Artículo de método

In vitro Time-lapse live-cell imaging para explorar la migración celular hacia el órgano de Corti

DOI:

10.3791/61947

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4 de diciembre de 2020

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1Department of Otorhinolaryngology, Yonsei University Wonju College of Medicine, 2Research Institute of Hearing Enhancement, Yonsei University Wonju College of Medicine, 3Department of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery, Hallym University College of Medicine

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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En este estudio, presentamos un método de la proyección de imagen en tiempo real usando microscopia confocal para observar las células que se mueven hacia el tejido dañado por la incubación ex vivo con el epitelio coclear que contiene el órgano de Corti.

Resumen

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Para estudiar los efectos de las células madre mesenquimales (MSC) en la regeneración celular y el tratamiento, este método rastrea la migración msc y los cambios morfológicos después de co-cultivo con epitelio coclear. El órgano de Corti fue inmovilizado en una cubierta plástica presionando una porción de la membrana del Reissner generada durante la disección. MsCs confinado por un cilindro de cristal migró hacia el epitelio coclear cuando el cilindro fue quitado. Su localización predominante se observó en el modiolus del órgano de Corti, alineado en una dirección similar a la de las fibras nerviosas. Sin embargo, algunos MSCs fueron localizados en el área del limbus y demostraron una forma horizontalmente alargada. Además, la migración en el área de la célula de pelo fue aumentada, y la morfología del MSCs cambió a las varias formas después del tratamiento del kanamycin. En conclusión, los resultados de este estudio indican que el cocultivo de MSCs con epitelio coclear será útil para el desarrollo de la terapéutica vía el trasplante de la célula y para los estudios de la regeneración de la célula que pueden examinar las varias condiciones y factores.

Introducción

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La pérdida de audición puede ocurrir congénitamente o puede ser causada progresivamente por varios factores, incluyendo el envejecimiento, las drogas y el ruido. La pérdida de audición es a menudo difícil de tratar porque es muy difícil restaurar la función deteriorada una vez que las células ciliadas responsables de la audición están dañadas1. Según la Organización Mundial de la Salud, se estima que 461 millones de personas en todo el mundo tienen pérdida auditiva, lo que representa el 6,1% de la población mundial. De las personas con pérdida auditiva, el 93% son adultos y el 7% son niños.

Se han intentado varios en....

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Protocolo

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Todos los protocolos de investigación que involucran ratones ICR fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Yonsei en wonju Facultad de Medicina. Los experimentos se realizaron de acuerdo con el Código de Ética de la Asociación Médica Mundial. En este protocolo, los ratones embarazadas de ICR fueron mantenidos en un ciclo claro/oscuro de 12/12 h con el acceso libre al alimento y al agua.

1. Disección de cocleas

  1. Esterilice la campana de cultivo de tejido de flujo laminar encendiendo la luz ultravioleta durante ~ 30 minutos, y rocíe todas las superficies con etanol al 70% a....

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Resultados

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La migración in vitro de mscs en modo tridimensional ha sido evaluada por un sistema Transwell o por el método tradicional de cicatrización de heridas para observar la migración en modo bidimensional (2D)11. El órgano de Corti es una estructura compleja compuesta por varias células como las células de Boettcher, las células de Claudio, las células de Deiters, las células del pilar, las células de Hensen, las células ciliadas externas, las células ciliadas internas,.......

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Discusión

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El trasplante de MSCs en sitios dañados para promover la regeneración de células dañadas se ha estudiado extensivamente, y el efecto terapéutico es evidente. El trasplante y la diferenciación subsecuente de MSCs se han divulgado para restaurar la audiencia en ratas con la pérdida de oído inducida por el ácido 3-nitropropionic13. Aunque Lee et al. aplicaron mscs a seres humanos transvenosamente, no lograron ninguna mejora significativa en la audición14. Hasta hace poco, se r.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por becas de investigación (NRF-2018-R1D1A1B07050175, HURF-2017-66) de la Fundación Nacional de Investigación (NRF) de Corea y el Fondo de Investigación de la Universidad Hallym.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
10X Tampón PBSGenDEPOTP2100-104
4% FormalinaT& IBPP-9004
Ampicilinasigma A5354-10ml
BSAsigma A4503-100G
plato confocalSPL200350
microscopio confocal ZEISSLSM800
cubreobjetosSPL20009
DMEM/F12Gibco10565-018
Suero fetal bovinoThermo Fisher scientific16140071
Fluorsheild con DAPIsigma F6057
PinzaDumont0508-L5-P0
HBSSThermo Fisher scientific14065056
HEPESThermo Fisher scientific15630080
suplemento N2Gibco17502-048
Phalloidin-iFluor 647 Reactivoabcamab176759
Incubadora de etapasuperior TOKAI HITWELSX
Cepa C57BL/6 células madre mesenquimales de ratón conciagenGFP MUBMX-01101
Triton X-100sigma T8787

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brown, C. S., Emmett, S. D., Robler, S. K., Tucci, D. L. Global hearing loss prevention. Otolaryngologic Clinics of North America. 51 (3), 575-592 (2018).
  2. Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise revie....

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Etiquetas

C lulas madre mesenquimalesmicroscop a confocalim genes de lapso de tiempoepitelio coclearcilindro de vidrioinmovilizaci n de tejidosMSC con etiqueta GFP

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