Mosca de arena (Phlebotomus papatasi) Microinjeción embrionaria para CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Resumen

Este protocolo detalla los pasos de crispr/cas9 mutagénesis dirigida en moscas de arena: recolección de embriones, inyección, cría de insectos e identificación, así como selección de mutaciones de interés.

Resumen

Las moscas de la arena son los vectores naturales de las especies de Leishmania, parásitos protozoos que producen un amplio espectro de síntomas que van desde lesiones cutáneas hasta patología visceral. Descifrar la naturaleza de las interacciones vectoriales/parásitos es de importancia primordial para una mejor comprensión de la transmisión de Leishmania a sus huéspedes. Entre los parámetros que controlan la competencia de vectores de mosca de arena (es decir, su capacidad para transportar y transmitir patógenos), se demostró que los parámetros intrínsecos a estos insectos desempeñaban un papel clave. La respuesta inmune de los insectos, por ejemplo, afecta la competencia de vectores de mosca de arena a Leishmania. El estudio de estos parámetros se ha visto limitado por la falta de métodos de modificación de la expresión génica adaptados para su uso en estos organismos no modelo. La regulación genética por ARN de interferencia pequeña (SIRNA) es posible, pero además de ser técnicamente desafiante, el silenciamiento conduce a sólo una pérdida parcial de la función, que no se puede transmitir de generación en generación. La mutagénesis dirigida por la tecnología CRISPR/Cas9 fue recientemente adaptada a la mosca de arena Phlebotomus papatasi. Esta técnica conduce a la generación de mutaciones transmisibles en un locus elegido específicamente, lo que permite estudiar los genes de interés. El sistema CRISPR/Cas9 se basa en la inducción de roturas de ADN de doble hebra dirigidas, posteriormente reparadas por la Unión Final No Homologosa (NHEJ) o por la Reparación Impulsada por Homología (HDR). NHEJ consiste en un cierre simple de la rotura y con frecuencia conduce a pequeños eventos de inserción / eliminación. Por el contrario, HDR utiliza la presencia de una molécula de ADN donante que comparte homología con el ADN objetivo como una plantilla para su reparación. Aquí, presentamos un método de microinyección de embriones de mosca de arena para la mutagénesis dirigida por CRISPR/Cas9 utilizando NHEJ, que es la única técnica de modificación del genoma adaptada a los vectores de mosca de arena hasta la fecha.

Introducción

Las enfermedades transmitidas por vectores son una de las principales amenazas para la salud pública en la evolución constante. Cientos de especies vectoriales repartidas entre familias filogengénicas muy distintas (por ejemplo, mosquitos, garrapatas, pulgas) son responsables de la transmisión de un gran número de patógenos microbianos, lo que resulta en más de 700.000 muertes humanas al año, según la Organización Mundial de la Salud. Entre los insectos vectoriales, las moscas de arena de fenbotomina (Diptera, Psicodidae) constituyen un vasto grupo, con 80 especies vectoriales probadas que exhiben rasgos fenotípicos distintos y capacidades vectoriales que se encuentra....

Protocolo

El uso de ratones como fuente de sangre para la alimentación de moscas de arena se llevó a cabo de acuerdo con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud (NIH). El protocolo fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del NIAID, NIH (número de protocolo LPD 68E). Los invertebrados no están cubiertos por las directrices de los NIH.

1. Preparación de la aguja (Figura 1)

1. Tire de agujas y bisel como se describe en Meuti y Harrell¹⁹. Brevemente, tire de agujas en un extractor de micropipette de vi....

Resultados

El protocolo de microinyección CRISPR/Cas9 descrito aquí para generar mutantes de mosca de arena se estableció en una publicación anterior⁴. Este enfoque produjo mutagénesis altamente eficiente, ya que 11 de cada 540 individuos sobrevivieron al procedimiento, de los cuales 9 fueron mutantes. Al diseñar guías para la mutación CRISPR/Cas9, un primer paso crítico es secuenciar la región alrededor del área a la que se va a dirigir. La plantilla para la secuenciación debe ser de la cepa que se va a uti.......

Discusión

Presentamos aquí un método de microinjección embrionaria recientemente desarrollado para la mutagénesis dirigida por CRISPR/Cas9 en moscas de arena Phlebotomus papatasi. La microinyección embrionaria para la modificación genética de insectos se desarrolló en Drosophila a mediados de la década de 1980²¹ y ahora se utiliza rutinariamente en una amplia variedad de insectos. Se han desarrollado otros métodos para la entrega de materiales de modificación genética para su uso en insect.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Papel de filtro negro 4.25CM PK100	VWR	28342-012	Cortado en rectángulos de aproximadamente 46 X 22 mm. Estos se colocan entre el portaobjetos y el cubreobjetos y actúan como una capa base húmeda para los embriones durante la inyección.
Cubreobjetos	Fisher Scientific	12-543A
Microscopio de disección	Cualquier marca		Para alinear embriones
Portaobjetos de vidrio	Fisher Scientific	12-550-A3	Capa base de la configuración de microinyección Figura 2A
Jaula de insectos	hecha a medida o varias opciones comerciales		jaula de policarbonato para adultos sosteniendo y apareando a Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton y Petr Volf. “ Colonización de laboratorio y cría masiva de flebótomos (Diptera, Psychodidae)". Parásito 24. Último acceso: 6 de agosto de 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.
Alimento para larvas	hecho		a medida una mezcla de comida de conejo y heces de conejo Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton y Petr Volf. Colonización de laboratorio y cría masiva de flebótomos (Diptera, Psychodidae)". Parásito 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.
Microcápsulas 100 ml	Drummond	1-000-1000	Se utiliza para rellenar agujas de microinyección
Aspirador	John W. Hock Company	Aspirador bucal modelo 612	con filtro HEPA
Olympus SZX12	Olympus Life Sciences		Microscopio de microinyección
Ovipots	Nalge company		Los ovipots están hechos de frascos de 125 ml o 500 ml de plolipropileno de lados rectos modificados perforando agujeros de 2,5 cm en el fondo y rellenos con 1 cm de yeso de París. Abogado, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton y Petr Volf. “ Colonización de laboratorio y cría masiva de flebótomos (Diptera, Psychodidae)". Parásito 24. Último acceso: 6 de agosto de 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.
Pincel 6-0	Any Art Supply Company	n/a	Se utiliza para alinear embriones
Ácido propiónico	Sigma-Aldrich	402907	agente antifúngico
Capilares de vidrio estándar	World Precision Instruments	1B100-3	Se utiliza para fabricar agujas de microinyección
Controlador Trio-MPC100 y manipulador MP845 Controlador	Sutter Instruments		y Micromanipulador

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