Imágenes y análisis de fluorescencia resueltos en el tiempo de la invasión de células cancerosas en el modelo esferoide 3D

Durante la progresión del cáncer, las células cancerosas pueden adquirir un fenotipo motil e invasivo, lo que les permite escapar de la masa tumoral e invadir los tejidos circundantes^1. Con el tiempo, estas células cancerosas invasivas pueden alcanzar y crecer dentro de órganos secundarios, un proceso llamado metástasis del cáncer^1. La metástasis causa más del 90% de las muertes relacionadas con el cáncer^2. Una de las razones de esto es que, si bien los tumores localizados son clínicamente manejables, no existen métodos eficientes para la eliminación de las células cancerosas invasivas una vez que se ha producido la propagación metastásica. Por lo tanto, la aparición de células cancerosas invasivas y la transición de una enfermedad localizada a una enfermedad invasiva está planteando un gran desafío clínico. Determinar cómo las células cancerosas inician y sostienen un comportamiento invasivo puede conducir al desarrollo de nuevas terapias potentes.

El modelo esferoide 3D es una plataforma ideal para investigar el comportamiento motil de las células cancerosas bajo control, pero condiciones fisiológicamente relevantes^3. De hecho, en este ensayo, los esferoides de las células cancerosas están incrustados dentro de la matriz extracelular (ECM), por ejemplo el colágeno I, que imita un tumor simplificado. A continuación, las imágenes se utilizan para visualizar la invasión de las células cancerosas del esferoide a la matriz del colágeno. Sin embargo, varios desafíos limitan este procedimiento.

El primer desafío se produce en el paso de incrustación, donde la matriz de colágeno líquido puede extenderse a través de la superficie del plato, haciendo que el esferoide toque la parte inferior del plato. En consecuencia, las células del esferoide se propagan en la superficie bidimensional (2D), rompiendo la morfología esferoide tridimensional (3D). Aumentar el volumen de colágeno es una solución eficiente, pero costosa. Para evitar que las células se propaguen en la superficie 2D, manteniendo un volumen mínimo de colágeno, desarrollamos un dispositivo de imágenes esferoides (SID) delimitando un inserto de polidimetilesiloxano (PDMS) de 1 mm de espesor y 3 agujeros en un plato inferior de vidrio.

El segundo desafío del ensayo esferoide es el etiquetado de las células cancerosas en esferoides, que está limitado por la mala penetración de anticuerpos y colorantes fluorescentes, un efecto que aumenta con el tamaño del esferoide. Si bien la solución ideal para etiquetar células es el establecimiento de líneas celulares que expresan permanentemente proteínas fluorescentes, esta opción se limita principalmente a líneas celulares inmortalizadas y está limitada por la disponibilidad de quimeras de proteína fluorescente. Aquí, describimos un protocolo optimizado para la tinción de inmunofluorescencia de esferoides fijos, así como el uso eficiente de un tinte citoplasmático para etiquetar las células inmediatamente antes de incrustar el esferoide.

El tercer desafío del ensayo esferoide es la falta de macros simples de Fiji para la cuantificación semiautomática de la invasión celular con el tiempo. Para abordar este desafío, describimos una metodología sencilla para analizar el área esferoide a lo largo del tiempo. Ilustramos las ventajas de este protocolo utilizando las líneas celulares 4T1 y 67NR como ejemplos.

1. Fabricación de un dispositivo de imágenes esferoides (SID) para optimizar la incrustación esferoide (duración 1 día)

1. Cree el espaciador utilizando una impresora 3D(Figura 1A, B y Archivo Complementario 1).
2. Pesar una relación de 10:1 (wt/wt) de polímero base: reticulador cruzado en una taza de plástico [por ejemplo, 20 g de polímero base etilbenzene y 2 g de reticulador de resina de silicona para crear polidimetillsiloxano (PDMS)].
3. Mezcle a fondo la solución PDMS en la taza de plástico con una pipeta desechable.
4. Coloque la taza de plástico en una cámara de vacío para eliminar las burbujas de aire de la mezcla. Libere rápidamente la presión de vacío para eliminar la pequeña cantidad de aire atrapado en la superficie de la mezcla y disipar las burbujas de aire restantes.
5. Incubar el espaciador impreso en 3D a 100 °C durante 5 minutos para aumentar su flexibilidad.
6. Limpie bien las dos placas de vidrio que se utilizarán para construir el molde PDMS limpiándolas con 100% isopropanol. Si las placas de vidrio se utilizaron previamente para lanzar PDMS, asegúrese de eliminar cualquier PDMS viejo restante raspando suavemente las placas de vidrio con una cuchilla de afeitar y limpiándolas con 100% isopropanol.
7. Construya el molde colocando el espaciador impreso en 3D entre las dos placas de vidrio limpias.
8. Selle el molde utilizando clips de aglutinante grandes en los bordes exteriores de las placas de vidrio. Coloque dos clips de aglutinante en el borde inferior y uno en la esquina superior.
9. Inspeccione la parte superior del molde para asegurarse de que el espaciador esté al ras con las placas de vidrio. Esto garantiza que no habrá deformaciones y que se creará una hoja uniforme de PDMS.
   NOTA: Si la hoja resultante no tiene un grosor uniforme, los clips deben ajustarse ligeramente.
10. Corte la punta de una pipeta desechable (~ 2 cm de la punta) y agregue la mezcla PDMS a una velocidad lenta y constante a la esquina superior izquierda del molde. Vierta la mezcla lentamente para evitar la creación de grandes bolsas de aire.
11. Coloque el molde en una cámara de vacío para eliminar las burbujas de aire que se formaron durante el vertido.
12. Cure el PDMS incubando el molde a 100 °C durante 1 h.
13. Recuperar el molde de la incubadora y dejar que se enfríe para tocar.
14. Retire los clips del aglutinante y las placas de vidrio del espaciador que contiene el PDMS curado.
15. Utilice una cuchilla de afeitar para cortar a través del sello que se creó en los cuatro lados del molde entre el espaciador y la placa de vidrio. Con los cuatro lados cortados, comience a separar el molde para revelar la hoja PDMS en el espaciador.
16. Pelar cuidadosamente la nueva hoja PDMS del espaciador usando pinzas.
17. En una alfombra de corte, perforar discos PDMS de 17,5 mm de diámetro de la hoja, y luego perforar tres agujeros distribuidos uniformemente de 5,5 mm de diámetro, utilizando punzones de biopsia de diferentes tamaños. Aquí estos discos PDMS de 3 agujeros se conocen como "inserciones" (Figura 1C).
    NOTA: Los cortes no uniformes realizados en el PDMS, o un enlace defectuoso a través de tratamiento plasmático, pueden resultar en las fugas futuras.
18. Limpie cada plaquita eliminando suavemente las partículas de polvo mediante cinta adhesiva.
19. Pegue los insertos en un trozo de cinta a doble cara y envuelva la cinta alrededor de la tapa de una placa Petri de 10 cm.
20. Coloque la tapa de la placa Petri en la máquina de plasma, junto con los platos abiertos de 35 mm de fondo de vidrio.
21. Active la superficie de las plaquitas y del vidrio mediante tratamiento plasmático durante 1 min a 300 mTorr. Se puede utilizar una varita de plasma portátil.
22. Usando pinzas, conecte rápidamente la ventaja, es decir, lado tratado, de una plaquita(Figura 1D)a la parte de vidrio de un plato inferior de vidrio (Figura 1E). Repita para todos los platos.
23. Utilice el dedo y el pulgar del puntero para aplicar una presión uniforme mientras gira el plato inferior de vidrio. Esto garantizará una fijación estable de la plaquita en el plato inferior de vidrio.
24. Incubar los SID(Figura 1F)a 60 °C durante 20 min para fortalecer la adherencia entre el vidrio y pdms.
25. Realice una segunda ronda de tratamiento plasmático en los SID, utilizando los mismos ajustes que en el paso 1.21 o con la varita de mano. Esto hará que la superficie PDMS libre se adhiera a la poli-L-lisina en la solución de recubrimiento (véase 1.26).
26. Prepare las siguientes soluciones.
    1. Solución de recubrimiento: 1x PBS que contiene 0.01% (vol/vol) poli-L-lisina [por ejemplo, añadir 10 μL de 0.1% (vol/vol) poli-L-lisina a 90 μL de 1x PBS].
    2. Solución de enlace cruzado: Agua destilada que contiene 1x (vol/vol) glutaraldehído [por ejemplo, añadir 10 μL de glutaraldehído 10x a 90 μL de agua destilada].
    3. Solución de almacenamiento: 1x PBS que contiene 10x (vol/vol) Penicilina-Streptomicina [por ejemplo, añadir 1 mL de 100x Penicilina-Estreptomicina a 9 ml de 1x PBS].
27. Añadir 35 μL de solución de recubrimiento por cada orificio e incubar durante 1 h a temperatura ambiente.
28. Aspirar el poli-L-lisina y enjuagar todo el SID 3 veces con agua destilada.
29. Añadir 35 μL de solución de reticulación por cada orificio incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.
30. Aspirar la solución de enlace cruzado y enjuagar todo el SID 3 veces con agua destilada.
31. Agregue un 70% de etanol en cada SID y colóquelo bajo luz ultravioleta (UV) durante 30 minutos.
32. Bajo el capó, aspirar etanol y enjuagar el SID 3 veces con agua destilada.
33. Agregue 2,5 ml de solución de almacenamiento por cada SID.
    NOTA: En esta etapa, los SIDs se pueden almacenar a 4 °C durante una semana. Se observó que la fuerza de unión entre PDMS y vidrio disminuye con el tiempo. Más allá de una semana, se recomienda a los usuarios que prueben los SID para detectar posibles fugas antes de su uso. Para ello, aspire la solución de almacenamiento y agregue 35 μL de 1x PBS en cada orificio. Después de su uso, las plaquitas PDMS se pueden pelar de los platos inferiores de vidrio. Para lograr una limpieza óptima de los platos de fondo de vidrio, se deben utilizar varios lavados con isopropanol y ácido clorhídrico para eliminar los residuos de PDMS.

2. Formación de esferoides e incrustación en colágeno (Duración 4 días)

NOTA: Para imágenes en vivo de esferoides, longitudinalmente o en videos de lapso de tiempo, utilice una línea celular que exprese una proteína fluorescente citoplasmática y/o nuclear. Si dicha línea celular está disponible, siga los pasos descritos en esta sección. Alternativamente, en la sección 3, se propone un protocolo para etiquetar las células cancerosas en esferoides usando un tinte citoplasmático.

1. Formar esferoides de células 4T1 y/o 67NR utilizando la técnica de caída colgante, como se describió anteriormente^4,5,6,7, con 3.000 células/ 40 μL gota y un tiempo de incubación de 3 días. Añadir la solución bovino atelocollagen I por último y mantener todas las soluciones sobre hielo, en todo momento.
2. Identifique los esferoides formados correctamente utilizando un microscopio de campo brillante.
3. Llene un tubo cónico de 15 ml con 8 ml de medio completo precalentado.
4. Recoge esferoides con una pipeta P1000 y transfiéralo al tubo cónico de 15 ml. Moje la punta de la pipeta canalizando un poco de medio completo dentro y fuera para evitar que los esferoides se peguen a las paredes interiores de la punta de la pipeta y limite la pérdida de esferoides.
5. Permita que los esferoides se hundan en la parte inferior del tubo y lave cuidadosamente los esferoides intercambiando el medio. Repita dos veces.
6. Preparar una solución de colágeno I de 5 mg/ml de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (procedimiento alternativo de gelificación, ver cálculo ejemplar a continuación). Reemplace el agua destilada por un medio completo. Al calcular el volumen de medio a utilizar, tenga en cuenta que los esferoides se añadirán en 20 μL de medio completo [por ejemplo, para un SID, 3 x 30 + (3 x 30) x 20 % = se necesita 108 μL de colágeno de 5 mg/ml (preparar un 20 % adicional para tener en cuenta la pérdida de pipeteo al manipular fluidos viscosos); 22 μL de medio completo + 10,8 μL de 10x PBS + 1,2 μL de 1 M NaOH + 54 μL de 10 mg/mL de colágeno I stock].
7. Recoger todos los esferoides en 20 μL de medio, utilizando una pipeta P200, y añadirlos a la solución de colágeno I preparado en el paso 2.6.
8. Mezcle lentamente la solución pipeteando hacia arriba y hacia abajo para evitar la heterogeneidad en la concentración de colágeno I, limitando la formación de burbujas. Mantenga la solución en hielo.
9. Retire la solución de almacenamiento de los SID y lave 3 veces con 3 ml de 1x PBS. Después del lavado final, deje los SID(s) secos para no diluir la solución de colágeno I.
10. Inicie un temporizador y dispense 30 μL de la solución de colágeno I que contiene un esferoide en uno de los tres agujeros del SID. Asegúrese visualmente de que un solo esferoide esté contenido en los 30 μL.
11. Repita el paso 2.10 dos veces más para llenar todos los 3 agujeros de un SID.
12. Utilice una punta de pipeta de 10 μL para volver a centrar el esferoide si se encuentra cerca del borde PDMS. Si dos o tres esferoides terminan dispensados en uno de los agujeros, se puede utilizar la misma punta de pipeta para separar los esferoides entre sí. Detengan el temporizador.
    NOTA: Con frecuencia invertir el SID al revés y al revés, durante todo el período de polimerización y solidificación del colágeno I, garantiza que el esferoide se coloca en el centro vertical de la capa ECM y evita la invasión de células en 2D. Se debe maximizar la frecuencia de inversión (volteo). Dado que la frecuencia de volteo está controlada por el esferoide "tiempo de dispensación" medido en 2.10-2.12, el tiempo de dispensación debe minimizarse. En nuestro laboratorio, el tiempo de dispensación es de 2 minutos en promedio.
13. Para centrar verticalmente el esferoide en la capa de colágeno, voltee el SID boca abajo e incuba a 37 °C para dispensar el tiempo.
14. Voltea el SID al revés e incuba a 37 °C para el tiempo de dispensación.
    NOTA: El tiempo que los esferoides pasan en la orientación al revés debe ser igual al tiempo que pasan en la orientación al alza.
15. Repita los pasos 2.13 y 2.14 durante 30 min, hasta que el colágeno I polimerice.
16. Añadir 2,5 ml de media/SID completa y, si es necesario, adquirir una imagen de los esferoides para el punto de tiempo inicial.
17. Repita los pasos 2.10-2.16 si se utilizan varios SID.

3. Etiquetado de fluorescencia de esferoides

1. Imágenes en vivo (duración 6-7 días)
   NOTA: Si hay disponible una línea celular que expresa una proteína fluorescente citoplasmática y/o nuclear, siga los pasos descritos en la sección 2. Alternativamente, para el etiquetado citoplasmático, se propone el siguiente protocolo.
   1. Siga los pasos 2.1-2.5 del protocolo descrito en la sección 2.
   2. Diluir el tinte citoplasmático a 25 μM en 200 μL de medio libre de suero.
      NOTA: Mientras que un tinte citoplasmático rojo se utiliza en este experimento, cualquier otro color disponible debe ser adecuado. Las células cancerosas fueron etiquetadas dentro de esferoides utilizando colorantes nucleares diluidos a 20 μM en 200 μL de medio libre de suero (ver Tabla de Materiales).
   3. Después del lavado final, resuspend esferoides en la solución de tinte citoplasmático o nuclear e incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos, protegidos de la luz.
      NOTA: Con este enfoque, el etiquetado de las células en el centro esferoide no será eficiente. Para lograr el etiquetado de todas las células, la incubación se puede extender durante la noche, colocando el plato en un balancín. Las alternativas se describen en Discusión.
   4. Lave los esferoides 3 veces en un medio completo.
   5. Proceda a los pasos 2.6-2.17 del protocolo descrito en la sección 2.
   6. Esferoides de imagen a través de imágenes de lapso de tiempo cada 10 minutos durante 24-72 h(Figura 2),o a través de imágenes longitudinales, diariamente, durante un período de hasta 7 días(Figura 3). Utilice un microscopio confocal de escaneo láser, un objetivo de aire de 10x (apertura numérica de 0,4 y una distancia de trabajo de 3,1 mm), 1024 x 1024 píxeles, tiempo de exposición de 8 μs/píxel, agujero pinhole de 90 μm, 6 x 15 μm z-pasos y 3 campos de visión cada uno que contenga un esferoide.
      NOTA: Para imágenes de lapso de tiempo, utilice una potencia láser mínima y equipe el microscopio con una cámara ambiental con control de temperatura, humedad y gas. Cultaliza los esferoides incrustados a 37 °C durante > 8 h o durante la noche antes de la toma de imágenes para minimizar el tiempo en el microscopio.
2. Tinción de inmunofluorescencia de esferoides (Duración 2 días)
   NOTA: El procedimiento descrito aquí está adaptado y optimizado de los protocolos publicados previamente^8,9. Este método se puede utilizar después del protocolo descrito en las secciones 2 y 3.1.
   1. Prepare las siguientes soluciones.
      1. Solución de fijación: 1x PBS que contiene 4% PFA (vol/vol) [por ejemplo, añadir 5 mL de 16% (vol/vol) PFA a 15 mL de 1x PBS].
      2. Solución de fijación y permeabilización: 1x PBS que contiene 4% PFA (vol/vol) y 0,5% Tritón X-100 (vol/vol) [por ejemplo, añadir 50 μL de Tritón X-100 a 10 mL de solución de fijación].
      3. Solución de bloqueo: 1x PBS que contiene 1% FBS (vol/vol) y 1% BSA (wt/vol) [por ejemplo, disolver 100 mg de BSA en 10 ml de 1x PBS, luego añadir 100 μL de FBS].
      4. Solución de lavado: 1x PBS que contiene 0.05% Tween 20 (vol/vol) [por ejemplo, añadir 25 μL de Tween 20 a 50 mL de 1x PBS].
   2. Retire el medio de cultivo de los SID(s) y lave una vez con PBS caliente 1x.
   3. Añadir 2 ml de solución de fijación y permeabilización por SID e incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
   4. Retire la solución de fijación y permeabilización y agregue 2 ml de solución de fijación por SID e incubar a temperatura ambiente durante 20 min.
   5. Lávese 3 veces con la solución de lavado.
   6. Añadir 2 ml de solución de bloqueo por SID e incubar a 4 °C durante 24 h con sacudida leve.
      NOTA: A este paso, las muestras se pueden incubar a 4 °C, durante el fin de semana. Tenga en cuenta que un tiempo de bloqueo más largo podría interferir con el procedimiento de etiquetado de inmunofluorescencia.
   7. Diluir anticuerpos primarios en la solución de bloqueo.
   8. Añadir 150 μL de solución de bloqueo con anticuerpos/pozos primarios en una placa de 48 pozos.
   9. Usando pinzas finas, separa cuidadosamente el tapón de colágeno que contiene un esferoide y transfiéralo a un pozo. Repita si se etiquetan varios esferoides. Limpie cualquier líquido que pueda permanecer en las pinzas cuando trabaje con diferentes anticuerpos, para evitar la contaminación.
   10. Incuba durante la noche a 4 °C con temblores leves.
   11. Añadir 300 μL de solución de lavado a pozos vacíos y llenos.
   12. Transfiera cuidadosamente el tapón de colágeno que contiene un esferoide en un pozo de "lavado".
   13. Lave 3 veces con solución de lavado durante 2 h, a temperatura ambiente y con temblores leves.
       NOTA: Transferir los tapones de colágeno I que contienen un esferoide, en lugar de aspirar las soluciones, puede ayudar a reducir la pérdida de muestras y el daño de la muestra.
   14. Diluir anticuerpos secundarios, 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) y/o faloidina en solución de bloqueo.
   15. Añadir 150 μL de solución de bloqueo con anticuerpos secundarios, DAPI y/o fhalloidina por pozo.
   16. Usando pinzas, transfiera cuidadosamente el tapón de colágeno que contiene los esferoides en el pozo. Repita si se etiquetan varios esferoides.
   17. Incubar a temperatura ambiente durante 1 h con temblores leves.
   18. Repita los pasos 3.2.11 y 3.2.12.
   19. Lave 3 veces con solución de lavado durante 30 minutos, a temperatura ambiente con temblores leves.
   20. Con una cuchilla de afeitar, corte una plaquita PDMS de 3 orificio en tres partes para que cada pieza contenga un orificio.
   21. Coloque dos piezas de PDMS en una diapositiva de microscopio.
   22. Añada una gota de solución de montaje utilizando una punta P200 con el extremo cortado. Evite la formación de burbujas.
   23. Transfiere cuidadosamente un colágeno que conecto a cada agujero.
       NOTA: Si el esferoide se colocó en la parte superior del tapón de colágeno, invierta el tapón de colágeno para que el esferoide termine más cerca de la cubierta de vidrio.
   24. Coloque un clip en la parte superior y selle con cinta adhesiva.
   25. Deje que la muestra se seque a temperatura ambiente durante 10 minutos, protegida de la luz.
   26. Almacene muestras a 4 °C, protegidas de la luz hasta que se tomaron imágenes.

4. Procesamiento de imágenes para analizar la invasión del cáncer con el tiempo

NOTA: El formato necesario para esta macro es una imagen x,y,t de un solo canal guardada como un archivo .tiff.

1. Si se adquirieron varios sectores z(es decir, x,y,z,t image), abra la imagen en Fiji y seleccione Image | Pilas | Proyecto Z. Se recomienda utilizar la opción Intensidad máxima. Como alternativa, se puede usar un único sector z para ejecutar la macro. Guarde la imagen como un archivo .tiff.
2. Cree una carpeta "Procesamiento" independiente en el escritorio.
3. Seleccionar archivo | Guardar como | Secuencia de imágenes. Utilice el formato TIFF, actualice el número de dígitos según el número de fotogramas, marque la casilla para utilizar la etiqueta de sector como nombre de archivo y seleccione Aceptar. Seleccione la carpeta "Procesamiento" creada en el paso 2.
4. Abra una imagen desde la carpeta "Procesamiento". Debe ser una imagen x,y, correspondiente a un único punto de tiempo.
5. Seleccione | de imagen Ajustar | Umbral automático. En el menú desplegable, seleccione el método Probar todo y marque la casilla de objetos blancos sobre fondo negro.
6. Aparece una imagen de montaje que muestra el resultado de cada método de umbral automatizado.
7. Identifique el mejor método de umbral automatizado, por ejemplo RenyIEntropy.
8. Para confirmar la elección del método de umbral automatizado, abra cualquier otra imagen desde la carpeta "Procesamiento" y pruebe el método de umbral elegido utilizando Image | Ajustar | Umbral automático.
9. Cierre todas las imágenes.
10. Descargue la macro SpheroidAreaTime(Archivo complementario 2).
11. Abra la macro de Fiji arrastrando y colocando.
12. En la línea 58, actualice el método de umbral automatizado según sea necesario.
13. En la línea 62, actualice el rango de tamaño según las dimensiones de la celda.
14. Seleccione Ejecutar.
15. Seleccione la carpeta "Procesamiento" y escriba "Procesamiento" como carpeta Principal y, a continuación, seleccione Aceptar.
16. Una vez que la ejecución haya terminado, guarde la tabla "Resumen". La primera columna indica el nombre de la imagen; la tercera columna indica el área esferoide; las columnas sexta, séptima y ocho especifican los parámetros de una elipse instalada en el esferoide.
17. La carpeta "Procesamiento" ahora contiene una imagen procesada para cada punto de tiempo, con la extensión _SpheroidArea.
    NOTA: Si el centro esferoide es tenue, llénelo con blanco utilizando las herramientas de selección, para todos los puntos de tiempo, y luego continúe con el paso 3. Del mismo modo, el espacio alrededor del esferoide se puede llenar de negro para "limpiar" la imagen. Si la imagen está limpia, comente la línea 61 para acelerar la ejecución.

Debido a su biocompatibilidad, PDMS es ampliamente utilizado para la microfabricación de pozos de confinamiento, sellos y moldes, que revolucionaron los dispositivos micropatternantes y microfluídicos. En el método descrito aquí, se utiliza para crear SIDs, pozos personalizables que optimizan el procedimiento de incrustación e imágenes esferoides. La Figura 1 ilustra los componentes principales utilizados en la fabricación de los SID. Para fundar el molde PDMS, un espaciador de 1 mm de espesor está impreso en 3D(Figura 1A,B),colocado entre las dos placas de vidrio, selladas con clips grandes. Verter y hornear PDMS en el espacio entre las placas forma una hoja de 1 mm de espesor de PDMS. El esquema SID (Figura 1C) indica las dimensiones del dispositivo óptimo, sin embargo, se produce una ligera variación en las distancias de taladro, debido al punzonado manual de agujeros utilizando punzonados de biopsia (Figura 1D). La Figura 1D,F indica cortes circulares limpios con agujeros espaciados uniformemente dentro de la plaquita PDMS.

El uso de los SID facilita la incrustación eficiente, y por lo tanto el registro de la invasión de células cancerosas dentro del colágeno I utilizando time-lapse (Figura 2, Video 1) o imágenes longitudinales (Figura 3). A pesar de utilizar las mismas frecuencias de inversión para todos los SID durante la polimerización del colágeno I, las posiciones esferoides dentro del tapón de colágeno variarán ligeramente. Por lo tanto, es importante utilizar un objetivo con una larga distancia de trabajo (>1 mm). De lo contrario, enfocar e imágenes puede ser difícil para los esferoides situados cerca de la parte superior del tapón de colágeno. Por el contrario, los esferoides situados cerca de la parte inferior del tapón de colágeno, tendrán células que se mueven a la superficie de vidrio y migran sobre el vidrio, en lugar de invadir en la matriz del colágeno I. Los videos de estos esferoides necesitan ser descartados. El espesor del tapón de colágeno, aquí aproximadamente 800 μm, es controlado por el volumen dispensado en cada agujero del SID y ajustado a las distancias de invasión que los esferoides exhiben en este protocolo. El grosor del tapón de colágeno se puede reducir dispensando un menor volumen de colágeno I en cada agujero del SID, cuando se utilizan esferoides más pequeños o menos invasivos.

Para un análisis adecuado de la invasión utilizando la macro de Fiji, es fundamental que las células cancerosas se etiquete correctamente en el transcurso de la sesión de imágenes. Como se indica en el paso 4.17., el paso de procesamiento de imágenes permite la corrección de imagen si el etiquetado es sub-óptimo. Si bien ilustramos las imágenes longitudinales en el transcurso de 6 días(Figura 3),que requiere la expresión estable de proteína fluorescente citoplasmática y/o nuclear, se podrían realizar imágenes longitudinales similares durante un tiempo más corto utilizando el etiquetado con colorantes.

Después de la toma de imágenes en vivo, presentamos algunos resultados del procedimiento de inmunoetiquetado para la cadherina epitelial (E-cadherin), cortactina y F-actin (Figura 4). En estos ejemplos, usamos las líneas de celda 4T1 y 67NR. La Figura 5 muestra la ilustración paso a paso del procedimiento de procesamiento de imágenes utilizando la macro de Fiji para medir el área del esferoide a lo largo del tiempo.

Figura 1: Fabricación de los SID. (A) Representación esquemática de vista superior del espaciador. (B) espaciador impreso en 3D. (C) Representación esquemática de vista superior del SID. Una plaquita PDMS de 3 orificios (D) se enlaza a una placa inferior de vidrio (E), creando el SID final (F). Las dimensiones son en milímetros. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Imágenes en vivo de esferoides. Representante 20 h y 40 h puntos de tiempo de Video 1, proyección máxima de un esferoide 4T1. Las células 4T1 fueron etiquetadas con un tinte citoplasmático. Barra de escala, 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Imágenes longitudinales de esferoides. Micrografos representativos (proyección máxima) de un esferoide mixto 4T1/67NR con imágenes diarias. Las células 4T1 y 67NR expresan de forma estable el mScarlet citoplasmático y la proteína fluorescente verde (GFP), respectivamente. Barra de escala, 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Imagen de inmunofluorescencia de esferoides. Se etiquetaron micrografos representativos (proyección máxima) de un esferoide 4T1 fijado 2 días después de incrustar en colágeno I. E-cadherin (cian, A), cortactina (amarillo, B) y F-actin (magenta, A y B). Barra de escala, 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Análisis de procesamiento de imágenes. Ilustración paso a paso del procedimiento de procesamiento de imágenes utilizando la macro de Fiji (A) para medir el área del esferoide a lo largo del tiempo (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Vídeo 1: El vídeo representativo de un esferoide 4T1 que se muestra cada 10 minutos durante 46 h y 10 min. 4T1 células fueron etiquetados con un tinte citoplasmático. Escala bar, 100 μm. Por favor, haga clic aquí para descargar este video.

Archivo suplementario 1: Modelo 3D del espaciador (archivo STL). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 2: Macro SpheroidAreaTime. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Los autores no tienen nada que revelar.