Aquí, describimos un bioensayo utilizando bromuro de 3-(4′,5′-dimetiltiazol-2′-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) para probar oximas espirocíclicas previamente sintetizadas.
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Artículo de método
Ensayo funcionalizado de síntesis y citotoxicidad del heterociclo espirocíclico
En este artículo
Resumen
Resumen
Recientemente se ha informado en la literatura que los heterociclos espirocíclicos son fármacos potenciales para el tratamiento del cáncer. La síntesis de estos novedosos sistemas de anillos ortogonales es un desafío. Recientemente se publicó una metodología eficiente para sintetizar estos compuestos que describía la síntesis en fase sólida en cuatro pasos en lugar de los cinco pasos previamente informados. La ventaja de esta síntesis más corta es la eliminación del uso de reactivos tóxicos. Se descubrió que la resina basada en enlazadores de baja carga Regenerating Michael (REM) era crucial en la síntesis, ya que las versiones de alta carga evitaban la adición de reactivos que contenían cadenas laterales voluminosas de fenilo y aromáticas. El ensayo colorimétrico de bromuro de 3-(4′,5′-dimetiltiazol-2′-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) se utilizó para examinar la citotoxicidad de las concentraciones micromolares de estas nuevas moléculas espirocíclicas in vitro. MTT está fácilmente disponible comercialmente y produce resultados relativamente rápidos y confiables, lo que hace que este ensayo sea ideal para estos heterociclos espirocíclicos. Se probaron estructuras de anillos ortogonales, así como furfurilamina (un precursor en el método de síntesis que contiene un motivo de anillo similar de 5 miembros).
Introducción
Se sabe que la inhibición de moléculas pequeñas de la interacción del homólogo de doble minuto 2 del ratón ubiquitina-ligasa E3 (MDM2) con p53 restaura la inducción mediada por p53 de la apoptosis de células tumorales 1,2,3. MDM2 es un regulador negativo de la vía p53 y a menudo se sobreexpresa en las células cancerosas 4,5,6,7,8,9. Estudios cristalográficos y bioquímicos recientes han revelado que moléculas pequeñas que contienen un marco espirocíclico pueden inhibir eficazmente las interacciones MDM2-p5310. El marco espirocíclico (Figura 1, sombreado en azul) se considera un motivo privilegiado ya que la derivatización de este sistema de anillos ortogonales rígidos ha llevado al descubrimiento de nuevos fármacos terapéuticos. Acceder a esta interesante arquitectura plantea un desafío cuando se utilizan técnicas tradicionales de síntesis orgánica. Aunque se han investigado los efectos terapéuticos de las moléculas espirocíclicas en los sistemas biológicos, la síntesis de estas moléculas sigue siendo un proceso engorroso. Los productos secundarios no deseados, el uso de condiciones adversas y los metales de transición peligrosos a menudo son problemáticos.
El uso potencial del motivo espirocíclico en el desarrollo de fármacos condujo al desarrollo de un protocolo que utiliza la síntesis en fase sólida para generar una biblioteca de moléculas con el motivo además de otros grupos funcionales intercambiables11,12. La separación de productos y reactivos entre los pasos podría lograrse simplemente utilizando un enlazador REM conectado a un cordón de resina y un recipiente de filtro de fase sólida. Esto reduciría los escalones y potencialmente aumentaría los rendimientos. Este enfoque sintético podría producir una gran variedad de posibles candidatos a fármacos. Sin embargo, la efectividad de estas moléculas en un sistema biológico requeriría más investigación.
Para determinar la citotoxicidad de estos compuestos espirocíclicos, se empleó el ensayo MTT13,14. Este método mide la viabilidad celular y se puede utilizar para determinar indirectamente la citotoxicidad celular. Se agregaron diferentes concentraciones de los inhibidores a las células cultivadas en una placa de 96 pocillos, y la proporción de células vivas se midió mediante análisis colorimétrico del grado de reducción de MTT amarillo por deshidrogenasas mitocondriales al compuesto formazán púrpura (Figura 2). La actividad se informa con mayor frecuencia como un valor IC 50, la concentración en la que el crecimiento celular se inhibe en un50% en relación con un control no tratado. Este artículo describe el protocolo para el ensayo MTT y los resultados preliminares de estas nuevas moléculas espirocíclicas.
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Protocolo
NOTA: Varios productos químicos y reactivos biológicos utilizados en este protocolo son tóxicos y cancerígenos. Consulte las hojas de datos de seguridad de materiales (MSDS) relevantes antes de su uso. Use equipos de protección personal apropiados (gafas de seguridad aprobadas por la Administración de Seguridad y Salud Ocupacional, guantes adecuados, batas de laboratorio, pantalones largos y zapatos cerrados) antes de comenzar el experimento. Además, adoptar prácticas de seguridad adecuadas al realizar síntesis y manipular productos químicos tóxicos y reactivos (campana extractora).
1. Síntesis en fase sólida de heterociclos espirocíclicos 6 y 7
NOTA: La síntesis se basó en trabajos publicados previamente11,12. El protocolo actualizado revela que la abertura del anillo catalizada por fluoruro de tetrabutilamonio del heterociclo tricíclico no era necesaria y, por lo tanto, su eliminación acorta el procedimiento sintético.
- Realizar la adición de furfurilamina de Michael al enlazador REM (duración: 25 min de configuración + 24 h de tiempo de reacción).
- Agregue 1 g (1 equivalente [equiv.]) de resina REM, 20 ml (20 equiv.) de dimetilformamida (DMF) y 2.4 ml de furfurilamina a un recipiente de reacción en fase sólida de 25 ml. Agitar el recipiente de reacción a temperatura ambiente durante 24 h después del inicio de la reacción.
NOTA: Asegúrese de mezclar bien para que la resina no se asiente en el fondo del recipiente. - Lave la resina con DMF 1x después de que se complete la reacción. Luego, lave 4x, alternando entre diclorometano (DCM) y metanol. Seque bien la resina en el recipiente de reacción después de los lavados.
- Agregue 1 g (1 equivalente [equiv.]) de resina REM, 20 ml (20 equiv.) de dimetilformamida (DMF) y 2.4 ml de furfurilamina a un recipiente de reacción en fase sólida de 25 ml. Agitar el recipiente de reacción a temperatura ambiente durante 24 h después del inicio de la reacción.
- Realizar adición de Michael en tándem / cicloadición 1,3-dipolar (duración: configuración de 25 min + tiempo de reacción de 48 h).
- A la resina seca, agregue 1.48 mL (5 equiv.) de trietilamina (TEA), 0.637 g (2 equiv.) de nitro-olefina y 10 mL de tolueno seco al recipiente de reacción.
- Luego, agregue 1.085 ml (4 equiv.) de cloruro de trimetilsilil (TMSCl) al recipiente de reacción en una campana extractora bien ventilada.
NOTA: Como esta reacción produce gas HCl, no tapar el recipiente de reacción hasta que el gas se haya liberado debajo de una campana extractora. - Tapar firmemente el recipiente de reacción y agitar a temperatura ambiente durante 48 h.
NOTA: Asegúrese de mezclar completamente la resina con los reactivos. - Use 5 ml de metanol para apagar la reacción.
- Drene el recipiente para eliminar la solución y luego lave 4x, alternando entre DCM y metanol. Seque bien la resina en el recipiente de reacción después de los lavados.
- Realizar N-alquilación del heterociclo unido a resina para formar la amina cuaternaria (duración: 10 min de configuración + 24 h de tiempo de reacción).
- A la resina seca en el recipiente de reacción, agregue 5 mL de DMF y 10 equivalentes de haluro de alquilo, y agite a temperatura ambiente durante 24 h.
NOTA: Asegúrese de mezclar bien los reactivos con la resina. - Lave la resina con DMF 1x después de que se complete la reacción. Luego, use DCM y metanol alternativamente para lavar 4x. Seque la resina en el recipiente de reacción después de los lavados.
- A la resina seca en el recipiente de reacción, agregue 5 mL de DMF y 10 equivalentes de haluro de alquilo, y agite a temperatura ambiente durante 24 h.
- Realizar β eliminación de la amina cuaternaria para la escisión del soporte del polímero (duración: configuración de 15 min + tiempo de reacción de 24 h).
- A la resina seca en el recipiente de reacción, agregue 3 ml de DCM y 1,49 ml (5 equivalentes) de TEA para separar el heterociclo del soporte del polímero.
- Agitar la mezcla de reacción durante 24 h para asegurar una mezcla completa de la resina con la solución. Lavar 4x, alternando entre DCM y metanol. Recoger la elución de todos los lavados y concentrar por evaporación rotatoria.
- Triturar con metanol para purificar la oxima espirocíclica. Seque bien la resina en el recipiente de reacción después de los lavados para su reutilización en futuros experimentos.
2. Ensayo de citotoxicidad utilizando MTT 14
- Prepare 20 ml de una solución MTT de 5 mg/ml utilizando solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS, NaCl al 0,9% en agua) como diluyente. Filtrar y conservar a -20 °C. Luego, prepare una dilución 1: 1 de la solución MTT del paso 2.1 en medio de cultivo celular libre de suero (DMEM).
- Preparar 1 ml de soluciones madre en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml de 100 mM, 10 mM, 1 mM, 100 μM, 10 μM, 1 μM, 0,1 μM y 0,01 μM de compuestos problema en dimetilsulfóxido (DMSO). Conservar a -20 °C. Preparar 200 μL por dosis de las soluciones de trabajo de los compuestos problema diluyendo las concentraciones madre 1:1000 en medio libre de suero en tubos de 1,5 ml.
- En la campana de cultivo de tejidos, sembrar células COS-7 (células de riñón de mono verde africano, riñón de Cercopithecus aethiops ) en medio completo [DMEM con 10% de suero bovino fetal (FBS)] en placas de 96 pocillos tratadas con cultivo de tejidos de fondo plano a una concentración de 4 × 103 células/200 μL por pocillo utilizando un pipetor multicanal. Se eligieron células COS-7 porque (1) son células de uso común para ensayos de citotoxicidad y (2) ya estaban disponibles en la institución.
- Incubar células COS-7 durante 24 h a 37 °C en una atmósfera que contenga un 5% deCO2.
- Aspire el sobrenadante de los pocillos con una pipeta de vidrio Pasteur conectada a una bomba de vacío. Dosificar las células por triplicado con los compuestos problema utilizando las soluciones de trabajo preparadas en el paso 2.2 (véase el cuadro 1). Incubar las células como se describe en el paso 2.4.
- Aspirar el sobrenadante de los pozos. Agregue 200 μL de solución MTT a cada pocillo. Incubar a 37 °C en una atmósfera que contenga un 5% deCO2 durante 4 h.
- Aspirar suavemente el sobrenadante de los pocillos sin alterar los cristales de formazan púrpura. Añadir 200 μL de DMSO a cada pocillo para disolver los cristales de formazán púrpura. Incubar a temperatura ambiente durante 15 min.
- Mida la absorbancia a 590 nm14 o 600 nm para cada pocillo utilizando un lector de placas de 96 pocillos. Utilice pocillos sin celdas como fondo y promedie el valor de absorbancia. Reste el valor de fondo de absorbancia promedio del valor de absorbancia de cada pocillo tratado. Normalice los datos como un porcentaje del valor promedio de dosis cero (promedio de los tres valores de dosis cero). Trazar datos en el eje y: lineal (% de viabilidad relativa de la celda); Eje X: log (concentración). Trazar cada serie como una curva individual (por ejemplo, los datos triplicados deben tener 3 curvas)
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Resultados
Las oximas espirocíclicas 6 y 7 se sintetizaron utilizando un protocolo modificado (Figura 1). La adición de furfurilamina de Michael a un enlazador REM 1b proporcionó resina 2 unida a polímeros. El progreso de la reacción fue monitoreado por espectroscopia infrarroja (IR) detectando la desaparición del éster α,β-insaturado a 1722 cm-1 (Figura 3). La resina 4 unida a espirocíclicos se formó a partir de 2 a través de un intermedio transitorio 3. La hid...
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Discusión
La síntesis de los compuestos espirocíclicos se basó en investigaciones previas realizadas por este laboratorio, pero con algunas modificaciones (Figura 1)11,12. El progreso de cada paso de reacción fue monitoreado por espectroscopia IR. La adición de Michael del enlazador REM 1 con furfurilamina proporcionó 2 unido al polímero (IR 1722 cm-1 → 1731 cm-1).
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por una subvención del Consejo de Investigación de la Facultad a K.S.H. (Oficina de Investigación y Subvenciones, Azusa Pacific University-USA). A.N.G. y J.F.M. son beneficiarios de la beca Scholarly Undergraduate Research Experience (SURE). S.K.M. y B.M.R. son beneficiarios de las becas de investigación STEM (Center for Research in Science, Azusa Pacific University-USA). Agradecemos al Dr. Matthew Berezuk y al Dr. Philip Cox por su orientación sobre los bioensayos.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| FUERTES | |||
| COS-7 fuertes (ATCC CRL-1651) | ATCC | CRL-1651 | Células de riñón de mono verde africano |
| FUERTES1-bromooctano fuerte > | |||
| Sigma-Aldrich | 152951 | Alilbromuro de haluro de alquilo | |
| Sigma-Aldrich | 337528 | Haluro de alquilo | |
| Bencilbromuro | Sigma-Aldrich | B17905 | Haluro de alquilo |
| Cisplatino | Cayman Chemical | 13119 | Control de citotoxicidad |
| Diclorometano (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997 | disolvente |
| Dimetilformamida (DMF) | Sigma-Aldrich | 227056 | disolvente |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | Disolvente |
| DMEM, alto contenido de glucosa, con L-glutamina | Genesee Scientific | 25-500 Medios de | cultivo celular |
| FBS (Suero fetal bovino) | Sigma-Aldrich | F4135 | Medios de cultivo celular |
| Furfurilamina | Acros Organics | 119800050 reactivo | |
| Yodometano | Sigma-Aldrich | 289566 | haluro de alquilo |
| Metanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Solvente |
| MTT ((3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-Difeniltetrazolio Bromuro) | EMD Millipore | Calbiochem 475989-1GM | Reactivo |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Genesee Scientific | 25-507 Medios de | cultivo celular |
| Resina REM | Nova Biochem | 8551010005 | Soporte de polímeros; 0,500 mmol/g cargando |
| trans-β-nitroestireno | Sigma-Aldrich | N26806 | Reactivo de nitroolefina |
| Tolueno | Sigma-Aldrich | 244511 | Disolvente |
| Trietilamina (TEA) | Sigma-Aldrich | T0886 | Reactivo para la eliminación beta |
| Cloruro de trimetisilil (TMSCl) | Reactivo de 386529 Sigma-Aldrich | ; PRECAUCIÓN: altamente volátil; crea gas HCl | |
| CRISTALERÍA/INSTRUMENTACIÓN | |||
| 25 mL recipiente de reacción en fase sólida | Chemglass | CG-1861-02 | Cristalería con filtro |
| 96 Lector de placas de pocillos | Promega (Turner Biosystems) | 9310-011 | Instrumento |
| Espectrómetro AVANCE III NMR Bruker | N/A | Instrumento; 300 MHz; Disolventes: CDCl3 y CD3OH | |
| Thermo Scientific Nicole iS5 | Thermo Scientific | IQLAADGAAGFAHDMAZA | Instrumento |
| acción de muñeca | Burrell Scientific | 757950819 Instrument |
Referencias
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- Paolo, T., et al. An effective virtual screening protocol to identify promising p53-MDM2 inhibitors. Journal of Chemical Information and Modeling. 56 (6), 1216-1227 (2016).
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