Perfiles metabólicos de alto rendimiento para refinamientos de modelos de microalgas

Cribado de fenotipo Microarrays de alga modelo Chlamydomonas reinhardtii
Los ensayos de PM prueban la capacidad del alga para utilizar varias fuentes de carbono, nitrógeno, azufre y fósforo en un medio mínimo. En esta descripción de los métodos, demostramos cómo se utilizaron los ensayos de PM para identificar el metabolismo del carbono y el nitrógeno. La cinética de utilización de carbono y nitrógeno se midió con un lector de microplacas. Los datos se analizaron mediante el software PMI. La cinética resumida de las placas de ensayo de PM seleccionadas (PM01 y PM03) se muestra en la Figura 1. Los "gráficos xy" muestran las mediciones de respiración a lo largo del tiempo trazadas para los ensayos de placas de 96 pomos, donde el eje y y el eje x representan los valores de las mediciones en bruto y el tiempo, respectivamente. Los datos se convirtieron en un patrón de mapa de calor para analizar comparativamente el ensamblaje de los datos cinéticos.

La tubería de refinación de la red metabólica a escala genómica utilizando datos de PM(Figura 2)ilustra la integración de los ensayos de PM de alto rendimiento con la evidencia experimental proporcionada por búsquedas genómicas que puede expandir un modelo de red metabólica.

Para determinar la reproducibilidad de los datos de PM obtenidos de las placas PM01 - 04 y PM10, se analizó una regresión lineal para trazar los datos de dos experimentos de réplica independientes entre sí(Figura 3). La Figura 3 muestra que la mayoría de los datos fueron casi similares, ya que caen en la línea de 45°, con solo unos pocos valores atípicos presentes, y su coeficiente de determinación R2 fue de 0,9. La consistencia y reproducibilidad de los experimentos para el alga son verificadas por esta gráfica.

Identificación de nuevos metabolitos
El ensayo PM identificó 662 metabolitos en siete placas; PM01-PM04 y PM06-PM08, mientras que la Cromatografía de Gases Tiempo de Vuelo (GC-TOF) había identificado 77 metabolitos32 (Figura 4). Al comparar estos dos conjuntos con los 1068 metabolitos contabilizados en el iRC1080, solo seis metabolitos se superpusieron entre los tres conjuntos, y 149 se superpusieron entre el iRC1080 y el PM. Este resultado demuestra que la plataforma de perfiles metabólicos puede ser una fuente significativa de nueva información metabólica.

El ácido acético fue la única fuente de carbono detectada en la placa PM01 como carbono de soporte después de restar la señal de fondo. Este hallazgo es consistente con la literatura33 y muestra la especificidad de los ensayos de PM. Los ensayos de PM revelaron nuevas fuentes de azufre, fósforo y nitrógeno que C. reinhardtii puede utilizar para el crecimiento. Los metabolitos del azufre fueron sulfato, tiosulfato, tetrationato y DL-lipoamida. Las fuentes de fósforo fueron tiofosfato, ditiofosfato, ácido D-3-fosfo-glicérico y cisteamina-S-fosfato. Los metabolitos fuente de nitrógeno fueron L-amino y D-aminoácidos, incluyendo aminoácidos menos comunes; L-homoserina, L-piroglutámico, metilamina, etilamina, etanolamina y D,L-α-amino-butírico, y 108 Dipéptidos y cinco tripéptidos (Tabla 1). Se buscaron en KEGG y MetaCyc sus reacciones asociadas, números de CE y vías, los números de EC y las vías.

Los nuevos 128 metabolitos se asociaron con 49 números EC únicos. De estos, 15 EC se vincularon a su evidencia genómica utilizando cinco fuentes, entre ellas; Phytozome Versión 10.0.234 JGI Versión 435, AUGUSTUS 5.0 y 5.210 anotaciones de Manichaikul et al. 36 y KEGG13. Los metabolitos sin evidencia genómica se ingresaron en el sitio web de Universal Protein Resource (UniProt, http://www.uniprot.org/)37,38 donde se encontraron sus secuencias relacionadas en otros organismos. Las secuencias homólogas en C. reinhardtii se identificaron ejecutando Position-Specific Iterated BLAST (PSI-BLAST, https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) del sitio web del NCBI considerando solo secuencias que produjeron alineaciones significativas (valor E <0.005).

Refinamiento del modelo
Las reacciones asociadas con los nuevos metabolitos 128, junto con sus genes codificados, se agregaron al modelo iRC1080, expandiendo la red. El modelo resultante iBD1106, da cuenta de 2.444 reacciones, 1.959 metabolitos y 1.106 genes (Tabla 2). Las nuevas 254 reacciones añadidas fueron 20 reacciones de oxidación de aminoácidos, 108 reacciones de hidrólisis de dipéptidos, cinco reacciones de hidrólisis de tripéptidos y 120 reacciones de transporte, codificadas por cuatro genes (Cre02.g096350.t1.3, au.g14655_t1, e_gwW.1.243.1, Cre12.g486350.t1.3).

Un total de 113 nuevas reacciones añadidas explican la hidrólisis de dipéptidos y tripéptidos. La hidrólisis de dipéptidos y tripéptidos se asocia con dos genes, uno para dipéptidos (Cre02.g078650.t1.3) y otro para tripéptidos (Cre16.g675350.t1.3).

En cuanto a las fuentes de fósforo, se agregó una reacción para la hidrólisis de cisteamina-S-fosfato en cisteamina y fosfato asociada con el gen JLM_162926.

La herramienta WoLF PSORT39 (http://www.genscript.com/psort/wolf_psort.html) y los resultados reportados por Ghamsari et al. Se aplicaron 35 para obtener la especificación de los compartimentos celulares donde tienen lugar las nuevas reacciones. Al analizar las secuencias de proteínas asociadas con las nuevas reacciones, WoLF PSORT predijo el citosol como el compartimento celular para las reacciones.

Un modelo metabólico generado puede contener lagunas cuando la información bioquímica es incompleta. En tales casos, se utiliza gapFind,un comando COBRA. Enumera las brechas de raíz y permite la identificación de nuevas brechas de introducción en el nuevo modelo. Los metabolitos que no se pueden producir en un modelo metabólico se conocen como brechasradiculares 40,41. El análisis de la brecha de raíz indicó que los modelos iRC1080 e iBD1106 contienen las mismas 91 brechas. Esto muestra que la adición de los nuevos metabolitos y sus reacciones asociadas no introdujo ningún hueco radicular adicional. Cabe señalar que el método de fenotipado utilizado en este protocolo no cierra las brechas de la raíz, porque los metabolitos de la brecha de la raíz original carecen de mecanismos de transporte o producción, que no se abordaron en los ensayos de fenotipado. Se realizó un análisis del balance de flujo para probar el comportamiento metabólico de iBD1106 en condiciones de luz y oscuridad; (sin acetato) y (con acetato), respectivamente. El algoritmo maximiza las reacciones precursoras de biomasa para una función objetiva (crecimiento de biomasa). Para evaluar la participación de cada metabolito en la función objetiva establecida, se calcularon los "precios sombra" para todos los metabolitos. El cambio en la función objetiva con respecto a los cambios de flujo del metabolito define el precio sombra de un metabolito30,42. La indicación de si un metabolito está en "exceso" o está "limitando" la función objetiva puede determinarse mediante el análisis de precios sombra, por ejemplo, la producción de biomasa. Los valores de precios sombra negativos o positivos revelan metabolitos que, al sumarse, disminuirán o aumentarán la función objetiva. Los valores cero de los precios sombra revelan metabolitos que no afectarán a la función objetiva. La comparación de los precios sombra entre iBD1106 e iRC1080 en la Figura 5 muestra que, para la mayoría de los metabolitos, no se observa un cambio significativo; sin embargo, las diferencias se encuentran en 105 y 70 casos en condiciones de crecimiento claro y oscuro, respectivamente. La Tabla 4 incluye ejemplos de tales metabolitos.

Figura 1: Perfil de microarrays fenotípicos de C. reinhardtii. Respiración XY-plots y diagramas de nivel del PM01 (Fuentes de carbono; A, C) y PM03 (Fuentes de nitrógeno; B, D) se muestran las placas de ensayo. La figura es una matriz de 8x12 donde cada célula representa una placa de pozo y, por lo tanto, un metabolito o entorno de crecimiento dado. Dentro de cada representación de celda o pozo, las curvas representan la conversión de tinte por reducción (eje y) en función del tiempo (eje x). Las curvas de respiración PM del CC-503 y los pomos en blanco se muestran en cada celda y se indican por color (el color verde azulado representa los pomos en blanco y el color púrpura representa CC-503). La gráfica de nivel representa cada curva de respiración como una delgada línea horizontal que cambia de color (o permanece sin cambios) a lo largo del tiempo. Los cambios de color del mapa de calor son de amarillo claro (se ha producido poca o ninguna respiración) a naranja oscuro o marrón (se ha producido una respiración significativa). Se muestran los metabolitos utilizados por C. reinhardtii (CC-503) y las placas en blanco. Esta cifra es de un trabajo publicado previamente por Chaiboonchoe et al. 12Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Figura 2:Canalización de refinamiento de la red metabólica a escala genómica utilizando datos de PM. Después de que un nuevo compuesto da positivo en un ensayo de PM, su número de Comisión de Enzimas (CE), reacción y vía se identifican a partir de las bases de datos disponibles, por ejemplo, KEGG y MetaCyc. La evidencia genómica se extrae de los recursos genómicos y de anotación cuando está disponible y constituye un vínculo entre el genotipo y el fenotipo. Cuando la evidencia genómica directa no está disponible, la secuencia de proteínas se identifica a partir de los números EC, y la evidencia genética se identifica a través de PSI-Blast. La red metabólica reconstruida se refina en función de los compuestos recién identificados, pero solo después de un paso de control de calidad que implica consultar los dominios de proteínas utilizando bases de datos relevantes. Esta figura ha sido modificada a partir de trabajos publicados previamente por Chaiboonchoe et al. 12Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Figura 3: Reproducibilidad de las pruebas de PM. Los valores de PMI se recopilaron durante un período de 168 horas, y los valores máximos de PMI se trazaron para dos estudios de réplica. Cada eje representa los valores máximos de PMI para cada estudio (el eje x es un estudio replicado y el eje y otro). Los valores reproducidos son equidistantes de cada eje. Cada punto representa un único valor máximo. La regresión lineal fue realizada por un software de hoja de cálculo, y se muestra el coeficiente de determinación resultante (R2). Esta figura ha sido modificada a partir de trabajos publicados previamente por Chaiboonchoe et al. 12Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Figura 4: Diagrama de Venn de metabolitos. El diagrama de Venn enumera los metabolitos identificados por las placas PM, el modelo metabólico iRC1080 y los experimentos de tiempo de vuelo de cromatografía de gases (GC-TOF). Cada círculo indica el número total de metabolitos que existen en cada método de estudio respectivo. Al mismo tiempo, las regiones superpuestas representan el número de metabolitos compartidos entre esos métodos. El modelo metabólico iRC1080 contiene un total de 1.068 metabolitos únicos. El GC-TOF identificó un total de 77 metabolitos32,mientras que hay un total de 662 metabolitos identificados utilizando las placas PM. Esta cifra es de un trabajo publicado previamente por Chaiboonchoe et al. 12Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Precios sombra de los metabolitos en iRC1080 e iBD1106 en diferentes condiciones para la maximización de la biomasa. Cada círculo en las "gráficas de radar" corresponde a un valor de precio sombra, mientras que cada línea que se extiende desde el centro de una gráfica indica un metabolito. (A) Precios sombra y comportamientos metabólicos de iRC1080 e iBD1106 bajo una condición de crecimiento ligero; (B), diferentes comportamientos metabólicos de iRC1080 e iBD1106 bajo una condición de crecimiento oscuro. Esta cifra es de un trabajo publicado previamente por Chaiboonchoe et al. 12Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Lista de metabolitos de utilización de sustrato positivos identificados (C, P, S, N) no presentes en el modelo metabólico iRC1080.   *La reacción no se incluyó si no se identificó ningún gen.  1 Phytozome versión 10.0.2 (http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Creinhardtii).   número arábigo JGI versión 4 35.  3 Augusto versión 510.  4 KEGG (http://www.genome.jp/kegg/kegg1.html).  5 JGI versión 3.136.  Esta tabla es de un trabajo publicado previamente por Chaiboonchoe et al. 12

Tabla 2: Contenido de iRC1080 e iBD1106.  Esta tabla es de un trabajo publicado previamente por Chaiboonchoe et al. 12

Tabla 3: Resumen de las nuevas reacciones en iBD1106. Esta tabla es de un trabajo publicado previamente por Chaiboonchoe et al. 12

Cuadro 4: Ejemplo de precios sombra significativos para iRC1080 e iBD1106. Esta tabla es de un trabajo publicado previamente por Chaiboonchoe et al. 12

Los autores no tienen nada que revelar.