Siembra celular escalonada en andamios teselados para estudiar la brotación de los vasos sanguíneos

Resumen

Los tejidos diseñados dependen en gran medida de las redes vasculares adecuadas para proporcionar nutrientes y gases vitales y eliminar los desechos metabólicos. En este trabajo, un protocolo de siembra escalonada de células endoteliales y células de apoyo crea redes vasculares altamente organizadas en una plataforma de alto rendimiento para estudiar el comportamiento de los vasos en desarrollo en un entorno 3D controlado.

Resumen

El sistema cardiovascular es un jugador clave en la fisiología humana, proporcionando nutrición a la mayoría de los tejidos en el cuerpo; los recipientes están presentes en diversos tamaños, estructuras, fenotipos, y funcionamiento dependiendo de cada tejido perfundido específico. El campo de la ingeniería de tejidos, que tiene como objetivo reparar o reemplazar los tejidos corporales dañados o faltantes, se basa en la angiogénesis controlada para crear una vascularización adecuada dentro de los tejidos diseñados. Sin un sistema vascular, las construcciones de ingeniería gruesas no se pueden nutrir suficientemente, lo que puede resultar en muerte celular, eninjerto deficiente y, en última instancia, fracaso. Por lo tanto, la comprensión y el control del comportamiento de los vasos sanguíneos diseñados es un desafío excepcional en el campo. Este trabajo presenta un sistema de alto rendimiento que permite la creación de redes de buques organizadas y repetibles para estudiar el comportamiento de los buques en un entorno de andamios 3D. Este protocolo de siembra en dos pasos muestra que los recipientes dentro del sistema reaccionan a la topografía del andamio, presentando comportamientos de brotación distintivos dependiendo de la geometría del compartimiento en el que residen los recipientes. Los resultados obtenidos y la comprensión de este sistema de alto rendimiento se pueden aplicar con el fin de informar mejores diseños de construcción de andamios bioimpresos en 3D, en los que la fabricación de varias geometrías 3D no se puede evaluar rápidamente cuando se utiliza la impresión 3D como base para entornos biológicos celularizados. Además, la comprensión de este sistema de alto rendimiento se puede utilizar para la mejora de la investigación rápida de la droga, el desarrollo rápido de los modelos de las co-culturas, y la investigación de estímulos mecánicos en la formación del vaso sanguíneo para profundizar el conocimiento del sistema vascular.

Introducción

El campo de la ingeniería de tejidos está progresando rápidamente hacia la fabricación de construcciones de ingeniería para reemplazar órganos y tejidos perdidos o dañados¹. Sin embargo, las construcciones completamente funcionales todavía tienen que ser alcanzadas, en parte, puesto que la generación de las redes vasculares operacionales para la nutrición del tejido sigue siendo un desafío excepcional. Sin la vascularización adecuada, los tejidos diseñados se limitan a un transporte de difusión pasiva de oxígeno y nutrientes, limitando el espesor máximo viable del tejido al límite de difusión, aproximadamente 200 μm^2. Tales espesores no son adecuados para reparar defectos tisulares grandes o para la fabricación completa de órganos, lo que hace que la presencia de una red vascular funcional sea una característica obligatoria para los tejidos funcionales e implantables³.

El sistema vascular se compone de una amplia variedad de vasos sanguíneos, con diversos tamaños, fenotipos, y organización, estrechamente relacionados con el tejido del anfitrión. Comprender el comportamiento, la respuesta y las decisiones de migración tomadas por los vasos en desarrollo y germinación puede indicar su integración en los tejidos de^{ingeniería 4}. Actualmente, el enfoque más común para crear redes vasculares in vitro es la combinación de células endoteliales (CE) con células de apoyo (SCs, con la capacidad de diferenciarse en células murales), sembradas dentro de un micro-ambiente tridimensional. Este entorno proporciona señales químicas y físicas para permitir que las células se adhieran, proliferen y seautoensamblan en redes de vasos^2,5,6,7,8. Cuando se co-cultivan, los SCs secretan proteínas de la matriz extracelular (ECM) mientras proporcionan soporte mecánico a los CE, que forman las estructuras tubulares. Además, una interacción cruzada entre ambos tipos de células promueve la tubulogénesis, la brotación de vasos y la migración, además de la maduración y diferenciación de las SCs en células murales que expresan actina muscular α (αSMA)^4. El desarrollo de redes de buques se estudia más comúnmente en entornos 3D creados con hidrogeles, andamios poliméricos porosos o una combinación de ellos. Esta última opción proporciona igualmente un entorno amigable con las células y el soporte mecánico requerido tanto para las células como para el ECM^9.

Se ha llevado a cabo una gran cantidad de trabajo para estudiar el desarrollo vascular, incluyendo el co-cultivo de las células en hidrogeles^10,combinaciones hidrogeles-andamios^11,12,plataformas 2D, y dispositivos microfluídicos^13. Sin embargo, los hidrogeles pueden ser fácilmente deformados por las fuerzas ejercidas por las células^14,mientras que los sistemas 2D y microfluídicos no logran recrear un ambiente más cercano a la naturaleza para obtener una respuesta más extrapolable^15,16. Comprender cómo reaccionan los buques en formación a su entorno circundante puede proporcionar información crítica que podría permitir la fabricación de entornos de ingeniería con la capacidad de guiar el desarrollo del buque de una manera predecible. Comprender los fenómenos de formación vascular es especialmente crítico para mantener el ritmo de la rápida aparición de técnicas de fabricación a escala submicrónica a micron, como la estereolitografía, la litografía de proyección digital, la producción continua de interfaces líquidas, la escritura de electroayección de fusión 3D, la escritura de electrorreactor 3D basada en soluciones y las técnicas emergentes de bioimpresión^{17,18,19,20,21.} Alinear el control de estas técnicas de microfabricación con una comprensión más profunda de la biología vascular es clave para la creación de una vasculatura de ingeniería adecuada para un tejido diana.

Aquí, presentamos un sistema 3D para estudiar la respuesta de los nuevos vasos de conformado y brotación a la geometría del andamio circundante, observando su origen de brote y posterior migración^22. Mediante la utilización de andamios 3D con geometrías compartimentales teseladas, y una técnica de siembra de dos pasos, tuvimos éxito en crear redes vasculares altamente organizadas de una manera clara y fácil de analizar. Las geometrías teseladas proporcionan un sistema de alto rendimiento con unidades individuales que contienen buques que responden a su entorno local. Utilizando ECs multicolores, rastreamos los orígenes de la formación de brotes y los patrones de migración posteriores, correlacionados con la geometría del compartimiento y la ubicación de los SCs^22.

Aunque el protocolo propuesto se ha preparado para analizar los efectos de las señales geométricas sobre el comportamiento de vascularización, este enfoque se puede ampliar y aplicar a una variedad de nuevas aplicaciones. El andamio teselado y las redes fácilmente perceptibles permiten el análisis directo de la interacción de diferentes CE y SCs, la adición de células orgánicas específicas y su interacción con las redes vasculares, el efecto de los fármacos en las redes vasculares y más. Nuestro sistema sugerido resulta muy versátil y de fabricación y procesamiento simple.

Protocolo

1. Fabricación de andamios teselados

NOTA: La fotolitografía es una técnica generalizada que requiere equipos especializados que normalmente se encuentran dentro de una instalación de nanofabricación / laboratorio. El método establecido en este protocolo se generalizó tanto como fue posible para la audiencia; sin embargo, pueden ser necesarios ligeros cambios en los procedimientos dependiendo del equipo disponible para el lector. Recomendamos realizar estos procedimientos en una sala limpia en una instalación de nanofabricación para garantizar la más alta calidad del proceso. Antes de comenzar, obtenga acceso a un alineador de máscaras (o alguna configuración de exposición a los rayos UV), un recubridor de espín, placas calientes, una estación de lavado de solventes, una fotomáscara y un limpiador de plasma. Los disolventes y productos químicos utilizados en el procedimiento son peligrosos, así que por favor tome el mayor cuidado para evitar cualquier exposición química. Al diseñar la fotomáscara, identifique qué tamaño de obleas de silicio y fotomáscaras son compatibles con el recubridor de espín y el alineador de máscaras. Además, el fotorresistencia situado hacia los bordes de la oblea de silicio se deforma típicamente de la manipulación; por lo tanto, haga los diseños hacia el área central de la oblea.

1. Prepare andamios utilizando una técnica de fotolitografía con la geometría de interés seleccionada.
   1. Antes del recubrimiento de espín, limpie la oblea de silicio. Esto se puede hacer con limpieza por plasma o una técnica a base de solventes. Si se limpia por plasma, siga el procedimiento operativo estándar del instrumento para obtener detalles operativos. Rocíe con gas de nitrógeno comprimido e inspeccione la oblea para asegurarse de que esté libre de desechos antes del recubrimiento por espín. Esta oblea servirá como sustrato sobre el que se crean los andamios.
      NOTA: Para obtener mejores resultados, comience con una oblea fresca. Las obleas se pueden reutilar, pero deben estar libres de fotorresistentes antiguos, defectos superficiales y escombros. Es útil utilizar pinzas de oblea para la manipulación.
   2. Centre una oblea de silicio en el mandril de la recubridora de espín usando una guía. Gire brevemente la oblea para asegurarse de que se ha centrado correctamente en el mandril, ajuste según sea necesario hasta que esté correctamente centrada. Esto debe hacerse cada vez que se coloca una oblea en el recubridor de espín. Dispense 1-4 mL del reactivo de despegue sobre la oblea (esto dependerá del tamaño de la oblea). Aproximadamente 2 mL de reactivo de despegue funciona bien para una oblea de 4 pulgadas.
      1. Establezca la velocidad de propagación del recubridor de giro a 500 rpm durante 5 segundos, y la velocidad de giro a 1000 rpm durante 30 segundos, luego gire el reactivo de despegue. Inspeccione la oblea para asegurarse de que tiene un recubrimiento uniforme a través de la oblea. Cualquier escombro que quede en la oblea será muy obvio en este punto. Cualquier andamio en un área con escombros probablemente será inutilizable. Después del recubrimiento de espín, transferir a una placa caliente y hornear durante 1 minuto a 200 °C.
   3. Repita el paso anterior dos veces más para un total de tres recubrimientos.
   4. Spin-coat la oblea de silicio recubierta de reactivo de despegue con fotorresiste SU-8 2050 hasta obtener un espesor de aproximadamente 100 μm.
      1. Dispense 1 mL de resistencia por cada 25 mm de diámetro de sustrato.
         NOTA: Tenga cuidado de evitar burbujas mientras vierte la resistencia. Para SU-8 2050, verter aproximadamente un círculo de 2 pulgadas de diámetro, cuando se utiliza una oblea de silicio de 4 pulgadas funciona bien.
      2. Spin-coat el SU-8 2050. Extender a una velocidad de 500 rpm durante 5 segundos, seguido de una velocidad de giro entre 1700 a 1800 rpm para lograr aproximadamente 100 μm de espesor.
      3. Opcional: Después de girar, deje las obleas recubiertas de espín para des-gas durante la noche en una superficie nivelada protegida de la luz antes de la pre-cocción. Esto puede ayudar a eliminar la resistencia de cualquier burbuja y permitir que los defectos se nivelen.
         NOTA: El espesor real de la resistencia y los andamios resultantes pueden variar con el error del usuario y los parámetros del equipo. Por lo tanto, el espesor de los andamios debe verificarse más adelante, en el paso 1.6. Modifique los procedimientos de recubrimiento de espín en consecuencia para lograr el espesor deseado.
   5. Antes de la exposición, hornear previamente las obleas a 65 °C durante 10 min y luego a 95 °C durante 40-50 min. Antes de la exposición, pruebe la superficie de la resistencia presionando el borde con un par de pinzas para asegurarse de que ya no sea pegajosa / viscosa. Es útil sacar la oblea de la placa caliente y dejar que se enfríe durante un minuto 0.5-1 antes de evaluar la tachuela.
      NOTA: Los tiempos de rampa de temperatura lenta (calefacción y refrigeración) pueden ayudar a prevenir la deformación de los andamios.
2. Exponga el fotorresistido a la luz UV (350-400 nm) a través de una fotomáscara con una energía de exposición de 215-240 mJ/cm² para un espesor de resistencia de 85 - 110 μm. Consulte las directrices del fabricante de fotorresistencia para obtener las correlaciones recomendadas entre energía y grosor de exposición.
   1. Asegúrese de que la exposición esté correctamente calibrada de tal manera que se verifique la energía. Ajuste el tiempo de exposición según sea necesario para lograr la energía de exposición deseada. Además, los alineadores de máscaras pueden permitir diferentes modos de exposición: contacto al vacío, contacto duro, contacto suave y contacto de proximidad (los términos específicos pueden variar). Por lo general, afectarán a la resolución y la alineación de características. Los autores solían utilizar un modo de "contacto duro".
   2. Para entidades pequeñas o capas múltiples, donde la alineación importará, considere los modos de exposición y los procedimientos del alineador de máscaras con más cuidado. Asegúrese de considerar la altura de la resistencia al ajustar el valor de espesor. Consulte los procedimientos operativos estándar de su alineador de máscaras para obtener detalles de la operación.
      NOTA: El diseño de la fotomáscara determinará el tamaño de los andamios, la geometría del compartimento y el número de andamios obtenidos por lote. El uso de una fotomáscara de vidrio duro o cuarzo producirá la resolución más alta; sin embargo, una fotomáscara de película transparente de polímero blando generalmente se puede usar para estos tamaños de características grandes (>10 μm). El uso de una fotomáscara de película puede conducir a características topográficas a lo largo del eje z de los poros del andamio como resultado de una resolución de características más pobre. Esto podría potencialmente tener una influencia en el comportamiento celular. Verifique la resolución deseada consulte con quien esté produciendo la fotomáscara para asegurarse de que se logra la resolución deseada.
3. Hornear la oblea inmediatamente después de la exposición a los rayos UV a 65 °C durante 2-5 minutos y luego a 95 °C durante 8-10 minutos.
4. Desarrollar los andamios para eliminar la resistencia no desarrollada.
   1. Sumerja los andamios utilizando un bajo volumen de solución de desarrollo SU-8 durante 7-10 minutos para disolver cualquier resistencia no desarrollada.
   2. Enjuague con alcohol isopropílico (API).
   3. Oblea seca con nitrógeno comprimido.
      NOTA: Tenga cuidado durante el paso 1.4 para no causar la liberación prematura de los andamios. Los volúmenes bajos de desarrollo y el manejo suave son necesarios para lograr esto.
5. Después del desarrollo, hornear las obleas a 150 °C durante 15 min.
   NOTA: Después de hornear duro, apagar la placa caliente para permitir que las obleas se enfríen muy lentamente puede ser ventajoso para evitar la deformación / rizado de los andamios finales.
6. Opcional:Después del horno duro y antes del despegue, evalúe el espesor del andamio, ya que los andamios aún deben adherirse suavemente a la superficie de la oblea. Para este procedimiento, la perfilometría de contacto funciona bien; sin embargo, se podría emplear cualquier método apropiado.
7. Levante los andamios de la oblea.
   1. Sumerja los andamios en el desarrollador SU-8 para que despeguen inmediatamente la oblea. Si los andamios no despegar, empuje suavemente los andamios con un par de pinzas de oblea.
   2. Elimine el exceso de desarrollador.
   3. Transfiera los andamios a un nuevo recipiente y sumérjase en alcohol isopropílico. Enjuague en IPA durante un mínimo de 6 veces para asegurarse de que se ha eliminado todo el desarrollador.
8. Seque al aire los andamios durante un mínimo de una semana antes de su uso.

2. Recubrimiento de fibronectina de andamios

1. Para la desinfección, sumerja los andamios en etanol al 70% (v/v) durante un mínimo de 15 minutos, y lave 2 veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS) antes de su uso.
   PRECAUCIÓN: Los andamios SU-8 son frágiles y pueden romperse fácilmente. Se recomienda el manejo con fórceps de punta roma y curva, y deben manejarse con el más cuidado. Se puede lograr un manejo más fácil sumergiendo los andamios en líquido, para evitar interacciones electrostáticas entre los andamios y la superficie.
2. Preparar una dilución de 50 μg/mL de fibronectina humana en PBS y cubrir los andamios por adsorción de proteínas.
   1. Mezclar 1,5 μL de solución común de fibronectina (1 mg/mL) con 28,5 μL de PBS por cada andamio a sembrar. Preferiblemente, prepare solo una dilución de fibronectina que se utilizará para todos los andamios para evitar errores de pipeteo.
      1. Para 10 andamios, mezcle 15 μL de solución de fibronectina en 285 μL de PBS, lo que equivale a un total de 300 μL de dilución de fibronectina de 50 μg/mL.
   2. Coloque los andamios escasamente encima de una superficie hidrofóbica (es decir, plato de 10 cm sin cultivo de tejidos (nonTC)) y cubra cada andamio con 30 μL de la dilución de fibronectina preparada en el paso 2.2.1.
      PRECAUCIÓN: Asegúrese de que no haya burbujas atrapadas en los compartimentos de los andamios. Si las burbujas están presentes, se pueden eliminar agitando suavemente el andamio dentro de la gota o el pipeteo ligero.
   3. Substituya la tapa de la placa y coloque los andamios cubiertos de fibronectina en una incubadora con 37 °C y 100% de humedad durante un mínimo de una hora.
   4. Después de la incubación, enjuague ligeramente los andamios en PBS para eliminar los restos de fibronectina. Los andamios se pueden mantener en PBS a 4 °C hasta una semana antes de su uso.

3. Siembra de células endoteliales

1. Prepare el medio de la EC mezclando el medio básico con sus componentes correspondientes del kit del medio, incluyendo una solución antibiótico (pluma/estreptococo), suero bovino fetal (FBS), y suplementos endoteliales del crecimiento de la célula, según lo indicado por el fabricante.
2. Hacer una suspensión de células endoteliales microvasculares adiposas humanas (HAMEC) en medio CE con una concentración de 4 x 10⁶ células/mL.
   NOTA: Las imágenes en tiempo real se pueden realizar si las células endoteliales utilizadas se transfectan previamente para expresar una proteína fluorescente, o se tiñen previamente con un tinte de membrana citoplasmática no tóxico (más conocido como CE etiquetados).
3. Usando las medidas de suba, coloque un andamio recubierto de fibronectina por pocillo en un pozo de placa de 24 pocillos noTC.
4. Cubra cada andamio con gotas de 25 μL de la suspensión HAMEC. Tenga cuidado de no dejar que la suspensión fluya lejos del andamio, ya que puede dificultar la adhesión celular.
5. Poner la tapa en el plato y colocarla en una incubadora a 37 °C, 5% de_CO2 y 100% de humedad. Dejar incubar durante un mínimo de 60 minutos y un máximo de 90 minutos.
   NOTA: Durante la incubación, la colocación de la placa en una coctelera orbital dentro de la incubadora mejora la fijación celular en las paredes del andamio. La coctelera orbital debe fijarse a no más de 5 rpm.
6. Después de la incubación, llene cada pocillo con 700 μL de medio EC usando una pipeta.
   NOTA: Espere ver ECs en la parte inferior del pozo, ya que algunas de las celdas no se unen al andamio y caen a través de los vacíos del andamio.
7. Incubar los andamios endotelializados hasta que se pueda observar la confluencia de la CE usando microscopía fluorescente en las paredes del andamio (cuando se usan CE etiquetados), o durante 3 días (cuando se usan CE no etiquetadas), lo que proporciona tiempo suficiente para lograr la confluencia de la CE. Cambie el medio cada dos días.

4. Apoyar la siembra celular y el co-cultivo

1. Prepare el medio de células madre de pulpa dental (DPSC) (DPSCm) mezclando 500 mL de ácido alto modificado de Dulbecco Eagle medio (DMEM de baja glucosa), 57,5 mL de FBS, 5,75 mL de aminoácidos no esenciales (NEAA), 5,75 mL de GlutaMAX y 5,75 mL de solución de penicilina-estreptomicina-nistatina.
2. Transfiera los andamios endotelializados a una nueva placa noTC de 24 pocillos para descartar los ECs unidos a la parte inferior de los pozos usando fórceps.
   1. Deseche todos los medios de la placa actual utilizando una pipeta de 1 mL o succión al vacío. Tenga cuidado de no aplicar vacío directamente sobre el andamio.
   2. Coloque un andamio por pozo, preferiblemente en el centro del pozo para evitar correr líquido hacia las paredes debido a los efectos de tensión superficial. Seque el área que rodea el andamio con vacío ligero, pero evite el secado completo del andamio.
3. Prepare una suspensión DPSC en solución de fibrina pre-gel.
   1. Diluir soluciones de trombina y fibrinógeno con PBS hasta obtener una concentración final de 5 U/mL y 15 mg/mL, respectivamente.
   2. Preparar una suspensión 8 x 10⁶ DPSC/mL en la dilución de trombina de 5 U/mL y distribuir en eppendorfs individuales 12,5 μL de dicha suspensión por andamio a sembrar.
   3. Fije una pipeta de 5-50 μL (o similar) a 12,5 μL y llénela con la solución de fibrinógeno de 15 mg/mL.
   4. Sin quitar la punta, fije la pipeta en 25 μL. El material en la punta debe elevarse y dejar un volumen vacío hacia la abertura de la punta.
   5. Presione lentamente el botón del émbolo hasta que el líquido llegue a la abertura de la punta, pero no se filtre. Sostenga el émbolo en esta posición y coloque la punta en uno de los tubos de microcentrífuga que contienen las células en suspensión de trombina, asegurándose de que la punta esté en contacto con el líquido.
      PRECAUCIÓN: La reticulación de fibrina comenzará inmediatamente después de que la trombina y el fibrinógeno entren en contacto. El siguiente paso debe hacerse rápidamente.
   6. Suelte suavemente el botón del émbolo y dibuje la suspensión de la celda en la punta. Mezcle a fondo ambos materiales, evitando la formación de burbujas.
4. Dispense rápidamente los materiales mezclados en la parte superior de un andamio endotelializado. Repita los pasos anteriores para cada andamio, asegurándose de cambiar siempre las puntas entre usos para evitar la formación inesperada de gel de fibrina dentro de la punta.
5. Substituya la tapa de la placa e incube los andamios a 37 °C, 5% de_CO2 y 100% de humedad durante 30 minutos.
6. Después de la incubación, llene cada pocillo con 1 mL de 1:1 DPSC y medio EC.
   1. Cultivo durante 1 semana, cambiando de medio cada dos días.
   2. Durante el cultivo, se retira el medio del pozo y se obtienen imágenes de los constructos utilizando un microscopio confocal en diferentes momentos para estudiar el desarrollo vascular o cualquier otro parámetro de interés.
      Nota : este paso sólo se puede realizar si el experimento se realiza mediante ECs etiquetados. Consulte el Paso 6 - NOTA para obtener más aclaraciones.

5. Tinción inmunofluorescente para los marcadores vasculares característicos

Nota: Los pasos siguientes se pueden realizar en los mismos pozos donde se cultivaron las construcciones. Es fundamental asegurarse siempre de que las soluciones cubran completamente los andamios. Además, cuando es posible, se recomienda realizar los pasos en una coctelera orbital, aunque no es obligatorio.

1. En el día 7, deseche los medios de los pozos y enjuague los andamios agregando PBS a los pozos y retirándolo con vacío.
2. Fije los andamios añadiendo un 4% de paraformadehído durante 20 minutos. Lavar en PBS 3 veces, 5 minutos por lavado.
3. Permeabilizar las células fijas utilizando Tritón-X al 0,3% en PBS (v/v) durante 15 minutos. Lavar en PBS 3 veces, 5 minutos por lavado.
4. Prepare una albúmina sérica bovina (BSA) al 5% en solución de bloqueo de PBS (p/v) y cubra los andamios. Dejar a temperatura ambiente durante 1 hora.
   NOTA: Todas las cantidades de solución requeridas dependerán del número de andamios a teñir. Prepare las soluciones según sea necesario manteniendo las concentraciones indicadas.
5. Preparar y aplicar la solución de tinción de anticuerpos primarios.
   1. Diluya el anticuerpo del factor anti-von Willebrand del conejo (vWF) 1:150 y el anticuerpo anti-SMA del ratón 1:50 en la solución de bloqueo fresca.
      NOTA: Se pueden utilizar otros marcadores de células endoteliales, como CD31 o VE-Cadherina.
   2. Cubra los andamios con la solución de anticuerpos primarios y manténgalo a 4 °C durante la noche. Lavar en PBS tres veces, 5 minutos por lavado.
6. Prepare y aplique la solución de tinción de anticuerpos secundarios.
   1. Diluir el anticuerpo anti-ratón Cy3 de cabra 1:150 y el anti-conejo de cabra Alexa-Fluor 488 1:400 en PBS.
   2. Cubra los andamios con la solución de anticuerpos secundarios e incube durante un mínimo de 3 horas a temperatura ambiente, o a 4 °C durante la noche. Lavar 3 veces en PBS, 5 minutos por lavado. Mantenga el andamio manchado en 0.3% PFA en PBS (v / v) hasta por un mes.

6. Análisis de imágenes confocales y desarrollo de vasos de andamios

NOTA: Los siguientes pasos se pueden realizar en los andamios fijos y teñidos en el punto de tiempo final elegido o, si se utilizaron células fluorescentes, durante el período de cultivo celular sin la necesidad de terminar el experimento. Para estos últimos, se recomienda establecer puntos de tiempo específicos; este trabajo muestra el día 0 (antes de la siembra de SCs), y los días 1, 3, 5 y 7 después de la siembra de SCs (Figura 3A).

1. Imagen de los andamios utilizando un microscopio confocal con una lente 5X y un zoom de 0,5 y el rango z completo del andamio. Esto permitirá capturar 9 compartimentos separados para las geometrías cuadradas y circulares, o 8 compartimentos completos para la geometría hexagonal. Imagen de la señal fluorescente y la luz transmitida, para obtener tanto la estructura de la red del buque y la geometría del compartimiento (Figura 3A).
2. Usando ImageJ (o cualquier otro software de procesamiento de imágenes), recorte cada compartimiento individual; para este proceso, sólo los marcadores de redes vasculares son relevantes. Retire cualquier recipiente que no se encuentre dentro del área del compartimiento. Cree una proyección de máxima intensidad y guarde cada compartimento recortado individual como una imagen TIFF.
   1. En ImageJ, pulse Archivo > Abrir y seleccione la imagen TIFF deseada que contenga varios compartimentos. La imagen debe tener al menos dos canales, la red de vasos fluorescentes y la imagen de luz transmitida.
   2. En la barra de herramientas, seleccione la herramienta De selección de polígono. Seleccione el canal de luz transmitido. Haga clic en una de las esquinas del compartimiento hexagonal, en la interfaz entre el área del compartimiento y la pared del andamio, esto iniciará la definición de la máscara. Continúe haciendo clic en las siguientes esquinas en un orden secuencial hasta que se seleccione la esquina inicial, cerrando la máscara.
      Nota : esta explicación se aplica a un compartimiento hexagonal. Cuando el compartimiento sea cuadrado o circular, utilice las herramientas Rectángulo u Óvalo, respectivamente, para crear una máscara adecuada. Independientemente de la forma, siempre ajuste la máscara para seguir la pared interior del andamio.
   3. Haga clic en Analizar herramientas de > > el administrador de ROI. En el gestor de ROI (ROI, región de interés), haga clic en el botón Agregar para guardar la máscara creada. La nueva máscara aparecerá en la lista del lado izquierdo. Este paso permite que el análisis sea consistente entre diferentes imágenes.
      NOTA: En el gestor de ROI, es posible guardar un archivo con todas las máscaras creadas haciendo clic en Más > Guardar. En la ventana Guardar selección, elija un nombre y una ubicación y guarde el archivo .roi. Para recuperar la máscara, en el administrador de ROI, haga clic en Más > Abrir y elija el archivo .roi deseado.
   4. Seleccione la imagen de la red de recipientes fluorescentes y haga clic en Editar > Borrar fuera. Solo quedará la imagen contenida en la máscara, mientras que el resto será eliminada.
   5. Con la imagen de red desactivada abierta, haga clic en Imagen > Duplicar. En la ventana emergente Duplicar, escriba el nombre de la imagen. Si está seleccionada la hiperstack Duplicar, anule la selección y haga clic en Aceptar. Se creará una nueva imagen que contenga solo las redes de vasos fluorescentes recortados.
   6. Guarde la imagen recortada haciendo clic en Archivo > Guardar como > Tiff. Elija el nombre y el directorio y haga clic en Aceptar.
3. Analizar el desarrollo vascular en las imágenes recortadas.
   1. Descargue e instale el software analítico gratuito AngioTool, que proporciona herramientas cuantitativas para cuantificar una variedad de parámetros vasculares. El software se puede obtener en la siguiente dirección https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home.
   2. Establezca el valor de escala de las imágenes para obtener resultados en unidades milimétricas y cargar una imagen.
      1. Haga clic en la pestaña Configuración y rellene la Distancia en píxeles y la Distancia en mm con valores representativos de las imágenes tomadas. Utilizando los parámetros de imagen mencionados anteriormente, los valores a rellenar son 400 píxeles por 1 mm.
      2. Pulse el botón Abrir imagen y busque la imagen de interés.
   3. Elija los parámetros de análisis para cuantificar el desarrollo del buque en la pestaña Análisis.
      1. En el campo Diámetro e intensidad del recipiente, anule la selección de cualquier marcador presente del selector de rango superior y active el marcador que representa el número 3.
      2. En el campo Diámetro e intensidad del buque, en el selector de rango inferior, mueva el marcador de rango inferior a 60 y deje el fabricante de guardabosques alto en 255.
      3. Active el cuadro Quitar partículas pequeñas y establezca el marcador en 100.
      4. En el campo Preferencias de guardado, seleccione el nombre y la ubicación del archivo de hoja de cálculo en el que se guardarán los resultados y pulse el botón Ejecutar análisis. Si se selecciona el cuadro Guardar imagen de resultado, Angiotool generará y guardará una nueva imagen jpeg que muestre los parámetros cuantificados de la red de buques.
         Nota : para cada análisis realizado sin cambiar el nombre de archivo de hoja de cálculo, se añadirá una nueva fila en la parte inferior del archivo, con los resultados recién adquiridos.
4. Organice los datos y ejecute un análisis estadístico.
   1. Para todas las imágenes procesadas, elija el parámetro de interés de la hoja de cálculo (por ejemplo, Eslora totaldel buque y Área del buque) e inscítelos en un software de análisis estadístico para estudiar adecuadamente los resultados obtenidos(Figura 3C).

7. Imágenes de lapso de tiempo para la detección de origen de la brotación y el seguimiento de la migración

1. Alternativamente, para cultivar los andamios en la incubadora como se describe en el paso 4.6, establezca una cámara de cultivo de microscopio confocal a 37 °C, 5% de CO₂ y 100% de humedad.
   1. Coloque la placa que contiene los andamios completamente sembrados en la cámara del microscopio confocal y establezca los parámetros de imagen en los valores deseados.
   2. Establezca el intervalo de toma de imágenes en 30 minutos y el tiempo total de creación de imágenes de 72 horas. Esto permitirá ejecutar el lapso de tiempo completamente sin la necesidad de un cambio de medio.
      PRECAUCIÓN: En caso de que se desee una proyección de imagen más larga del lapso de tiempo, una calibración cuidadosa de la posición se debe realizar para poder recuperar la localización original de la proyección de imagen, puesto que los cambios del medio requieren quitar la placa de la incubadora confocal y en la capilla biológica estéril.
      NOTA: El desprendimiento de los CE de las paredes del andamio y la formación de estructuras tubulares comenzará dentro de la primera hora después de la siembra de SCs (paso 4) y puede tardar hasta 50 horas en completarse. Después de la formación inicial del tubo, los nuevos brotes comenzarán a migrar al compartimento desde los vasos circundantes. La brotación y posterior remodelación de la red continuará a lo largo del experimento aproximadamente hasta el día 10, cuando las redes de buques se vuelvan estables²². Utilice esta información para elegir el punto de partida del lapso de tiempo y el paso de tiempo en consecuencia.
2. Guarde el archivo de película de lapso de tiempo completo como una secuencia TIFF.
3. Abra ImageJ y haga clic en Archivo > Importar > secuencia de imágenes y seleccione sus archivos. Esto abrirá la secuencia TIFF como una película.
4. Abra el plugin de seguimiento manual haciendo clic en Plugins > Seguimiento manual. Esto abrirá la ventana Seguimiento.
5. Observe la película y seleccione el recipiente a rastrear. Preste atención a su origen y migración.
6. Active el cuadro Mostrar parámetros e introduzca los 30 minutos para Intervalo de tiempo. La calibración x/y dependerá de la cantidad de píxeles seleccionados durante la obtención de imágenes.
7. Proceda a rastrear manualmente los recipientes de brotación desde el contorno del andamio.
   1. Pulse el botón Agregar pista. En el primer fotograma de la película, presione la ubicación de la embarcación que se va a rastrear. Después de esto, la película cambiará al siguiente fotograma automáticamente.
   2. Haga clic en la imagen del segundo marco donde se encuentra el buque. De nuevo, la película cambiará al siguiente fotograma automáticamente.
   3. Continúe con el mismo buque hasta que se haya completado el seguimiento completo de la migración.
   4. En la ventana Seguimiento, haga clic en Superponer puntos y líneas para imprimir una ruta visual de la migración del buque en la película. Esto abrirá una copia de la película con un punto que representa la posición actual del rastreador y una línea que muestra la ruta anterior.
   5. Haga clic en el botón Finalizar pista para finalizar el registro del movimiento actual del buque.
   6. Haga clic en el botón Agregar pista de nuevo para comenzar de nuevo con un nuevo recipiente. Al hacer esto, los marcadores de línea y punto cambiarán automáticamente su color para el nuevo recipiente. Repita hasta que se realice un seguimiento de todos los recipientes deseados.
      NOTA: La ubicación x/y, la velocidad del buque y la distancia movida se pueden recuperar desde la ventana emergente Resultados. Cada buque se identificará por su número de pista en la columna situada más a la izquierda. Estos datos se pueden copiar y pegar en una hoja de cálculo para realizar análisis adicionales.

Resultados

El protocolo presentado, utilizando técnicas de estereolitografía, permite la fabricación de andamios teselados hechos de fotorresistible SU-8. Se obtuvieron andamios con geometrías compartimentales distintas (cuadrados, hexágonos y círculos) y características altamente precisas y repetibles (Figura 1).

Discusión

La necesidad de una vasculatura rica dentro de los tejidos incrustados en la ingeniería es fundamental para la supervivencia de la construcción y la función adecuada¹. Aunque la ingeniería del sistema vascular ha sido el foco de una gran cantidad de investigación, queda mucho por investigar y entender²⁴. En particular, al recrear un tejido específico, la microvasculatura debe comportarse y organizarse en consecuencia¹². El enfoque más común para la g...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Angiotool freeware	NIH-CCR		Descarga gratuita en https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home
Suero de albúmina bovina Probumin	Millipore	82-045-1
Células madre de pulpa dental	Lonza	PT-5025
ECM media + kit de balas	Sciencell	#1001
Etanol 96%	Gadot-Group	64-17-5
Sellador de fibrina Evicel	Johnson& Johnson	EVB05IL	Proporciona soluciones de trombina y fibrinógeno (BAC2)
GlutaMAX	Gibco	35050061
Cabra anticuerpo Cy3 anti-ratón	Jackson	115-166-072
Cabra anti-conejo Alexa-Fluor 488	Thermo-Fisher Scientific	A11034
Células microvasculares adiposas humanas	Sciencell	#7200
Humano fibronectina	Sigma	F0895-5MG	Concentración de existencias: 1 mg/mL
ImageJ	NIH		Descarga gratuita en https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Alcohol isopropílico	Gadot-Group	67-63-0
Reactivo de despegue	Kayaku Advanced Materials, Inc	G112850	Nombre comercial Omnicoat
DMEM de baja glucosa	Industrias Biológicas	01-050-1A
Anticuerpo anti-SMA de ratón	Dako	M0851
NEAA	Gibco	11140068
solución de paraformaldehído al 4% en PBS	ChemCruz	SC-281692
Solución de penicilina-estreptomicina-nistatina	Biological Industries	03-032-1B
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Sigma	P5368-10PAK
Anticuerpo anti-vWF de conejo	Abcam	ab9378
Oblea de silicio	Silicon Valley Microelectronics (SVM)		Obleas de 4", Tipo N-1-10, 500-550 micras de espesor
SU-8 2050 fotorresistente	Kayaku Advanced Materials, Inc	Y11058
Desarrollador de SU-8	Kayaku Advanced Materials, Inc	Y020100
Tryton-X 100	BioLab LTD	57836