Ensayo funcionalizado de síntesis y citotoxicidad del heterociclo espirocíclico

Resumen

Aquí, describimos un bioensayo utilizando bromuro de 3-(4′,5′-dimetiltiazol-2′-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) para probar oximas espirocíclicas previamente sintetizadas.

Resumen

Recientemente se ha informado en la literatura que los heterociclos espirocíclicos son fármacos potenciales para el tratamiento del cáncer. La síntesis de estos novedosos sistemas de anillos ortogonales es un desafío. Recientemente se publicó una metodología eficiente para sintetizar estos compuestos que describía la síntesis en fase sólida en cuatro pasos en lugar de los cinco pasos previamente informados. La ventaja de esta síntesis más corta es la eliminación del uso de reactivos tóxicos. Se descubrió que la resina basada en enlazadores de baja carga Regenerating Michael (REM) era crucial en la síntesis, ya que las versiones de alta carga evitaban la adición de reactivos que contenían cadenas laterales voluminosas de fenilo y aromáticas. El ensayo colorimétrico de bromuro de 3-(4′,5′-dimetiltiazol-2′-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) se utilizó para examinar la citotoxicidad de las concentraciones micromolares de estas nuevas moléculas espirocíclicas in vitro. MTT está fácilmente disponible comercialmente y produce resultados relativamente rápidos y confiables, lo que hace que este ensayo sea ideal para estos heterociclos espirocíclicos. Se probaron estructuras de anillos ortogonales, así como furfurilamina (un precursor en el método de síntesis que contiene un motivo de anillo similar de 5 miembros).

Introducción

Se sabe que la inhibición de moléculas pequeñas de la interacción del homólogo de doble minuto 2 del ratón ubiquitina-ligasa E3 (MDM2) con p53 restaura la inducción mediada por p53 de la apoptosis de células tumorales ^1,2,3. MDM2 es un regulador negativo de la vía p53 y a menudo se sobreexpresa en las células cancerosas 4,5,6,7,8,9. Estudios cristalográficos y bioquímicos recientes han revelado que moléculas pequeñas que contienen un marco espirocíclico pueden inhibir eficazmente las interacciones MDM2-p53¹⁰. El marco espirocíclico (Figura 1, sombreado en azul) se considera un motivo privilegiado ya que la derivatización de este sistema de anillos ortogonales rígidos ha llevado al descubrimiento de nuevos fármacos terapéuticos. Acceder a esta interesante arquitectura plantea un desafío cuando se utilizan técnicas tradicionales de síntesis orgánica. Aunque se han investigado los efectos terapéuticos de las moléculas espirocíclicas en los sistemas biológicos, la síntesis de estas moléculas sigue siendo un proceso engorroso. Los productos secundarios no deseados, el uso de condiciones adversas y los metales de transición peligrosos a menudo son problemáticos.

El uso potencial del motivo espirocíclico en el desarrollo de fármacos condujo al desarrollo de un protocolo que utiliza la síntesis en fase sólida para generar una biblioteca de moléculas con el motivo además de otros grupos funcionales intercambiables^11,12. La separación de productos y reactivos entre los pasos podría lograrse simplemente utilizando un enlazador REM conectado a un cordón de resina y un recipiente de filtro de fase sólida. Esto reduciría los escalones y potencialmente aumentaría los rendimientos. Este enfoque sintético podría producir una gran variedad de posibles candidatos a fármacos. Sin embargo, la efectividad de estas moléculas en un sistema biológico requeriría más investigación.

Para determinar la citotoxicidad de estos compuestos espirocíclicos, se empleó el ensayo MTT^13,14. Este método mide la viabilidad celular y se puede utilizar para determinar indirectamente la citotoxicidad celular. Se agregaron diferentes concentraciones de los inhibidores a las células cultivadas en una placa de 96 pocillos, y la proporción de células vivas se midió mediante análisis colorimétrico del grado de reducción de MTT amarillo por deshidrogenasas mitocondriales al compuesto formazán púrpura (Figura 2). La actividad se informa con mayor frecuencia como un valor IC 50, la concentración en la que el crecimiento celular se inhibe en un₅₀% en relación con un control no tratado. Este artículo describe el protocolo para el ensayo MTT y los resultados preliminares de estas nuevas moléculas espirocíclicas.

Protocolo

NOTA: Varios productos químicos y reactivos biológicos utilizados en este protocolo son tóxicos y cancerígenos. Consulte las hojas de datos de seguridad de materiales (MSDS) relevantes antes de su uso. Use equipos de protección personal apropiados (gafas de seguridad aprobadas por la Administración de Seguridad y Salud Ocupacional, guantes adecuados, batas de laboratorio, pantalones largos y zapatos cerrados) antes de comenzar el experimento. Además, adoptar prácticas de seguridad adecuadas al realizar síntesis y manipular productos químicos tóxicos y reactivos (campana extractora).

1. Síntesis en fase sólida de heterociclos espirocíclicos 6 y 7

NOTA: La síntesis se basó en trabajos publicados previamente^11,12. El protocolo actualizado revela que la abertura del anillo catalizada por fluoruro de tetrabutilamonio del heterociclo tricíclico no era necesaria y, por lo tanto, su eliminación acorta el procedimiento sintético.

1. Realizar la adición de furfurilamina de Michael al enlazador REM (duración: 25 min de configuración + 24 h de tiempo de reacción).
   1. Agregue 1 g (1 equivalente [equiv.]) de resina REM, 20 ml (20 equiv.) de dimetilformamida (DMF) y 2.4 ml de furfurilamina a un recipiente de reacción en fase sólida de 25 ml. Agitar el recipiente de reacción a temperatura ambiente durante 24 h después del inicio de la reacción.
      NOTA: Asegúrese de mezclar bien para que la resina no se asiente en el fondo del recipiente.
   2. Lave la resina con DMF 1x después de que se complete la reacción. Luego, lave 4x, alternando entre diclorometano (DCM) y metanol. Seque bien la resina en el recipiente de reacción después de los lavados.
2. Realizar adición de Michael en tándem / cicloadición 1,3-dipolar (duración: configuración de 25 min + tiempo de reacción de 48 h).
   1. A la resina seca, agregue 1.48 mL (5 equiv.) de trietilamina (TEA), 0.637 g (2 equiv.) de nitro-olefina y 10 mL de tolueno seco al recipiente de reacción.
   2. Luego, agregue 1.085 ml (4 equiv.) de cloruro de trimetilsilil (TMSCl) al recipiente de reacción en una campana extractora bien ventilada.
      NOTA: Como esta reacción produce gas HCl, no tapar el recipiente de reacción hasta que el gas se haya liberado debajo de una campana extractora.
   3. Tapar firmemente el recipiente de reacción y agitar a temperatura ambiente durante 48 h.
      NOTA: Asegúrese de mezclar completamente la resina con los reactivos.
   4. Use 5 ml de metanol para apagar la reacción.
   5. Drene el recipiente para eliminar la solución y luego lave 4x, alternando entre DCM y metanol. Seque bien la resina en el recipiente de reacción después de los lavados.
3. Realizar N-alquilación del heterociclo unido a resina para formar la amina cuaternaria (duración: 10 min de configuración + 24 h de tiempo de reacción).
   1. A la resina seca en el recipiente de reacción, agregue 5 mL de DMF y 10 equivalentes de haluro de alquilo, y agite a temperatura ambiente durante 24 h.
      NOTA: Asegúrese de mezclar bien los reactivos con la resina.
   2. Lave la resina con DMF 1x después de que se complete la reacción. Luego, use DCM y metanol alternativamente para lavar 4x. Seque la resina en el recipiente de reacción después de los lavados.
4. Realizar β eliminación de la amina cuaternaria para la escisión del soporte del polímero (duración: configuración de 15 min + tiempo de reacción de 24 h).
   1. A la resina seca en el recipiente de reacción, agregue 3 ml de DCM y 1,49 ml (5 equivalentes) de TEA para separar el heterociclo del soporte del polímero.
   2. Agitar la mezcla de reacción durante 24 h para asegurar una mezcla completa de la resina con la solución. Lavar 4x, alternando entre DCM y metanol. Recoger la elución de todos los lavados y concentrar por evaporación rotatoria.
   3. Triturar con metanol para purificar la oxima espirocíclica. Seque bien la resina en el recipiente de reacción después de los lavados para su reutilización en futuros experimentos.

2. Ensayo de citotoxicidad utilizando MTT ¹⁴

1. Prepare 20 ml de una solución MTT de 5 mg/ml utilizando solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS, NaCl al 0,9% en agua) como diluyente. Filtrar y conservar a -20 °C. Luego, prepare una dilución 1: 1 de la solución MTT del paso 2.1 en medio de cultivo celular libre de suero (DMEM).
2. Preparar 1 ml de soluciones madre en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml de 100 mM, 10 mM, 1 mM, 100 μM, 10 μM, 1 μM, 0,1 μM y 0,01 μM de compuestos problema en dimetilsulfóxido (DMSO). Conservar a -20 °C. Preparar 200 μL por dosis de las soluciones de trabajo de los compuestos problema diluyendo las concentraciones madre 1:1000 en medio libre de suero en tubos de 1,5 ml.
3. En la campana de cultivo de tejidos, sembrar células COS-7 (células de riñón de mono verde africano, riñón de Cercopithecus aethiops ) en medio completo [DMEM con 10% de suero bovino fetal (FBS)] en placas de 96 pocillos tratadas con cultivo de tejidos de fondo plano a una concentración de 4 × 10³ células/200 μL por pocillo utilizando un pipetor multicanal. Se eligieron células COS-7 porque (1) son células de uso común para ensayos de citotoxicidad y (2) ya estaban disponibles en la institución.
4. Incubar células COS-7 durante 24 h a 37 °C en una atmósfera que contenga un 5% de_CO2.
5. Aspire el sobrenadante de los pocillos con una pipeta de vidrio Pasteur conectada a una bomba de vacío. Dosificar las células por triplicado con los compuestos problema utilizando las soluciones de trabajo preparadas en el paso 2.2 (véase el cuadro 1). Incubar las células como se describe en el paso 2.4.
6. Aspirar el sobrenadante de los pozos. Agregue 200 μL de solución MTT a cada pocillo. Incubar a 37 °C en una atmósfera que contenga un 5% de_CO2 durante 4 h.
7. Aspirar suavemente el sobrenadante de los pocillos sin alterar los cristales de formazan púrpura. Añadir 200 μL de DMSO a cada pocillo para disolver los cristales de formazán púrpura. Incubar a temperatura ambiente durante 15 min.
8. Mida la absorbancia a 590 nm¹⁴ o 600 nm para cada pocillo utilizando un lector de placas de 96 pocillos. Utilice pocillos sin celdas como fondo y promedie el valor de absorbancia. Reste el valor de fondo de absorbancia promedio del valor de absorbancia de cada pocillo tratado. Normalice los datos como un porcentaje del valor promedio de dosis cero (promedio de los tres valores de dosis cero). Trazar datos en el eje y: lineal (% de viabilidad relativa de la celda); Eje X: log (concentración). Trazar cada serie como una curva individual (por ejemplo, los datos triplicados deben tener 3 curvas)

Resultados

Las oximas espirocíclicas 6 y 7 se sintetizaron utilizando un protocolo modificado (Figura 1). La adición de furfurilamina de Michael a un enlazador REM 1b proporcionó resina 2 unida a polímeros. El progreso de la reacción fue monitoreado por espectroscopia infrarroja (IR) detectando la desaparición del éster α,β-insaturado a 1722 ^cm-1 (Figura 3). La resina 4 unida a espirocíclicos se formó a partir de 2 a través de un intermedio transitorio 3. La hid...

Discusión

La síntesis de los compuestos espirocíclicos se basó en investigaciones previas realizadas por este laboratorio, pero con algunas modificaciones (Figura 1)^11,12. El progreso de cada paso de reacción fue monitoreado por espectroscopia IR. La adición de Michael del enlazador REM 1 con furfurilamina proporcionó 2 unido al polímero (IR 1722 cm-1 → 1731 ^cm-1).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
FUERTES
COS-7 fuertes (ATCC CRL-1651)	ATCC	CRL-1651	Células de riñón de mono verde africano
FUERTES1-bromooctano fuerte >
	Sigma-Aldrich	152951	Alilbromuro de haluro de alquilo
	Sigma-Aldrich	337528	Haluro de alquilo
Bencilbromuro	Sigma-Aldrich	B17905	Haluro de alquilo
Cisplatino	Cayman Chemical	13119	Control de citotoxicidad
Diclorometano (DCM)	Sigma-Aldrich	270997	disolvente
Dimetilformamida (DMF)	Sigma-Aldrich	227056	disolvente
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich	276855	Disolvente
DMEM, alto contenido de glucosa, con L-glutamina	Genesee Scientific	25-500 Medios de	cultivo celular
FBS (Suero fetal bovino)	Sigma-Aldrich	F4135	Medios de cultivo celular
Furfurilamina	Acros Organics		119800050 reactivo
Yodometano	Sigma-Aldrich	289566	haluro de alquilo
Metanol	Sigma-Aldrich	34860	Solvente
MTT ((3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-Difeniltetrazolio Bromuro)	EMD Millipore	Calbiochem 475989-1GM	Reactivo
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Genesee Scientific	25-507 Medios de	cultivo celular
Resina REM	Nova Biochem	8551010005	Soporte de polímeros; 0,500 mmol/g cargando
trans-β-nitroestireno	Sigma-Aldrich	N26806	Reactivo de nitroolefina
Tolueno	Sigma-Aldrich	244511	Disolvente
Trietilamina (TEA)	Sigma-Aldrich	T0886	Reactivo para la eliminación beta
Cloruro de trimetisilil (TMSCl)	Reactivo de 386529 Sigma-Aldrich		; PRECAUCIÓN: altamente volátil; crea gas HCl
CRISTALERÍA/INSTRUMENTACIÓN
25 mL recipiente de reacción en fase sólida	Chemglass	CG-1861-02	Cristalería con filtro
96 Lector de placas de pocillos	Promega (Turner Biosystems)	9310-011	Instrumento
Espectrómetro AVANCE III NMR Bruker		N/A	Instrumento; 300 MHz; Disolventes: CDCl3 y CD3OH
Thermo Scientific Nicole iS5	Thermo Scientific	IQLAADGAAGFAHDMAZA	Instrumento
acción de muñeca	Burrell Scientific		757950819 Instrument