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Preservación de la fertilidad a través de la vitrificación de ovocitos: perspectivas clínicas y de laboratorio

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DOI:

10.3791/61963

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16 de septiembre de 2021

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1Clinica Valle Giulia, GeneraLife IVF

En este artículo

Resumen

La criopreservación de ovocitos es reconocida por varias sociedades científicas internacionales como el estándar de oro para la preservación de la fertilidad en mujeres pospúrdicas. Las estrategias clínicas y de laboratorio adecuadas garantizan la máxima eficacia, eficiencia y seguridad de los tratamientos de preservación de la fertilidad.

Resumen

Preservar la fertilidad femenina es crucial en un sistema de salud multifuncional que se ocupa de la calidad de vida futura de los pacientes. La criopreservación de ovocitos es reconocida por varias sociedades científicas internacionales como el estándar de oro para la preservación de la fertilidad en mujeres pospúrdicas, tanto para indicaciones médicas como no médicas. Las principales indicaciones médicas son las enfermedades oncológicas, las enfermedades ginecológicas como la endometriosis grave, las enfermedades sistémicas que comprometen la reserva ovárica y las afecciones genéticas que implican la menopausia prematura. Este documento describe todo el trabajo clínico y de laboratorio de un tratamiento de preservación de la fertilidad al delinear recomendaciones para un asesoramiento objetivo y basado en la evidencia. Además, se centra en la eficacia del procedimiento y describe las estrategias más adecuadas para explotar al máximo la reserva ovárica y maximizar el número de ovocitos recuperados en el menor tiempo posible. La evaluación de la reserva ovárica, la definición de un protocolo de estimulación ideal, así como los procedimientos de recuperación, denudación y vitrificación de ovocitos se han detallado junto con los enfoques para maximizar su eficacia, eficiencia y seguridad.

Introducción

El desarrollo e implementación de un programa eficiente de criopreservación para ovocitos humanos ha sido un avance significativo en la medicina reproductiva. Según la evidencia reciente, la vitrificación es la estrategia más efectiva para criopreservar ovocitos de metafase II (MII), ya que resulta en tasas de supervivencia estadísticamente más altas en comparación con la congelación lenta, independientemente de la población de pacientes (pacientes infértiles o programa de donación de ovocitos)1,2,3. Los notables logros de la vitrificación de ovocitos llevaron a los Comités de Práctica de la Sociedad Americana de Medicina Reproductiva (ASRM) y la Sociedad de Tecnología de Reproducción Asistida (SART) a declarar que esta técnica es la más efectiva para la preservación electiva de la fertilidad en mujeres pospúbricas, tanto para indicaciones médicas como no médicas4,5,6. Las indicaciones médicas para la preservación de la fertilidad incluyen (i) cáncer y enfermedades autoinmunes que requieren terapias7 como radioterapia, quimioterapia citotóxica y terapia endocrina (cuyo efecto perjudicial sobre la reserva ovárica se asocia con la edad materna, así como con el tipo y la dosis del tratamiento); ii) enfermedades ováricas que requieran cirugía repetida o radical (como la endometriosis)8; y (iii) condiciones genéticas (por ejemplo, X-frágil) o insuficiencia ovárica prematura. Además, la preservación de la fertilidad se ha convertido en una opción valiosa para todas las mujeres que no han logrado su objetivo parental por razones no médicas (también conocida como congelación social).

Independientemente de la indicación para la preservación de la fertilidad y de acuerdo con las principales directrices internacionales sobre preservación de la fertilidad, todas las pacientes dispuestas a vitrificar sus ovocitos deben recibir el asesoramiento adecuado para estar informadas sobre sus posibilidades realistas de éxito, los costos, riesgos y limitaciones del procedimiento9,10,11,12,13. Lo más importante es que debe quedar claro que vitrificar una cohorte de ovocitos MII no asegura un embarazo, pero que ofrece una mayor probabilidad de éxito para el futuro tratamiento de fertilización in vitro (FIV), si es necesario14. En este sentido, la edad de la mujer en el momento de la vitrificación de ovocitos es sin duda el factor limitante más importante15 ya que la edad materna avanzada (AMA; >35 años) es la principal causa de infertilidad femenina16. Además de una reducción progresiva de la reserva ovárica, la AMA se asocia con un deterioro de la competencia de los ovocitos debido a vías fisiológicas defectuosas como el metabolismo, la regulación epigenética, los puntos de control del ciclo celular y la segregación meiótica17. Por lo tanto, el número razonable de óvulos para vitrificar depende principalmente de la edad materna. En mujeres menores de 36 años, se requieren al menos 8-10 ovocitos MII18 para maximizar las posibilidades de éxito. En general, cuanto mayor es el número de ovocitos vitrificados, mayor es la probabilidad de éxito. Por lo tanto, adaptar la estimulación ovárica de acuerdo con los marcadores de reserva ovárica, como los niveles de hormona antimülleriana (AMH) o el recuento de folículos antrales (AFC) es crucial para explotar completamente la reserva ovárica en el menor tiempo posible.

La seguridad de todo el procedimiento es el otro tema clave al inscribir pacientes para la preservación de la fertilidad. Los médicos deben emplear las mejores estrategias para minimizar los riesgos y prevenir (i)el síndrome de hiperestimulación ovárica (SHO) mediante el uso de enfoques seguros como el protocolo antagonista de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) seguido de un desencadenante agonista de la GnRH19 y (ii) los riesgos remotos, pero posibles, de sangrado peritoneal, lesión de las estructuras pélvicas (uréter, intestino, apéndice, nervios) o infección pélvica durante la recuperación de ovocitos. Por último, (iii) los regímenes tradicionales de estimulación se asocian con estradiol sérico suprafisiológico y, por lo tanto, no se recomiendan en enfermedades sensibles a los estrógenos como el cáncer de mama. Los protocolos que involucran inhibidores de la aromatasa (como letrozol o tamoxifeno) son más adecuados en estos casos20,21. En el entorno de laboratorio, el protocolo más extendido para la vitrificación de ovocitos sigue siendo el descrito por primera vez por Kuwayama y sus colegas2,23, que consiste en un procedimiento gradual que implica la adición gradual de crioprotectores (CPA). En la primera fase (equilibrio/deshidratación), los ovocitos se exponen en una solución de CPA que contiene 7,5% v/v etilenglicol y 7,5% v/v dimetilsulfóxido (DMSO), mientras que en la segunda fase, los ovocitos se trasladan a una solución de vitrificación con 15% v/v etilenglicol y 15% v/v DMSO, más 0,5 mol/L de sacarosa. Después de una breve incubación en el medio de la vitrificación, los ovocitos se pueden colocar en criodispositivos abiertos específicamente diseñados y finalmente sumergirse en nitrógeno líquido a -196 ° C para almacenarlos hasta su uso.

Aquí, todo el estudio clínico y de laboratorio de un tratamiento de preservación de la fertilidad se ha descrito (i) esbozando recomendaciones para un asesoramiento objetivo y basado en la evidencia, (ii) centrándose en la rentabilidad del procedimiento, y (iii) describiendo las estrategias más apropiadas para explotar plenamente la reserva ovárica y maximizar el número de ovocitos recuperados en el menor tiempo posible. Se detallará la evaluación de la reserva ovárica, la definición de un protocolo de estimulación ideal, así como los procedimientos de recuperación, denudación y vitrificación de ovocitos junto con los enfoques para maximizar su eficacia, eficiencia y seguridad. Como existen otros protocolos o adaptaciones de este protocolo en la literatura, los resultados representativos y las secciones de discusión de este manuscrito solo se aplican a este procedimiento.

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Protocolo

1. Trabajo y asesoramiento clínico

NOTA: En caso de pacientes que requieran preservación de la fertilidad por razones oncológicas, asegúrese de que no haya lista de espera para programar la consulta, y la cita se proporciona lo antes posible.

  1. Examinar la historia clínica y la documentación previa, y evaluar el estado de salud general del paciente.
  2. Registre toda la información (incluida la aprobación del oncólogo para someterse a la estimulación ovárica en caso de pacientes con cáncer) en una base de datos relacional.
  3. Proporcionar al paciente asesoramiento específico sobre la viabilidad del procedimiento. Explique los pasos del procedimiento (estimulación ovárica, recuperación de ovocitos, vitrificación de ovocitos) e infórmele sobre las posibilidades realistas de éxito (principalmente dependiendo de la edad materna y el número esperado de ovocitos MII en el momento de la recuperación de ovocitos), así como el costo y las limitaciones del procedimiento.
  4. Realizar ecografía transvaginal para obtener información sobre la reserva ovárica (es decir, AFC) y evaluar la accesibilidad de los ovarios para la recolección de óvulos.
  5. Solicite análisis de sangre para evaluar el grupo sanguíneo y el factor Rhesus, la detección de la coagulación (hemograma, protrombina, tromboplastina, fibrinógeno, proteína C, proteína S, antitrombina III, homocisteína) y enfermedades infecciosas (hepatitis B, hepatitis C, VIH, Laboratorio de investigación de enfermedades venéreas / Ensayo de hemaglutinación de Treponema pallidum).
    NOTA: En el caso de pacientes que acceden a un programa de preservación de la fertilidad por razones médicas no urgentes, una evaluación más completa puede incluir la hormona foliculoestimulante basal (FSH), la hormona luteinizante (LH), el estradiol, la AMH, el examen mamario, la prueba de Papanicolaou, el cribado genético de la coagulación (factor V de Leiden y protrombina) y el cribado TORCH (toxoplasmosis, rubéola, citomegalovirus).
  6. Solicitar una evaluación cardiológica (electrocardiograma).
  7. Recomendar asesoramiento psicológico.

2. Protocolos controlados de estimulación ovárica para la preservación de la fertilidad

NOTA: Cuando el tiempo disponible antes de comenzar el tratamiento contra el cáncer es limitado, se recomienda el protocolo de inicio aleatorio (es decir, iniciar la estimulación ovárica en cualquier momento durante el ciclo menstrual) para la estimulación ovárica en pacientes oncológicas que son candidatas para la preservación de la fertilidad. En un programa de preservación de la fertilidad por razones médicas no urgentes o sociales, es preferible la estimulación convencional que comienza en la fase folicular temprana, y la estimulación ovárica se inicia en función del ciclo menstrual. Los enfoques de estimulación ovárica controlada (COS) deben realizarse de acuerdo con las recientes directrices de la Sociedad Europea de Reproducción Humana y Embriología (ESHRE)24.

  1. Adapte el COS de acuerdo con las características de la paciente y los marcadores de reserva ovárica, principalmente la edad materna, FSH, AMH y AFC.
  2. Comience coS en el día 5 del ciclo menstrual usando FSH recombinante o urinaria con una dosis fija de 150-300 UI / día (protocolo antagonista).
    NOTA: En una población específica de pacientes con deficiencia de LH o respuesta deficiente-subóptima, se puede administrar LH adicional 75/150 UI/ día de acuerdo con la respuesta ovárica, los niveles de LH y el juicio del ginecólogo.
  3. En pacientes con enfermedades sensibles a los estrógenos, se incluyen gonadotropinas asociadas con inhibidores de la aromatasa (letrozol) desde el día 1 de la estimulación hasta el día 7 después de la recuperación de ovocitos.
  4. Administrar una dosis fija de gonadotropinas durante 4 días.
  5. Monitoree el crecimiento folicular el día 5 y luego cada 2-3 días; eventualmente, ajuste la dosis de gonadotropina.
  6. Una vez que al menos 3 folículos alcancen los 17-18 mm de diámetro, administre el desencadenante de la maduración final de los ovocitos con un solo bolo subcutáneo de agonista de la GnRH a la dosis de 0,5 ml.

3. Recuperación de ovocitos

  1. Preparación para la recuperación de ovocitos
    1. Para los materiales requeridos, consulte la Tabla de Materialesy mantenga listo el calzado y el atuendo de laboratorio, la mascarilla quirúrgica, la cubierta para el cabello, los guantes quirúrgicos, un marcador permanente no tóxico, pinzas, gasas pequeñas estériles, espéculo desechable o reutilizable, equipo de cirugía vaginal y desinfectante de superficies. Asegurar la disponibilidad de equipos de reanimación, medicamentos anestésicos para la reversión, un kit preparado para el tratamiento del shock anafiláctico y oxígeno en el quirófano.
    2. Realizar el procedimiento de recuperación de ovocitos según las recomendaciones del Grupo de Trabajo de Ecografía en Tecnologías de Reproducción Asistida (ART) de la ESHRE25.
      1. Administrar sedación o anestesia general, y antibióticos para la profilaxis.
        NOTA: En este protocolo, la sedación profunda se logró mediante la administración de propofol (cuya dosis se ajusta según el peso del paciente) y 50-100 μg de fentanilo, 1000 mg de paracetamol y ventilación asistida con máscara con oxígeno.
      2. Realice la recuperación de ovocitos utilizando una unidad de aspiración compuesta por una bomba de vacío, un tubo de recolección conectado a una aguja de un solo lumen de 17 G y un tubo colector de ovocitos. Durante la recolección, no exceda una presión de ~ 120 mmHg para evitar el riesgo de daño a los ovocitos, como la extracción de las células cúmulos o la fractura de la zona pelúcida.
      3. Calibre la temperatura de la superficie de trabajo para garantizar 37 °C en el medio de cultivo. Durante todo el procedimiento, minimice la exposición de los ovocitos incluso a temperaturas transitorias que puedan afectar su competencia de desarrollo.
      4. Al final de la recuperación de ovocitos, observe al paciente durante 3-4 h antes del alta.
  2. Quirófano
    1. Antes de entrar en el quirófano, identifique a la paciente y confirme el momento del desencadenamiento de la ovulación.
    2. Haga que la paciente se acueste en la mesa de operaciones en una posición ginecológica.
    3. Limpie la vagina / cuello uterino antes de la recuperación de ovocitos para minimizar la contaminación bacteriana.
    4. Realizar una ecografía transvaginal preliminar para evaluar la posición de los ovarios y las relaciones anatómicas con los diversos órganos y vasos sanguíneos.
    5. Bajo guía de ultrasonido, inserte una aguja de un solo lumen a través de la pared vaginal y en un folículo ovárico, teniendo cuidado de no dañar los órganos o vasos sanguíneos ubicados entre la pared vaginal y el ovario.
    6. Iniciar la aspiración desde el folículo más cercano y pasar a los más distales.
    7. Perforar todos los folículos de un diámetro mayor de 11-12 mm, realizando "movimientos de torsión" de la aguja para aspirar todo el líquido folicular, que luego se libera en un tubo estéril (fondo redondo de 14 ml) precalentado en el calentador de bloque del quirófano.
    8. Inmediatamente después de la recuperación, selle y etiquete el tubo con detalles de la identidad del paciente.
    9. Asegúrese de que la enfermera lleve el tubo al laboratorio, donde se examina inmediatamente para detectar la presencia de complejos cúmulos-ovocitos (AOC).
    10. Instruya a los embriólogos para que informen al médico del número total de AOC recuperados.
    11. Una vez que se complete el procedimiento para el primer ovario, enjuague la aguja con un medio limpio y proceda con el segundo ovario utilizando el mismo procedimiento.
    12. Después de la recuperación de ovocitos, evalúe cualquier sangrado de los ovarios o vasos sanguíneos del parametrio y líquido libre en la bolsa de Douglas.
      NOTA: Para automatizar y mejorar la eficacia de la trazabilidad de gametos y embriones a nivel clínico, se implantó en el centro un sistema electrónico de testigos(SAT) 26. Sin embargo, este protocolo no menciona el SAT, para garantizar la reproducibilidad del protocolo en cualquier laboratorio de FIV. Aún así, considere que todos los pasos del procedimiento requieren un segundo operador (es decir, un testigo) para garantizar la trazabilidad de gametos y embriones.

4. Laboratorio de FIV

  1. El día antes del procedimiento de recuperación de ovocitos
    1. Preparar tubos coleccionadores de ovocitos (consulte la Tabla de Materiales).
      1. Dispensar 1 ml de medio de FIV (consulte la Tabla de materiales)en cada tubo de recolección de ovocitos (fondo redondo, 5 ml) y cubrir con 0,2 ml de aceite mineral (consulte la Tabla de materiales)para el cultivo de embriones.
        NOTA: El número de tubos se definirá de acuerdo con el número de folículos que se espera recuperar. Cada tubo puede contener hasta 4 ACO.
    2. Selle los tubos con la tapa (primer chasquido). Etiquete los tubos con detalles del tipo de medio y la fecha de preparación. Incubar los tubos durante la noche a 37 °C en atmósfera controlada (6% CO2, 5% 02).
  2. El día de la recuperación de ovocitos
    1. Precalentar los suministros de plástico a 37 °C (platos de cultivo estériles y pipetas Pasteur).
    2. Pida a las pacientes que confirmen su identidad (nombre completo y fecha de nacimiento) y la hora del desencadenante de la ovulación. Anote en la hoja de laboratorio que se ha realizado el procedimiento de identificación (ID) y que se ha confirmado el momento del desencadenamiento de la ovulación.
    3. Saque los tubos de recolección de ovocitos de la incubadora (justo antes de que comience el procedimiento) y empuje hacia abajo la tapa para garantizar un cierre hermético. Etiquete los tubos de recolección de ovocitos con la información del paciente. Coloque los tubos de recolección de ovocitos en el calentador de bloques a 37 °C.
    4. Examine el líquido folicular en las antenas de cultivo estériles precalentadas e identifique los AOC. Una vez que se identifiquen uno o más AOC, enjuáguelos dos veces en dos gotas de medio para eliminar el líquido folicular y la contaminación de la sangre.
    5. Transfiera los AOC a los tubos de recolección de ovocitos y anote el número de AOC en el tubo. Afloje las tapas de los tubos medianos y incube rápidamente a 37 ° C en una atmósfera de 6% DE CO2, 5% O2.
    6. Repita los pasos 7 a 9 según el número de ovocitos recuperados. Actualizar la hoja de laboratorio.
      NOTA: Asegúrese de que un testigo verifique que todos los bloques de calentamiento de tubos (incluidos los del quirófano) estén vacíos y firme el cierre del procedimiento en la hoja de laboratorio.
    7. Limpie la etapa de trabajo después de completar el procedimiento.

5. Denudación de ovocitos

  1. Precalentamiento del medio tamponado con ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinatenosulfónico (HEPES) y hialuronidasa (consulte la Tabla de Materiales)a 37 °C al menos 1 h antes de comenzar.
  2. Prepare una placa de FIV de 4 pocillos (consulte la Tabla de Materiales)con 0,6 ml/pocillo de medio tamponado con HEPES precalentado (complementado con albúmina sérica humana al 5% [HSA]) cubierto con 0,3 ml de aceite mineral para cultivo de embriones, y caliente a 37 °C durante al menos 30 min.
  3. Etiquete la placa de denudación de ovocitos con detalles de la identidad del paciente.
  4. Inmediatamente antes de comenzar el procedimiento, agregue hialuronidasa al primer pozo para obtener una concentración final de aproximadamente 20 UI / ml.
  5. Coloque un número limitado de AOC (hasta 6) en el primer pozo que contenga la enzima para dispersar las células cúmulos.
  6. Para mejorar la eliminación enzimática de las células cúmulos y corona, realice la extracción de las células del cúmulo mediante el pipeteo de los ovocitos repetidamente a través de una pipeta Pasteur con un diámetro interno de aproximadamente 250 μm durante un máximo de 30 s. Después de observar la disociación celular inicial, transfiera los ovocitos al segundo pozo que contiene solo el medio tamponado con HEPES, teniendo cuidado de transportar una cantidad mínima de la enzima.
  7. Realice una denudación adicional para eliminar las células corona mediante el uso de pipetas denudación con diámetros internos decrecientes (170-145 μm). Use diámetros más bajos (135 μm) solo si es estrictamente necesario.
  8. Lave cuidadosamente los ovocitos densnudados para eliminar la enzima.
  9. Después de la denudación, examine los ovocitos bajo un microscopio invertido para evaluar su integridad y etapa de maduración. Separar los ovocitos MII de los inmaduros (vesícula germinal y metafase-I).
  10. Mueva los ovocitos MII al área de vitrificación para realizar inmediatamente la criopreservación. Actualizar la hoja de laboratorio.

6. Vitrificación de ovocitos

NOTA: Realice la vitrificación de ovocitos preferiblemente dentro de las 38 h posteriores a la recuperación de ovocitos e inmediatamente después de la denudación. El procedimiento de vitrificación descrito aquí debe realizarse a temperatura ambiente (RT) y mediante el uso de una pipeta decapante con un diámetro interior de 170 μm para no dañar los ovocitos durante la manipulación.

  1. Aproximadamente 30 min antes del procedimiento, lleve la solución de equilibrio (ES) y la solución de vitrificación (VS) a RT (25-27 °C).
  2. Etiquete adecuadamente los criodispositivos con el nombre y la identificación del paciente, la identificación del tratamiento, la fecha de congelación, el número de ovocitos y el código criobar.
  3. Llene una rejilla de enfriamiento desechable hasta la parte superior con nitrógeno líquido fresco y comience el proceso de esterilización.
  4. Etiquete la placa de vitrificación (consulte la Tabla de materiales)con el nombre y la identificación del paciente. Pida a un testigo que verifique la identificación correcta de los criodevos.
  5. Invierta cuidadosamente cada vial dos veces para mezclar su contenido antes de su uso, y prepare la tapa de una placa de Petri de 6 mm con una gota de 30 μL de medio tamponado con HEPES (con 5% de HSA) y una gota adyacente de 30 μL de ES.
    NOTA: Coloque las gotas justo antes de usar para limitar la evaporación media.
  6. Usando una pipeta decapante de 170 μm de diámetro, coloque los ovocitos (hasta 9) en la primera gota con el menor volumen posible de medio. Utilizando la pipeta decapante, crear un puente de medio entre la gota n.1 y n.2 para obtener un aumento gradual de la concentración de los CPA (Figura 1A).
  7. Incubar los ovocitos en la primera gota durante 3 minutos. Añadir una tercera gota de 30 μL de ES (n.3). Después de 3 min, transfiera los ovocitos a la segunda gota de ES y cree un puente medio entre las gotas n.3 y n.2(Figura 1B). Incubar los ovocitos en gota n.3 durante 3 min.
  8. Durante la incubación, agregue una gota de ES de 30 μL por cada criodispositivo que se utilizará (si se van a criopreservar 9 ovocitos, coloque 3 gotas de ES con 3 ovocitos en cada gota de ES). Mueva los ovocitos a una solución ES pura y déjelos durante 6-9 minutos (hasta que recuperen su tamaño inicial después de la contracción) (Figura 1C).
  9. Preparar un plato de pozo central (60 x 15 mm) con 1 mL de VS. Al final de los primeros 6 min, transfiera los ovocitos a criopreservar a la solución VS, liberando el menor medio posible. Deje los ovocitos en VS durante 1 minuto y lávelos cuidadosamente moviéndolos de la parte inferior a la parte superior del plato para eliminar el exceso de ES.
  10. Aproximadamente 10 s antes del final del minuto de incubación, coloque el criodispositivo bajo el microscopio y ajuste el enfoque en la marca negra (es decir, la punta del criodispositivo). Coloque los ovocitos en el criodevo junto a la marca negra con la cantidad mínima de VS (Figura 2A).
  11. Mueva la pipeta decapante lejos de los ovocitos, y retire el exceso de medio VS (Figura 2B) para que los ovocitos permanezcan cubiertos por una fina capa de medio (Figura 2C).
  12. Sumerja rápidamente el criodedispositivo en nitrógeno líquido, sacudiéndolo rápidamente para eliminar las burbujas de aire de su superficie. Sostenga la tapa protectora del criodevice con pinzas y llénelo con nitrógeno líquido; luego inserte el criodedispositivo en él mientras mantiene las tiras de propileno en nitrógeno líquido.
  13. Guarde el criodevice en un visiotube previamente etiquetado con la información del paciente. Actualizar la hoja de laboratorio.

7. Calentamiento de ovocitos

  1. Aproximadamente 30 min antes del procedimiento, caliente la solución de descongelación (TS), la solución de dilución (DS) y la solución de lavado (WS) a RT (25-27 °C). Invierta cuidadosamente cada vial dos veces para mezclar su contenido. Coloque 1 ml de TS en una placa de Petri del pozo central y caliéle a 37 °C durante al menos 1 h antes de comenzar el procedimiento.
  2. Etiquete todos los suministros de plástico con el nombre y la identificación del paciente y el tipo de solución. Pídale a un testigo que confirme la información del paciente sobre el criodevice.
  3. Para cada criodispositivo a calentar, prepare una placa de 6 pozos con 200 μL de DS en el primer pozo y una cantidad igual de WS en el segundo y tercer (llamados WS1 y WS2, respectivamente). Agregue solución salina tamponada con fosfato (PBS) o agua estéril en el área fuera de los pozos para evitar la evaporación.
  4. Saque el plato de TS de la incubadora y colóquelo bajo el microscopio. Ajuste el foco del microscopio al centro de la placa de Petri.
  5. Gire y retire cuidadosamente la tapa protectora del criodevice, mientras mantiene las tiras de propileno en nitrógeno líquido. Transfiera el criodedispositivo del nitrógeno líquido al TS lo más rápido posible para evitar el riesgo de desvitrificación e inicie la cuenta regresiva (1 min).
  6. Localice los ovocitos centrándose en la punta del criodevice (es decir, la marca negra). Usando una pipeta stripper, libere los ovocitos del criodevice.
    NOTA: Trate de no aspirar los ovocitos del criodevice; suelte suavemente algunos medios en ellos hasta que se muevan hacia el TS.
  7. Usando una pipeta decapante de 170 μm de diámetro, transfiera los ovocitos a DS con una pequeña cantidad de TS (para crear un gradiente) y déjelos en el DS durante 3 min. Mueva los ovocitos a WS1 de la misma manera, y déjelos durante 5 minutos. Finalmente, transfiera los ovocitos a WS2 durante 1 min.
  8. Transfiera los ovocitos a un medio de cultivo de FIV preequilibrado apropiado e incube durante 1 h antes de proceder con la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI). Actualizar la hoja de laboratorio.

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Resultados

Descripción general del programa de preservación de la fertilidad en el centro

Durante un período de 12 años (2008-2020), 285 mujeres se sometieron a al menos una recuperación de ovocitos que implicó la vitrificación de toda la cohorte de óvulos maduros recolectados. La mayoría de estas mujeres (n = 250) se sometieron a una sola recuperación, y 35 se sometieron a múltiples recuperaciones. Las razones para someterse a la recuperación de ovocitos para la vitrificación de óvulos ...

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Discusión

Consideraciones clínicas

Aunque se han explorado estrategias emergentes, como la criopreservación del tejido ovárico y la maduración in vitro, la vitrificación de ovocitos después de COS es la técnica estándar de oro para la preservación de la fertilidad. En este escenario, el número de ovocitos recuperados y criopreservados debe maximizarse en el menor tiempo posible, ya que la mayoría de las pacientes con cáncer podrían beneficiarse únicamente de un ciclo ovárico antes de q...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Collection
Equipment
Placa calienteIVF TECH
Lab MarkersSigma Aldrich
Campana de flujo laminarIVF TECHGrado A Flujo de aire
Microscopio estereoscópicoLeica LeicaM80
Termómetro
Calentador
de ensayo Incubadora trigásPanasonicMCO-5M-PE02/CO2
Bomba de vacíoCookK-MAR-5200
Consumibles
CSCM (Cultivo único continuo completo) medioFujifilm Irvine Scientific90165Medio de cultivo de FIV complementado con aceite mineral HSA
para el cultivo de embrionesFujifilm Irvine Scientific9305
Aguja de aspiración de óvulos (un solo lumen)CookK-OSN-1730-B-60
Plato PrimarioCorning353803Corning Plato Primaria Plato estándar de 100x20 mm
Tubos de fondo redondoFalcon352001Falcon 14ml Tubo de ensayo de poliestireno de fondo redondo con tapón a presión
Tubos de fondo redondoFalcon352003Tubos de recolección de ovocitos / Falcon 5ml 12x75 Tubo de ensayo de polipropileno de fondo redondo con tapón a presión
Bombilla de gomaSigma AldrichZ111589-12EA
Pipetas Pasteur de vidrio estérilHunter ScientificPPB150-100PLPipeta Pasteur Cotonate, 150mm, MEA e CE
Denudación
Equipo
asas ajustablesCookG18674Stripper 
soporte Gilson PipetmanGilson66003p20
Incubadora k-SystemCoopersurgicalG210Invicell
Marcadores de laboratorioSigma Aldrich
Campana de flujo laminarIVF TECHFlujo de aire de grado A
Microscopio estereoscópicoLeica Leica LeicaM80
Consumibles
Biopur epTIPS RackEppendorf30075331Micropipetas epTIPS Biopur 2-200 & l
Albúmina sérica humanathermoFisher Scietific9988
HialuronidasaFujifilm Irvine Scientific9010180 UI/mL de enzima hialuronidasa en placa de cultivo de FIV HTF tamponada con HEPES
(60 x 15 mm)Corning353802Corning Primaria Plato de halcón 60X15mm TC Primaria plato de cultivo celular estándar
Plato de FIV Placa de 4 pocillos con tapa deslizanteThermoFisher Scietific176740Multiplatos 4 pocillos (Nunc)
FIV Plato de un pocilloFalcon353653Falcon 60 x 15 mm TC tratado con pocillo central FIV
Aceite mineral para el cultivo de embrionesFujifilm Irvine Scientific9305
Medio HTF modificadoFujifilm Irvine Scientific90126HEPES-Medio tamponado
Bombilla de gomaSigma AldrichZ111589-12EA1 mL para pipetas pasteur
Vidrio estéril pipetas PasteurScientificPPB150-100PLPipeta Pasteur Cotonate, 150 mm, MEA e CE
pipeta de pelado  puntas (140 µ m)CookK-FPIP-1140-10BS-6PIPETA FLEXIPETS PER DENUDING puntas de
pipeta de pelado (130 y micro; m )CookK-FPIP-1130-10BS-7PIPETA FLEXIPETS PER DENUDING puntas de
pipeta de pelado (170 µ m)CocineroK-FPIP-1170-10BS-5PIPETA FLEXIPETS POR DESNUDING
fuerte>vitrificación
Equipo
Juego de mangos ajustablesCocineroG18674Stripper  holder
Gilson PipetmanGilsonF123601 p200
Marcadores de laboratorioSigma Aldrich
Campana de flujo laminarIVF TECHGrado A
Contenedor de acero inoxidable para rejilla de enfriamientoKitazato Contenedor denitrógeno líquido para vitrificación
estereoscópicoLeica LeicaM80
Consumibles
Biopur epTIPS RackEppendorf30075331Micropipetas epTIPS epTIPS Biopur 2-200 µ L
Albúmina de suero humanoFujifilm Irvine Scientific9988
Placa de cultivo de FIV (60 x 15 mm)Corning353802Corning Primaria Plato de halcón 60 x 15 mm TC Primaria placa de cultivo celular estándar
Placa de FIV 6 pocillosOosafeOOPW-SW02OOSAFE  PLATO DE 6 POCILLOS CON SOPORTE PARA PAJITA
Medium HTF modificadoFujifilm Irvine Scientific90126HEPES-Buffered medium
stripping tips (170 µ m)CookK-FPIP-1170-10BS-5PIPETA FLEXIPETS PER DENUDING
Kit de congelación de vitrificaciónFujifilm Irvine Scientific90133-so2 viales de ES (solución de equilibrio, 2 x 1 mL) y 2 viales de VS (solución de vitrificación, 2 x 1 mL)
VitrifitCoopersurgical Origio42782001AVitriFit  Caja
Calentamiento
Equipo
Juego de manijas ajustables FlexipetCocineroG18674Soporte para strippers
Gilson PipetmanGilsonF123601p200
Incubadora k-SystemCoopersurgicalG210Invicell
Marcadores de laboratorioSigma Aldrich
Campana de flujo laminarIVF TECHGrado A Depósito
de acero inoxidable para gradilla de refrigeraciónKitazato Contenedor denitrógeno líquido para vitrificación
Microscopio estereoscópicoLeicaLeica M80
Consumibles
Biopur epTIPS RackEppendorf30075331Micropipetas epTIPS epTIPS Biopur 2-200 µ L
Medio: CSCM (Cultivo único continuo completo)Medio Fujifilm Irvine Scientific90165Medio de cultivo de FIV complementado con placa de cultivo de FIV HSA
(60 x 15 mm)Corning353802Corning Primaria Plato Falcon 60X15mm TC Primaria plato de cultivo celular estándar TC Primaria
Plato de FIV Placa de 4 pocillos con tapa deslizanteThermoFisher Scietific176740Multiplatos 4 pocillos (Nunc)
Plato de FIV Oosafe de 6 pocillosOOPW-SW02OOSAFE®   PLATO DE 6 POCILLOS CON SOPORTE PARA PAJITA
Aceite mineral para el cultivo de embrionesFujifilm Irvine Scientific9305
SAnápticas de pipeta de disparo (300µ m)CocineroK-FPIP-1300-10BS-5PIPETA FLEXIPETS POR DENUDADO
Kit de descongelación de vitrificaciónFujifilm Irvine Scientific90137-so4 viales de TS (solución de descongelación, 4 x 2 mL) + 1 vial de DS (solución de dilución, 1 x 2 mL) +1 vial de WS (solución de lavado, 1 x 2 mL)
de tubosCO2 incubadora Eppendorf Galaxy 14S Flexipet juego de Hunter <Temporizador electrónicoMicroscopio Temporizador electrónico

Referencias

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