1 mm o 170 micras (cubreobjetos de plástico o vidrio, multipocillos de fondo óptico de 6 pocillos) para obtener imágenes confocales de alta resolución.
    1. Grabe series de imágenes de campo claro de células no marcadas mediante una configuración de microscopía de vídeo equipada con un sistema de incubación.
      NOTA: Aquí se adquirieron conjuntos de datos de series temporales (ventana de tiempo: 48 h, velocidad de fotogramas: 2 min) con un microscopio de fluorescencia, equipado con un objetivo 4x y píxeles CMOS 1.3M, optimizado para encajar en una incubadora de cultivo celular estándar.
    2. Calentar el microscopio durante al menos 2 h para equilibrar a 37 °C y 5% deCO2 antes de comenzar la adquisición.
    3. Seleccione la ventana de observación centrando la matriz de microcanales entre el tumor y el compartimiento central. Esto permite visualizar la dinámica de la infiltración inmune y las interacciones dentro de la región en la que se siembran las células cancerosas.
    4. Ajustar la intensidad de la iluminación y el enfoque de las células cancerosas e inmunitarias.
    5. Para lanzar la adquisición de lapso de tiempo, optimice la velocidad de fotogramas y la duración del tiempo de acuerdo con el experimento y el tipo de celda en estudio.
      NOTA: Las condiciones de imagen deben optimizarse para evitar una exposición excesiva a la foto, manteniendo al mismo tiempo una buena relación señal-ruido (SNR). Como las células inmunes son muy móviles, la velocidad de fotogramas de adquisición debe ser lo suficientemente alta como para seguir el proceso dinámico de interés y permitir un fácil seguimiento53. Se debe llegar a un compromiso entre el algoritmo de seguimiento, la compatibilidad con el tamaño del conjunto de datos resultante y la viabilidad, densidad y motilidad de las células observadas.
    6. Al final del lapso de tiempo, utilice la función Importar secuencia de imágenes y Guardar como del software ImageJ para convertir el conjunto de datos de fotogramas en un archivo de vídeo sin comprimir de 25 fps.
      NOTA: El archivo de vídeo generado ya está listo para el análisis de seguimiento de celdas. Aquí, se recopilaron imágenes RGB (1280x1024 píxeles) con una resolución espacial de 1,33 μm / píxel. Una película de 24 horas de duración (pila de 3,5 GB) de un solo campo de visión (FOV) consta de 720 fotogramas para cada condición.
  4. Análisis de datos: Extracción semiautomática de pistas inmunes no marcadas por Trackmate
    NOTA: Aquí, el análisis de motilidad inmune en imágenes de lapso de tiempo 2D no etiquetadas se lleva a cabo utilizando TrackMate54, una caja de herramientas de código abierto disponible en el paquete de software Fiji/ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). Se proporcionan varios algoritmos para realizar el seguimiento automatizado de partículas individuales55(SPT) de estructuras puntuales. Se han aplicado de manera eficiente a imágenes fluorescentes, donde los objetos son brillantes sobre un fondo oscuro con alta SNR (es decir, puntos fluorescentes de subresolución, vesículas de tráfico etiquetadas, núcleos)1,25,56,57,58. SPT se basa principalmente en dos pasos secuenciales. En primer lugar, los objetos se localizan con posiciones identificadas en varios fotogramas (segmentación), como se esquematiza enFigura 2. En la segunda etapa (enlace de partículas), los puntos detectados se vinculan a lo largo de fotogramas consecutivos para estimar el movimiento y reconstruir sus trayectorias, en forma de pista (Figura 3). Las características numéricas se pueden calcular a partir de cada matriz de coordenadas X, Y, Z extraída a lo largo del tiempo. La documentación ampliada se informa en54así como en línea (http://imagej.net/TrackMate), siguiendo el tutorial Introducción a TrackMate. La precisión del proceso se puede inspeccionar de inmediato, manejando una interfaz gráfica de usuario intuitiva (GUI similar a un asistente) que permite a los usuarios, en cada paso, reajustar la configuración. La siguiente parte muestra brevemente cómo usar Trackmate para el procesamiento de imágenes y los pasos de cuantificación, aplicados a imágenes con luz visible:
    1. Arrastre y suelte la pila de vídeo/imagen a tiempo completo en la barra de herramientas de Fiji.
    2. Configuración de la pila de calibración (Figura 2A).
      1. Compruebe la dimensionalidad y asigne las propiedades de la imagen seleccionando Propiedades > imagen. Unidad de relleno de longitud, dimensiones de píxeles y cuadros de intervalo de fotogramas.
        NOTA: Para realizar la calibración, utilice la longitud conocida de los microcanales (500 μm, Figura 1C) y divida por la longitud medida correspondiente en píxeles. Para series temporales 2D, asegúrese de cambiar el campo Z/T introduciendo 1 como z-slice y el número correcto de fotogramas de película. Si no se logra, las salidas cuantitativas y los parámetros de Trackmate se informarán en unidades de píxeles y marcos de tiempo.
    3. Pre-procesamiento de imágenes.
      1. Para mejorar la discriminación correcta de las células inmunes de un fondo ruidoso, preprocese imágenes de campo claro para compensar los artefactos. Asegúrese de que los conjuntos de datos constan de imágenes TIFF de 8 bits (rango de brillo: 0-255).
        NOTA: La iluminación desigual, la baja SNR y la contaminación por partículas de escombros pequeños en imágenes de luz visible podrían comprometer el éxito de un proceso de seguimiento celular. Aquí, los conjuntos de datos de series temporales se procesan previamente mediante sustracción de fondo, función de ajuste de brillo/contraste y sustracción de imagen local de un desenfoque gaussiano de las imágenes originales. Existen otros kits de herramientas de análisis diferentes disponibles en ImageJ para el procesamiento y la segmentación de imágenes de contraste de fase o de campo claro, incluido el umbral de gradiente empírico (EGT)59.
    4. Primer panel de calibración (Figura 2A)
      1. Con la pila de imágenes seleccionada, inicie Trackmate (Plugins>Tracking).  Revisar/confirmar la dimensionalidad y la ventana temporal de los datos (es decir, el ancho de píxeles y el intervalo de fotogramas).
        NOTA: TrackMate lee automáticamente en el cuadro de propiedades de la imagen para dar los resultados finales de seguimiento en unidades físicas calibradas (es decir, μm y minutos).
      2. Defina una región de interés para calcular la extracción de pistas inmunes, insertando valores manualmente o dibujando un área cerrada sobre la imagen activa y, a continuación, presionando el botón Actualizar fuente. Para extraer las rutas de migración inmune global, seleccione regiones rectangulares respectivamente en el lado derecho de los microcanales (cámara central, Figura 1E) y a la izquierda (cámara tumoral, Figura 1D). Para analizar las interacciones entre el cáncer y los puntos calientes inmunitarios, dibuje subregiones circulares utilizando herramientas de ROI (vaya a Editar → selección → Especificar).
        NOTA: Cuando ejecute por primera vez esta caja de herramientas en una nueva aplicación biológica, dedique el tiempo necesario a optimizar la configuración para reconstruir las pistas.
        NOTA: Realizar un seguimiento manual de las trayectorias celulares (unas 50-100 celdas) para encontrar empíricamente la configuración correcta y a continuación validar como referencia la fiabilidad de la extracción automática de movimientos. Además, trabaje inicialmente en un área más pequeña para verificar fácilmente la precisión de los parámetros elegidos.
    5. Paso de detección de manchas inmunes (Figura 2B)
      1. Seleccione el detector predeterminado Laplaciano de Gaussiano (LoG). El detector LoG funciona para encontrar objetos brillantes, redondeados en forma de mancha y aplicar un filtro laplaciano de gaussiano en la imagen ajustada para tamaños de punto intermedios (5 a 20 píxeles de diámetro).
      2. En Estimated Blob Diameter (Diámetro estimado de la mancha) (aquí, 10-13 μm) introduzca un valor ligeramente mayor que el tamaño de punto esperado. Aumente el valor de umbral (aquí 1-3 μm) hasta que se reduzcan los puntos de fondo espurios adicionales, posiblemente sin eliminar las características del objeto. Las detecciones por debajo del valor umbral (basadas en una métrica de calidad) se descartarán del análisis posterior. Marque la casilla del filtro mediano y la localización de subpíxeles para mejorar la calidad de la detección de manchas.
      3. Utilice el botón Vista previa para ver e inspeccionar rápidamente las células inmunitarias identificadas superpuestas en las imágenes por círculos de color magenta.
        NOTA: Los errores durante la detección tendrán un impacto considerable en el proceso de vinculación. Otras detecciones no deseadas pueden corregirse en los menús siguientes mediante filtros definidos por el usuario (es decir, por intensidad de punto, tamaño o posición).
    6. Una vez que esté satisfecho con las selecciones, presione Siguiente.
      NOTA: Estos ajustes pueden variar dependiendo de la configuración experimental y las modalidades de adquisición de imágenes (por ejemplo, FOV, aumento objetivo, imágenes de campo brillante o fluorescentes), tipo de célula (células adherentes o flotantes), de la motilidad lenta o rápida, tipo de comportamiento celular (interactuando o no) y densidad baja/media/alta en el área de observación.
    7. Continúe y omita el menú Umbral inicial. Seleccione la ventana Hyperstack Displayer.
    8. Defina filtros en el panel de puntos (Figura 2C).
      1. Seleccionar: Color uniforme. Los filtros, como se muestra en la Figura 2C, se pueden agregar para retener puntos etiquetados con valores de entidad, mostrados en un histograma, por encima o por debajo de un umbral reversible.
    9. Etapa de selección del rastreador (Figura 3A). Elija el rastreador LAP simple, como algoritmo de enlace de partículas que solicita tres campos para completar (en este caso, "Distancia máxima de enlace": 30-50 μm, "Distancia máxima de cierre de brecha": 25-50 μm, "Brecha de marco máximo de cierre de brecha": 4-6). Este detector gestiona los eventos de cierre de brechas, con un cálculo de enlace de costos basado únicamente en su distancia respectiva.
      NOTA: La distancia de enlace máxima permitida limita el rango de búsqueda espacial para los puntos de coincidencia candidatos, correspondiente al desplazamiento máximo permitido recorrido entre dos fotogramas posteriores (Figura 3D).
      1. Proporcionar valores mayores de desplazamiento máximo cuando se nota la fragmentación de las huellas de partículas altamente móviles.
        NOTA: No se conectarán dos enlaces si el movimiento fotograma a fotograma es mayor que el valor de distancia máxima dado. Si los segmentos unen mal dos celdas diferentes, disminuya el valor del desplazamiento máximo.
      2. Intente volver a conectar los puntos que faltan, variando los valores de "la distancia máxima para el cierre de la brecha" y "la brecha máxima del cuadro".
        NOTA: Estos parámetros tratan de eventos de cierre de huecos en fotogramas no adyacentes. La desaparición puntual puede ocurrir para algunos fotogramas (es decir, partículas desenfocadas, celdas que salen y están en el FOV, fallas de segmentación en una imagen ruidosa).
        NOTA: Para manejar eventos de división o fusión, opte por el enlazador LAP como detector que introduce penalizaciones de matriz de costos de vinculación.
    10. Haga clic en Siguiente para ejecutar el cálculo de seguimiento. Presione Siguiente.
    11. Panel Filtrado de pistas (Figura 3B). Cambie el color de las rutas inmunes seleccionando, desde el menú desplegable, "ID de seguimiento" u otras funciones de seguimiento. En este punto, elija opcionalmente establecer filtros interactivos funcionales, para mejorar la calidad del resultado y revisar el procedimiento.
      NOTA: Las manchas espurias surgen del ruido en la imagen y la pérdida de calidad de la característica. Esto generará segmentos cortos, mientras que las celdas de interés se pueden rastrear en muchos marcos.
      1. Para eliminar rutas cortas, intente filtrarlas, según el número de puntos que contienen. Además, ordene las pistas utilizando una combinación de opciones como el desplazamiento de la pista, la duración de la pista o la velocidad mínima/media/máxima para excluir pistas falsas o no deseadas (con menos fotogramas con respecto a la duración total del lapso de tiempo o que impliquen partículas sucias o que no se muevan) del posprocesamiento.
        NOTA: La elección de los filtros puede variar según la aplicación específica y el sistema biológico.
    12. Examine todas las pistas en la interfaz Opciones de visualización, desplácese por el tiempo y compruebe la precisión de las pistas que coinciden con las rutas de migración de celdas. El menú desplegable proporciona códigos de color para puntos y trayectorias para facilitar la visualización y el filtrado por varias modalidades (por ejemplo, parámetros cinéticos, intensidad, posición temporal o espacial).
      NOTA: Para el seguimiento de cultivos de alta densidad, o celdas de alta movilidad, aumente la velocidad de fotogramas de adquisición minimizando el desplazamiento de celdas viajado en intervalos de tiempo consecutivos.
    13. Corrección manual de errores de segmentación y vinculación (Figura 3E).
      1. Para mejorar aún más la calidad de los resultados, edite manualmente las manchas (partículas de desechos, células estacionarias) y elimine las pistas erróneas derivadas de los límites tumorales detectados al analizar los ROI de interacción tumoral-inmune.
      2. Primero, seleccione la herramienta TrackMate en la barra de herramientas de ImageJ. Para eliminar un punto existente en toda la pila, presione shift y cree con el cursor del mouse una máscara ROI sobre el punto objetivo (editado en un círculo verde) y luego presione la tecla SUPR.
      3. Para agregar un nuevo punto (en caso de que falten pistas debido a la desaparición de manchas) presione la tecla A, colocando el mouse en la ubicación señalada. Repita el proceso de cálculo de vinculación de pistas después de este paso.
    14. Cuando esté satisfecho, seleccione Análisis en el panel Opciones de visualización para generar tres archivos de texto (Figura 3C y 3F). La tabla en "Spots in tracks statistics" proporciona las coordenadas espaciotemporales de las manchas inmunes (posiciones X-Y-Z de las células marcadas con el marco asociado y el número de pista). "Estadísticas de enlaces en pistas" y "Estadísticas de pistas" contienen información relativa a las pistas: duraciones de pistas, número de huecos o puntos detectados, inicio de pista y fotograma de parada, etc. Guarde y exporte para cada conjunto de datos.
      NOTA: Al hacer clic en una fila dentro de las ventanas de resultados, el punto, enlace o pista respectiva se activa dentro del video de lapso de tiempo para la inspección visual. Repita los pasos de filtrado para seleccionar/eliminar pistas. Todos los datos exportados futuros se actualizarán. SUGERENCIA: Los valores de duración iniciales y de fotograma de parada y seguimiento se pueden explotar para calcular los tiempos de contacto entre el cáncer y las células inmunes al procesar los ROI de la interacción.
    15. Pulse el botón Guardar para generar un archivo XML resultante que contenga todos los valores de los parámetros, la ruta a las imágenes y las posiciones puntuales en el tiempo. El comando ''Load TrackMate file'' (Plugins> Tracking) restaura toda la sesión de proceso para cada archivo de película individualmente.
    16. Vaya al último panel de la GUI llamado Seleccionar una acción. En la lista, utilice la superposición de captura > función Ejecutar para producir un vídeo con pistas superpuestas. CONSEJO: La opción "Trazar N-puntos vs tiempo" se puede utilizar para calcular la densidad espacial de las células inmunes en un ROI (Figura 6B, panel derecho).
    17. Análisis posterior al procesamiento y estadísticas de migración
      1. Analice los datos de posición sin procesar directamente en Trackmate o exporte datos para calcular parámetros cinéticos completos29 (es decir, longitud total de la trayectoria, distancia euclidiana, relación de confinamiento, desplazamiento cuadrático medio56, velocidad de pista promedio o instantánea, coeficiente de detención, distribución de ángulos de migración, índice de migración hacia adelante, velocidad media en línea recta) para clasificar el comportamiento de migración de células inmunes (por ejemplo, movimiento dirigido o difusivo30, 31) y la respuesta a las células cancerosas diana (p. ej., tratadas frente a control).
        NOTA: Los complementos útiles adicionales, como The Chemotaxis and Migration Tool (http://ibidi.com/software/chemotaxis_and_migration_tool/) proporcionan varios gráficos (por ejemplo, gráficos de rosas o sectores, como se muestra en la Figura 6) y pruebas estadísticas para el análisis avanzado y la visualización de datos experimentales de migración y quimiotaxis. La combinación de algoritmos de seguimiento celular y segmentación celular24,25,45 puede permitir mediciones de métricas morfológicas a nivel de celda única (es decir, área de superficie celular, la longitud del eje mayor y menor, y la relación de aspecto celular).

2. Modelo 3D inmunocompetente de cáncer en chip en un ensayo competitivo

NOTA: El diseño del chip 3D, representado en laFigura 4, consta de 5 compartimentos principales: uno central para la ingesta de células inmunes flotantes, dos regiones laterales para incrustar células tumorales en  matrices de hidrogel (150-250 μm de altura) y cámaras de perfusión de medios. Las cámaras inmunes y tumorales están conectadas por dos conjuntos de matrices estrechas de microcanales (200×12×10 μm3, L×W×H, Figura 4E). Regularmente, los micropilares isósceles trapezoidales espaciados en 100 μm (alrededor de 25-30 interfaces para cada región lateral del gel, Figura 4C) funcionan como barreras para confinar la solución de gel durante la inyección, explotando el equilibrio entre la tensión superficial y las fuerzas capilares60,61 y conectan las regiones tumorales a las dos cámaras de medios laterales adicionales para establecer una interfaz gel-líquido (Figura 5). Las características detalladas del ensayo competitivo 3D se muestran en la Figura 4. Se puede monitorear y cuantificar la migración preferencial de las células inmunes hacia los dos compartimentos de hidrogel que albergan células tumorales que se han sometido a diferentes tratamientos. El diseño competitivo particular se puede aplicar para investigar una gran cantidad de diferentes fenotipos de biología del cáncer (por ejemplo, resistente a los medicamentos frente a agresivo, primario o metastásico, respondedores frente a no respondedores). Además, las regiones incrustadas en gel se pueden integrar fácilmente con diferentes poblaciones celulares para recrear EMT más heterogéneas, incluidos componentes estromales (fibroblastos, células endoteliales)23 o para simular medios inmunosupresores específicos34 (por ejemplo, macrófagos) para diseccionar mecanismos de resistencia a fármacos y evasión tumoral.
NOTA: La tinción nuclear y activa de caspasas, mediante el uso de kits comerciales para ensayos vivos/muertos (por ejemplo, Thermo Fisher Scientific, reactivos Incucyte), puede implementarse para evaluar eventos de muerte mitótica o apoptótica, como se informa en Nguyen et al.33.

  1. Preparación de solución matricial con células y carga en el dispositivo
    NOTA: En el siguiente entorno experimental, las dos regiones de gel contienen mezclas de líneas celulares de melanoma A375M humano, cultivadas en solución de matriz (por ejemplo, Matrigel), expuestas a agentes terapéuticos utilizados como monoterapia o en combinación. Este entorno nos permitió evaluar la eficacia de una combinación de dos fármacos con respecto a los únicos de manera competitiva y cuantificar su capacidad para atraer PBMC.
    1. Descongelar un stock de solución matricial (por ejemplo, Matrigel) colocándolo en hielo en una nevera a 4 °C un día antes del experimento.
      NOTA: No exponga el producto a múltiples ciclos de congelación-descongelación a medida que se vuelve "grumoso". Otros protocolos de hidrogeles sintéticos o naturales pueden ser adecuados para ser utilizados en este entorno. Consulte 33,34,35 para la preparación de células cancerosas en matrices de colágeno.
    2. Resuspender las células de melanoma humano A375, teñidas con PKH67 Green Fluorescent Cell Linker en solución de matriz compatible (2 mg mL-1). Cuando esté indicado, añadir 5-aza-2'-desoxicitidina (DAC; 2,5 μM), denominada DAC, y/o IFN-α2b, denominada IFN, a las dosis adecuadas32.
      NOTA: Haga coincidir el lote # en la hoja de especificaciones de la botella de matriz. Basado en la concentración, calcule el volumen de medio necesario para hacer hasta 2 mg mL-1 Ajuste la concentración óptima de proteína y la concentración de suspensión de células cancerosas de acuerdo con su aplicación de interés.
    3. Pipetear hacia arriba y hacia abajo con cuidado para evitar la generación de burbujas. Mantenga el tubo de microcentrífuga en hielo mientras lo mezcla para evitar cualquier polimerización no deseada.
    4. Después de la esterilización, coloque los dispositivos sobre hielo (usando un cubo de hielo y una tapa) para evitar la solidificación de la solución de matriz durante todo el procedimiento de carga celular.
    5. Inyecte lentamente las dos mezclas de IFN y DAC/IFN Matrigel/células tumorales (2-4 μL) en el puerto de gel izquierdo y derecho, respectivamente, con micropipeta de 10 μL utilizando puntas frías (Figura 5A). Aplique una presión suave para empujar la solución de matriz desde un lado hasta llegar al opuesto.
      NOTA: El volumen de la solución matricial se eligió para evitar el desbordamiento en canales adyacentes. No ejerza una presión de pipeteo excesiva para evitar que la solución se filtre en los medios y canales centrales. Si durante la carga se bloquea la ruta del gel a lo largo del canal, intente insertar la solución desde la otra entrada hasta que los frentes de gel se encuentren. Al retirar la micropipeta de las entradas, sostenga el émbolo, de lo contrario, la presión negativa aspirará la solución de la matriz.
    6. Colocar el dispositivo en una incubadora en posición vertical a 37 °C y 5% deCO2 durante 30 minutos para permitir la gelificación de la solución de matriz (Figura 5B). Maneje con cuidado los chips con gel no polimerizado incorporado para evitar que se escape del canal de gel.
    7. Mientras tanto, resuspenda las PBMC marcadas con PKH67 (1x106 células) en 10 μL de DMEM completo (medio de Eagle modificado de Dulbecco).
    8. Después de la gelificación de la matriz, llene los canales de los medios con (50-100 μL) la misma alícuota de medio de cultivo en los seis depósitos para evitar el secado del gel en las virutas. Mantener en la incubadora hasta la suspensión de la siembra de células inmunes.
      NOTA: Verifique bajo un microscopio la distribución correcta y homogénea de las células tumorales en el gel y la integridad de las barreras de gel polimerizadas. Las regiones gelificadas parcialmente o no uniformes o burbujas en la mezcla conducen al flujo prematuro de PBMC en los canales de medios de gel en el punto de inicio del experimento debido a las fluctuaciones iniciales de presión.
    9. Aspire los medios de los seis pocillos y coloque la punta cerca de la entrada de un canal de medios para inyectar suavemente con suspensión de células PBMC de presión moderada. La secuencia temporal de carga se representa en la Figura 5C:
      1. PBMC en medio de 10 μL en el pozo central superior.
      2. 50-100 μL de medio en cada uno de los cuatro pocillos de canales laterales.
      3. 40-90 μL de medio en el pozo central superior.
      4. 50-100 μL de medio en el pozo central inferior.
    10. Asegúrese bajo un microscopio de que la distribución de PBMC permanezca confinada en la cámara central después del paso de carga. (Figura 7A).
      NOTA: Si no es óptimo, ajuste la concentración si es necesario y repita los pasos de siembra, utilizando chips prístinos. Al calcular los volúmenes para las condiciones experimentales planificadas, refiérase a un número excesivo de fichas (15-20%) para tener en cuenta los posibles errores y ajustes. Los volúmenes y las concentraciones deben optimizarse de acuerdo con la aplicación específica.
    11. Coloque los dispositivos ensamblados en una superficie nivelada en la incubadora a 37 °C y 5% deCO2 para la posterior adquisición de imágenes de fluorescencia. Manejar con cuidado los chips después de cargar las células inmunes que están flotando.
      NOTA: Compense las pérdidas por evaporación de volúmenes en los reservorios reemplazando los medios cada 2-3 días. Para el perfil de quimiocinas, se pueden aspirar hasta 100 μL de cada uno de los dos pocillos de compartimentos de cultivo, consulte el paso 2.7, en el paso 1.
  2. Conteo automatizado de PBMC reclutados en imágenes fluorescentes de un solo canal en ImageJ
    NOTA: Los métodos clásicos de inmunofluorescencia para imágenes confocales de alta resolución se pueden aplicar a las operaciones en chip como mediciones de punto final. El procedimiento básico de tinción implica la fijación celular en chip, permeabilización, bloqueo, unión de anticuerpos, tinción de núcleos con pasos de lavado intermedios. Las células inmunes no marcadas infiltradas en regiones de geles 3D con microambientes cancerosos incrustados pueden fijarse en los puntos de tiempo deseados y teñirse para marcadores de expresión de activación/agotamiento/maduración (p. ej., para células CD8, monitorización de marcadores CD69, CD95, PD1, TIM3). En Parlato et al.35, la fagocitosis de las células apoptóticas SW620 se evaluó mediante microscopía confocal, utilizando dispositivos montados en cubreobjetos de 170 μm de espesor. Los IFN-DC se tiñeron agregando alícuotas antihumanas HLA-DR-FITC Ab anti-chip.
    Para calcular la extensión de las células inmunes vivas teñidas con fluorescencia infiltradas desafiadas con señales competitivas, se establece un flujo de trabajo de análisis de imágenes común de la siguiente manera (Figura 7D-G):
    1. Adquirir, en puntos finales específicos, contraste de fase y microfotografías de fluorescencia de canales rojo/verde de las regiones de gel izquierda y derecha que contienen células tumorales expuestas respectivamente a regímenes farmacológicos únicos o combinados de ellos.
      NOTA: Aquí las imágenes fueron capturadas por un microscopio de fluorescencia EVOS-FL después de la carga celular (0 h), después de 48 h y después de 72 h de incubación (Figura 7A-B). Se utilizó un aumento de 4x-10x para adquirir la cámara central, las matrices de microcanales y los dos canales laterales yuxtapuestos que contienen A375 más IFN y A375 más DAC / IFN.
      1. Al realizar operaciones de adquisición, tenga en cuenta los parámetros a medir y evitar la saturación de las características a contar. Los resultados óptimos de segmentación dependen de la naturaleza de las imágenes adquiridas, debido a la variabilidad en las propias muestras biológicas, la calidad de la tinción y las técnicas de microscopía utilizadas para aplicaciones orientadas al usuario.
    2. Cargue datos de fluorescencia de un solo canal (en este caso rojo = PBMC), en Fiji arrastrándolos a la ventana principal (Figura 7D). Duplique la imagen para evitar sobrescribir los datos sin procesar durante la selección de filtros de preprocesamiento hasta la segmentación final.
      1. Si la imagen es una imagen en color (RGB), presione Imagen > Tipo 8 o 16 bits para convertir a escala de grises. Compruebe que Editar > opciones >conversión esté configurado para escalar al realizar la conversión.
    3. Preprocesamiento de datos sin procesar a través de la limpieza de ruido y artefactos.
      1. Vaya al menú Procesar > Restar fondo aplicando el algoritmo de bola rodante para corregir el fondo de ruido desigual con grandes variaciones espaciales de intensidades. Establezca el radio en al menos el tamaño de la partícula de primer plano más grande. Elija el cuadro Vista previa para el procedimiento de prueba y error para obtener resultados óptimos. Los valores demasiado pequeños pueden eliminar incorrectamente las estructuras de interés.
      2. En el comando Brillo y contraste, arrastre los controles deslizantes Mínimo/Máximo para cambiar el rango de intensidades en el histograma. Desplace el control deslizante Máximo hacia la izquierda para aumentar el brillo, sin funciones de lavado. Mueva la diapositiva Mínimo hacia la derecha para aumentar el contraste de la imagen evitando la desaparición de entidades menos visibles en el fondo. Haga clic en Aplicar para corregir los cambios.
    4. Mejora de imagen.
      1. Vaya a Procesar filtros > y experimente con los filtros gaussianos medianos en las imágenes (Figura 7E).
        NOTA: El radio de prefiltrado debe adaptarse a los píxeles de ruido de la imagen. El filtro mediano no lineal reemplaza el valor de píxel con el valor mediano de los vecinos, para reducir el ruido de sal y pimienta. El "desenfoque gaussiano" se utiliza para suavizar una imagen digital, reemplazando los píxeles con un promedio ponderado de píxeles circundantes. Los pesos provienen de la distribución de probabilidad gaussiana, por lo que los píxeles más cercanos son más influyentes.
      2. Vaya opcionalmente a Procesar > Math > Gamma con la casilla Vista previa marcada para aumentar el contraste.
        NOTA: Las intensidades establecidas en el panel B&C se escalan entre los límites de dos mínimos y máximos. Los valores < 1.0 acentúan las diferencias entre intensidades bajas, mientras que los valores > 1.0 acentúan las diferencias entre intensidades altas. La corrección gamma es funcional para encontrar un rango de visualización, mostrando los objetos más tenues sin saturar los más brillantes.
    5. Creación de una máscara de imagen binaria.
      1. Vaya a Imagen > ajustar > umbral. El método más sencillo para determinar los umbrales se basa en el análisis histográfico de los niveles de intensidad, como se muestra en la Figura 7F. En el menú desplegable, juega con diferentes métodos de umbrales globales (en nuestro caso, se aplica Otsu).
      2. Desplácese manualmente o escriba un rango conocido de intensidades de píxeles en los paneles del histograma, observe el cambio del patrón rojo que se superpone a la imagen que se asemeja principalmente al área de celda real. El botón Restablecer quita la superposición. Una vez satisfecho, haga clic en Aplicar para generar una versión binaria de la imagen. Marque Proceso > Opciones de > binario para controlar cómo se muestran las imágenes con umbrales y cómo el analizador de partículas identifica los objetos.
    6. Utilice el comando de menú Proceso/Binario/Partículas de cuenca para dividir parcialmente superpuestas o fusionadas durante el umbral. Watershed a menudo puede cortarlos con precisión agregando una línea de espesor de 1 píxel. Realice operaciones morfológicas como operaciones de dilatación o erosión para crecer o eliminar píxeles de píxeles subsaturados o sobresaturados.
      NOTA: Para obtener más información, consulte la sección Comandos de menú o consulte MorphoLibJ, una biblioteca integrada basada en morfología matemática para procesar datos binarios.
    7. Descripción cuantitativa de la característica de imagen.
      1. Una vez obtenido el reconocimiento satisfactorio de objetos, abra el Analizador de partículas desde Analizar > Analizar partículas. Las partículas pueden excluirse por su tamaño y circularidad, expresadas en píxeles o en una unidad de medida calibrada (compruebe la escala correcta en relación con los ajustes del microscopio en Propiedades de la > de imagen). Para incluir todo, mantenga el valor predeterminado de 0-Infinito y el rango predeterminado de circularidad en 0.00 - 1.00 (0 = línea recta, 1 = círculo perfecto).
      2. Para filtrar pequeños píxeles de "ruido" o características que no interesan, establezca el rango mínimo y máximo. Marque las opciones Incluir agujeros, Mostrar, Contorno y Mostrar resultados en el campo de la ventana. Excluir en bordes descartará las partículas detectadas en los bordes de la imagen. Agregar al administrador agrega la selección obtenida al administrador de ROI para un análisis posterior manteniendo la información de posición de la partícula.
        NOTA: En el "ROI Manager", es posible corregir la segmentación automática de la salida registrada (fusionar celdas divididas, dividir celdas combinadas). Seleccione, mediante el uso de herramientas de selección en la barra de herramientas de Fiji, ROI dentro de ambas regiones de gel donde se incrustan las células cancerosas para estimar la infiltración inmune.
    8. Exporte los valores obtenidos a una hoja de cálculo para realizar un análisis estadístico como se muestra en la Figura 7G. "Resultados" enumera una tabla de datos relativa a las propiedades de partículas numeradas identificadas. "Resumir" abre una ventana con el nombre de la imagen, los recuentos totales y otra información para toda la imagen.
      1. Vaya a Analizar > establecer medidas para incluir una amplia gama de parámetros.
    9. Grabe opcionalmente una macro (seleccionando Plugins > Macros > Record) para automatizar el flujo de trabajo de procesamiento y ahorrar tiempo en el análisis de grandes conjuntos de datos.
      1. Usar la misma rutina de procesamiento para analizar el canal de fluorescencia verde en las mismas regiones para analizar los cambios morfológicos de las células tumorales en regiones 3D16

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Resultados

La infiltración inmune tumoral es un parámetro de la respuesta antitumoral del huésped. Los tumores son heterogéneos en la composición, densidad, ubicación y estado funcional de los leucocitos infiltrantes, cuyas interacciones con las células cancerosas pueden ser la base de información clínicamente relevante para predecir el curso de la enfermedad y la respuesta a la terapia. En este sentido, las tecnologías microfluídicas podrían utilizarse como herramientas in vitro complementarias y privilegiadas para explorar la tex...

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Discusión

Los métodos descritos tratan de diseñar un enfoque general para recapitular, con grado modulable de complejidad, dos aspectos significativos en el campo de la oncoinmunología, que pueden beneficiarse de la adopción de modelos in vitro más relevantes. El primero involucra el lado de la población de células tumorales, donde abordar las características de una sola célula puede conducir a una mejor descripción de la heterogeneidad y la importancia biológica y clínica correlacionada, incluida la resistencia a la terapia, la p...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar. AS cuenta con el apoyo de la Fondazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC, Start-Up 2016 #18418) y Ministero Italiano della Salute (RF_GR-2013-02357273). GS y FM cuentan con el apoyo de la Asociación Italiana para la Investigación del Cáncer (AIRC) no. 21366 a G.S.).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
cultivo celular fuertes 
50 mL tubosCorning-Sigma Aldrich, St. Louis, MOCLS430828tubos de centrífuga
5-aza-2'-desoxicitidina DACMillipore-Sigma; St. Louis, MOA3656Agente hipometilante de ADN
Placas de 6 pocillosCorning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO Placas decultivode CLS3506
matraztratado con cultivo celular de 75 cm2Corning, Nueva York, NY430641Umatraces de cultivo
A365MAmerican Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VAbr/> CVCL_B222línea celular de melanoma humano
Clorhidrato de doxorrubicinaMillipore-Sigma; St. Louis, MOD1515antibiótico de antraciclina 
Dulbecco's Modified Eagle Medium DMEMEuroClone Spa, Milán, ItaliaECM0728LMedio de cultivo para células SK-MEL-28 
Tampón de fosfato de Dulbecco solución salina sin calcio sinEuroClone Spa, Milán, ItaliaECB4004Lsolución tampón salina
Suero fetal bovinoEuroClone Spa, Milán, ItaliaECS0180Lauxiliar para el cultivo celular
FicollGE-Heathcare17-1440-02separación de células mononucleares de sangre humana.
hemocitómetroNeubauerContador
de células Viales heparinizadosThermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MAViales para la extracción de sangre venosa
interferón alfa-2bMillipore-Sigma; St. Louis, MOSRP4595citoquina humana recombinante
L-Glutamina 100XEuroClone Spa, Milán, ItaliaECB3000Dauxiliar para el cultivo celular
Nitrógeno
Medios de separación de células linfolíticasCedarlane Labs, Burlington, CanadáSeparación de linfocitos por centrifugación en gradiente de densidad
LymphoprepAxis-Shield PoC AS, Oslo, Noruega
MatrigelCorning, Nueva York, NY354230factor de crecimiento matriz de membrana basal reducida
MDA-MB-231 Colección de Cultura Tipo Americana (ATCC), Manassas, VA  Línea celular decáncer de mama humano
Penicilina / Estreptomicina 100X    EuroClone Spa, Milán, ItaliaECB3001Dauxiliar para el cultivo celular
Auxiliar de pipetaDrummond Scientific Co., Broomall, PA4-000-201Manejo de líquidos
PKH26 Rojo Enlazador de células fluorescentesMillipore-Sigma; St. Louis, MOPKH26GLcolorante de células fluorescentes rojas
PKH67 Enlazador de células fluorescentes verdesMillipore-Sigma; St. Louis, MOPKH67GLcolorante de células fluorescentes verdes
RPMI-1640EuroClone Spa, Milán, ItaliaECM2001Lcélulas MDA-MB-231
(2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL)Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MOCLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489; CLS4490
Puntas estériles para la manipulación de líquidos (1-10 μ L, 10-20 μ L, 20-200 μ L, 1000 μ L)EuroClone Spa, Milán, ItaliaECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005consejos para la micropipeta
Temporizador Solución
de Trypan BlueThermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA15250061tinción celular para evaluar la viabilidad celular
TripsinaEuroClone Spa, Milán, ItaliaECM0920Dreactivo de disociación para células adherentes
cultivo celular fuerte Microscopio de fluorescencia strong>EVOS-FL Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA Microscopio fluorescente para células vivas Incubadora de
Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA311 Forma COIncubador de calor directo; TC 230Incubación de cultivos celulares a 37 ° C, 5% CO2
Juli MicroscopioNanoentek
Refrigerador de laboratorio (4 & grados; C)de laboratorio FDM
(Clase II)Steril VBH 72 MPCampana de flujo laminar
Microscopio ópticoZeiss
Centrífuga refrigerableBeckman Coulter
Baño
Materiales de microfabricación 
3-aminopropil)trietoxisilano (Aptes)Sigma AldrichA3648agente silanizante para la unión de PDMS a cubreobjetos de plástico
Máscaras de cuarzo cromo / 4"x4", HRC / No AZ MB W& A,  Alemaniamáscaras ópticas para fotolitografía
Cubreobjetos de vidrio, D 263 M Schott glass,  (170 ± 5 µ m)Ibidi, Alemania10812
Solución de peróxido de hidrógeno 30%Carlo Erba Reactivos412081reactivos para solución de piraña
Metil isobutil cetonaCarlo Erba Reactivos461945PMMA E-beam resistente
Revelador Microscopio Portaobjetos de vidrio (Paquete de 50 portaobjetos) 76,2 mm x 25,4 mm Sail Brand7101sustratos para pegar virutas
Miltex Punzón de biopsia con émbolo, ID 1.0mmPunzones de biopsia dérmica Tedpella
PMMA  950 kDaAllresist,AlemaniaAR-P. 679.04Resistencias electrónicas positivas para el modelado de máscaras ópticas
Cubreobjetos de polímero sin tratarIbidi, Alemania10813sustratos para pegar virutas
Oblea Prime CZ-Si,  4", (100), Dopado con boroGambetti Xenologia Srl, Italia30255
Propan-2-olReactivos Carlo Erba415238
Acetato de éter monometílico de propilenglicol (PGMEA)Sigma Aldrich484431-4LSU-8 resiste al revelador
SU-8 3005Tecnología Micro Resist, AlemaniaC1.02.003-0001Negativo Fotorresistencias
SU-8 3050Tecnología Micro Resist, AlemaniaC1.02.003-0005Fotorresistencias Negativas
Suite de Biopunch, ID 4.0 mm, 6.0 mm, 8.0 mmTedpella15111-40, 15111-60, 15111-80Punzones de biopsia dérmica para depósitos de virutas
Ácido sulfúrico 96%Carlo Erba Reactivos410381reactivos para solución de piraña
SYLGARD 184 Kit de elastómero de siliconaDowsil, Dow Corning11-3184-01Elastómero de silicona (PDMS)
Trimetilclorosilano (TMCS)Sigma Aldrich92360-100MLagente de silanización para maestros
Equipo de microfabricación
100 kV Litografía de haz electrónicoRaith-Vistec EBPG 5HR
Sistema de litografía ópticaEV-420 Enmascarador-alineador
Sistema de grabado iónico reactivoSistema Oxford plasmalab 80 plus
Desecador
< magnesio líquidoHTB-26 Medio de cultivo para pipetas serológicas de cultivo celular humificado Cabina de seguridad termostático para depósitos de virutas con patrón SU-8 Placa calefactora de doble cara de vacío

Referencias

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