Artículo de método

Aislamiento Y Diferenciación De Preadipocitos Blancos Y Marrones Primarios De Ratones Recién Nacidos

DOI:

10.3791/62005

⸱

25 de enero de 2021

 ,  , 
1Department of Molecular Medicine, The Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA, 2Department of Medicine, University of Wisconsin-Madison, School of Medicine and Public Health, Madison, WI, USA

En este artículo

Resumen

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Este informe describe un protocolo para el aislamiento simultáneo de preadipocytes marrones y blancos primarios de ratones recién nacidos. Las células aisladas se pueden cultivar en cultivo e inducir a diferenciarse en adipocitos blancos y marrones completamente maduros. El método permite la caracterización genética, molecular y funcional de las células de grasa primarias en cultivo.

Resumen

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La comprensión de los mecanismos que son la base de la diferenciación y de la función del adipocyte se ha beneficiado grandemente del uso de las variedades de células blancas inmortalizadas del preadipocyte. Estas variedades de células cultivadas, sin embargo, tienen limitaciones. No capturan completamente el espectro funcional diverso de las poblaciones heterogéneas del adipocyte que ahora se saben para existir dentro de depósitos adiposos blancos. Para proporcionar un modelo más fisiológicamente relevante para estudiar la complejidad del tejido adiposo blanco, se ha desarrollado y optimizado un protocolo para permitir el aislamiento simultáneo de progenitores primarios de adipocitos blancos y marrones de ratones recién nacidos, su rápida expansión en cultivo y su diferenciación in vitro en adipocitos maduros y completamente funcionales. La principal ventaja de aislar las células primarias de los recién nacidos, en lugar de ratones adultos, es que los depósitos adiposos se están desarrollando activamente y son, por lo tanto, una rica fuente de preadipocitos proliferantes. Los preadipocitos primarios aislados mediante este protocolo se diferencian rápidamente al alcanzar la confluencia y se vuelven completamente maduros en 4-5 días, una ventana temporal que refleja con precisión la aparición de almohadillas de grasa desarrolladas en ratones recién nacidos. Los cultivos primarios preparados con esta estrategia pueden ampliarse y estudiarse con alta reproducibilidad, lo que los hace adecuados para pantallas genéticas y fenotípicas y permite el estudio de los fenotipos de adipocitos autónomos celulares de los modelos genéticos de ratón. Este protocolo ofrece un acercamiento simple, rápido, y barato para estudiar la complejidad del tejido adiposo in vitro.

Introducción

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La obesidad resulta de un desequilibrio crónico entre la toma de energía y el gasto energético. A medida que se desarrolla la obesidad, los adipocitos blancos experimentan una expansión masiva en el tamaño celular que resulta en hipoxia en el microambiente, muerte celular, inflamación y resistencia a la insulina1. Los adipocitos hipertrofiados disfuncionales no pueden almacenar adecuadamente el exceso de lípidos, que se acumulan en cambio en otros tejidos donde amortiguan la acción de la insulina2,3. Los agentes que mejoran la función del adipocyte y restauran el lípido normal que repique entre tejidos se predicen para ser beneficiosos para el tratamiento de las condiciones obesidad-asociadas caracterizadas por resistencia a la insulina tal como tipo - diabetes 2. Las pantallas fenotípicas en adipocitos utilizando líneas celulares inmortalizadas, como 3T3-L1, F442A y 10T 1/2, han demostrado ser útiles para identificar factores genéticos que regulan la adipogénesis y aislar moléculas pro-adipógenas con propiedades antidiabéticas4,5,6,7. Estas líneas celulares, sin embargo, no reflejan completamente la heterogeneidad de los tipos celulares presentes en los depósitos adiposos, que incluye subtipos blancos, marrones, beige y otros adipocitos con características únicas, todos los cuales contribuyen a la homeostasis sistémica8,9,10. Además, las variedades de células cultivadas muestran a menudo una respuesta disminuida a los estímulos externos.

En cambio, las culturas de adipocytes primarios recapitulan más exactamente la complejidad del adipogenesis in vivo, y los adipocytes primarios demuestran respuestas funcionales robustas. Los preadipocitos primarios se aíslan típicamente de la fracción vascular del estroma de los depósitos adiposos de ratones adultos11,12,13,14. Sin embargo, debido a que los depósitos adiposos de animales adultos consisten principalmente en adipocitos completamente maduros que tienen una tasa de rotación muy lenta15,16,17,este enfoque produce una cantidad limitada de preadipocitos con una baja tasa de proliferación. Por lo tanto, el aislamiento de preadipocytes de ratones recién nacidos es preferible obtener las cantidades grandes de células de rápido crecimiento que se puedan distinguir in vitro. Aquí se ha descrito un protocolo, inspirado en el trabajo inicial con adipocitos primarios marrones de Kahn et al.18 para aislar eficientemente preadipocitos blancos y marrones que pueden ser expandidos y diferenciados in vitro en adipocitos primarios completamente funcionales(Figura 1A). La ventaja de aislar las células primarias de los recién nacidos, a diferencia de los ratones adultos, es que los depósitos adiposos están creciendo rápidamente y, por lo tanto, son una rica fuente de preadipocitos que proliferan activamente17. Las células aisladas usando este protocolo tienen alta capacidad proliferativa, permitiendo el escalado rápido de culturas. Además, los preadipocitos de crías recién nacidas muestran un mayor potencial de diferenciación que los progenitores adultos, lo que reduce la variabilidad de pozo a pozo en el grado de diferenciación y, por lo tanto, aumenta la reproducibilidad.

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Protocolo

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Este protocolo sigue todas las directrices de la IACUC del Instituto de Investigación Scripps y la Facultad de Medicina y Salud Pública de la Universidad de Wisconsin – Madison.

1. Recolección y digestión de depósitos adiposos (día 1)

  1. Prepare dos tubos de 1,5 mL para cada cachorro: uno para el tejido adiposo marrón (BAT) y otro para el tejido adiposo blanco (WAT). Agregue 250 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) + 200 μL de tampón de aislamiento 2x (123 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1,3 mM de CaCl2,5 mM de glucosa, 100 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinatanosulfónico (HEPES), penicilina-estreptomicina y albúmina de suero bovino libre de ácidos grasos al 4%) a cada tubo. Mantenga las soluciones estériles y sobre hielo.
  2. Coloque las crías en cámaras pequeñas (por ejemplo, un pozo de una placa de 6 pozos) y colóquelas en el hielo hasta que se vuelvan hipotérmicas. Asegúrese de que no haya contacto directo entre las crías y el hielo. Pinchar una pata con una punta para asegurar la pérdida de conciencia, y eutanasiar a los cachorros por decapitación usando tijeras afiladas.
    NOTA: si se trabaja con diferentes genotipos, prepare un tubo adicional para recoger una biopsia de cola (corte de 3 mm) para el genotipado. Si el genotipado se realiza inmediatamente, mantenga las crías eutanasiadas en el hielo hasta la disección para recoger los depósitos adiposos.
  3. Calcule y pese la cantidad de colagenasa necesaria para digerir todos los depósitos. Añadir 50 μL de 15 mg/mL de colagenasa tipo I en tampón de aislamiento 2x a cada tubo. No resuspend la colagenasa en tampón de aislamiento hasta que todos los tejidos hayan sido recogidos.
  4. Para recolectar WAT subcutáneo, corte la piel alrededor del abdomen del cachorro (evite la ruptura peritoneal) y tire suavemente de la piel hacia abajo debajo de las piernas. Sin tomar la piel, recoja cuidadosamente el depósito de grasa, que aparecerá como un tejido transparente (P1 o más joven) o blanco (P2 y más viejo), delgado y alargado unido en el interior o en la parte superior del cuádriceps(Figura 1B). Enjuague el depósito de grasa en PBS y colóquelo en uno de los tubos que contienen 250 μL de PBS + 200 μL de tampón de aislamiento 2x. Manténgase en el hielo.
    NOTA: Los ratones P0 y P1 dan el mejor rendimiento. En las crías P0-1, el depósito de WAT subcutáneo es casi transparente. En ratones P2 y mayores, el depósito es más fácil de identificar porque ya se está volviendo blanco, lo que indica la presencia de adipocitos blancos completamente maduros, cargados de lípidos.
  5. Para recolectar BAT interescapular, tire de la piel de los omóplatos sobre la cabeza. Levante el BAT - el tejido rojo profundo entre los omóplatos - y haga cuidadosamente incisiones a su alrededor para separarlo del cuerpo (Figura 1B). Compruebe la consistencia y el color; enjuague con PBS; colocarlo en el otro tubo que contenga 250 μL de PBS + 200 μL de tampón de aislamiento 2x; y mantener en el hielo.
    NOTA: Al cosechar BAT de ratones P2 y mayores, retire cuidadosamente el tejido adiposo blanco que rodea el BAT. Consiste en una lámina delgada, suave y blanca de adipocitos ubicada entre la piel y el BAT, que es más profunda entre los omóplatos.
  6. Una vez que todos los depósitos han sido recogidos, picar suavemente cada depósito (4-6 veces) utilizando pequeñas tijeras directamente dentro de los tubos.
  7. Resuspend colagenasa tipo I en el volumen adecuado de tampón de aislamiento 2x para obtener una solución 10x stock a 15 mg/mL. Agregue 50 μL de colagenasa 10x a cada tubo, manteniendo los tubos en hielo hasta que se haya agregado colagenasa a todos los tubos.
  8. Invierta los tubos rápidamente para mezclarlos y transferirlos a un mezclador de temperatura controlada. Incubar las muestras durante 30 min a 37 °C en una coctelera (frecuencia de 1.400 rpm para una mezcla efectiva de la muestra).

2. Preadipocitos de chapado (día 1)

  1. Después de digerir los tejidos, coloque los tubos de nuevo en el hielo.
    NOTA: A partir de este paso, todo el trabajo se realiza en condiciones estériles en un gabinete de bioseguridad.
  2. Colar los tejidos digeridos a través de un colador celular de 100 μm en nuevos tubos de 50 mL. Si se trabaja solo con ratones WT, o si se conocen genotipos, aglucite las OPO pertinentes y disociadas; relrelte esto para el WATs. Para maximizar el rendimiento celular, enjuague cada tubo con 1 mL de medio de aislamiento (medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) + 20% de suero bovino fetal (FBS), 10 mM de HEPES, 1% de penicilina-estreptomicina), y filtre a través del colador celular. Si trabaja con genotipos desconocidos, vaya al paso 2.4
    NOTA: FBS es un determinante esencial de la proliferación y de la diferenciación del preadipocyte. Pruebe rigurosamente diferentes lotes de FBS para garantizar un alto rendimiento y consistencia entre lotes.
  3. Diluya las suspensiones BAT y WAT a la placa 2-3 pozos de una placa de 6 pozos para cada muestra BAT y 4-6 pozos de una placa de 6 pozos para cada muestra WAT. Por ejemplo, si se agruparon 6 BAT y 6 WATs, diluya la suspensión de celda BAT hasta 24-36 mL y la suspensión de celda WAT hasta 48-72 mL. Placa 2 mL de las suspensiones celulares por pozo.
  4. Para muestras con genotipos desconocidos, mantenga cada muestra separada; coloque un colador celular de 100 μm en la parte superior de cada pozo de una placa de 6 pozos y filtre una muestra por pozo. Enjuague el tubo con 1,5 mL de medio de aislamiento, y pásándolo a través del colador, haciendo el volumen final a 2 mL por pozo. Deseche el colador celular, coloque la tapa en la placa y transfiera la placa a la incubadora.
    NOTA: El medio en los pozos debe verse turbio debido a las células sanguíneas flotantes, los desechos celulares y los lípidos de las células lisadas.
  5. 1-1.5 h después del enchapado, medios aspirados y lavado con 2 mL de DMEM sin suero. Agitar suavemente la placa para separar las células sanguíneas del fondo de los pozos. Después de 3 lavados, añadir 2 mL de medio de aislamiento fresco, y transferir las células a la incubadora (37 °C, 5% CO2).
    NOTA: Compruebe las células bajo el microscopio. El material flotante (células sanguíneas, desechos celulares) debe ser mínimo. Los preadipocitos marrones aparecerán como pequeñas células no translúcidas, mientras que los preadipocitos blancos mostrarán una forma más alargada. Los preadipocitos marrones y blancos deben estar firmemente unidos a la placa.

3. Expansión del cultivo de preadipocitos (día 2 al día 5)

  1. Al día siguiente, aspire el medio, lave las células con 2 mL de DMEM sin suero y vuelva a añadir 2 mL del medio de aislamiento.
  2. Repita el paso 3.1 una vez cada 2 días hasta que las células alcancen una confluencia del 80-90%.
    NOTA: Para los preadipocitos marrones primarios, alcanzar la confluencia del 80-90% puede tomar 4-5 días. Para los preadipocitos blancos primarios, por lo general toma 2-3 días. Una vez que los preadipocitos alcanzan una confluencia del 60%, pueden infectarse eficientemente con partículas virales para experimentos de derribo o sobreexpresión. Infectar preadipocitos con una carga viral adecuada durante un período de hasta 8 h. Se desaconseja el uso de polímeros catiónicos para aumentar la eficiencia de la infección, ya que a menudo resulta en toxicidad y en una reducción significativa del potencial adipogénico de los preadipocitos infectados.
  3. Para dividir las células, recubre nuevas placas de destino utilizando una solución estéril de gelatina al 0,1% p/v (disuelta en agua destilada; no utilice calor). Utilice suficiente volumen para cubrir la parte inferior del pozo / plato. Incubar placas a 37 °C hasta que las células estén listas para ser sembradas (al menos 10 min).
    Nota : este paso es opcional. El recubrimiento de las placas de cultivo celular no afecta el rendimiento o el potencial de diferenciación, pero simplifica sustancialmente el mantenimiento y el manejo de los adipocitos diferenciadores.
  4. Cuando las células alcanzan la densidad subconfluente (85-95%), aspirar el medio, lavar con PBS, y añadir tripsina durante 3 min para separar las células. Bloquee la actividad de la tripsina agregando 2.5x volumen de tripsina de medio de aislamiento. Pipetee la suspensión de la célula hacia arriba y hacia abajo para maximizar la recuperación de la célula, y la transferencia en un nuevo tubo. Lavar los pozos con 1 mL de medio de aislamiento, y añadirlo a la primera recolección.
  5. Centrifugar las células durante 5 min a 800-1200 × g,aspirar el sobrenadante, y resuspend las células en 3-5 mL del medio de aislamiento. Cuente las células y diluyalas hasta la densidad final deseada.
    NOTA: Por ejemplo, 50,000-80,000 células/mL (2.5, 1 y 0.5 mL para placas de 6, 12 y 24 pozos, respectivamente) resultarán en pozos completamente confluentes dentro de 72-96 h.
  6. Aspirar la solución de recubrimiento en el paso 3.3 y lavar el exceso de gelatina con PBS. Sembrar las células, y devolver las placas a la incubadora hasta que estén completamente confluidas.

4. Diferenciación de preadipocitos blancos y marrones (días 7 - 12)

  1. Cuando los preadipocitos se vuelven confluentes, aspirar el medio, y reemplazarlo con el medio de diferenciación que consiste en 10% FBS en DMEM que contiene 170 nM insulina, 1 μM dexametasona, y 0,5 mM 3-isobuthyl-1-methylxantine. Si diferencia los preadipocitos BAT, agregue también 1 nM triyodotironina (T3). Marque el día en que se induce la diferenciación adipógena como el día 0 de la diferenciación.
    NOTA: Los preadipocitos blancos y marrones pueden diferenciarse espontáneamente al alcanzar la confluencia. Sin embargo, para maximizar la diferenciación del adipocyte, el cóctel favorable-adipogenic tradicional descrito arriba (más el T3 para los preadipocytes del PALO) debe ser utilizado.
  2. Después de 48 h (día 2 de diferenciación), refresque el medio con el medio de mantenimiento que consiste en el 10% FBS en DMEM y la insulina de 170 nano (más 1 nano T3 para el PALO).
    NOTA: El día 2, las pequeñas gotitas del lípido que se acumulan en las células debajo del microscopio se pueden observar usando el campo brillante estándar.
  3. Repita el paso 4.2 una vez cada 2 días hasta que se utilicen células para experimentos.
    NOTA: En el día 4 o 5 de diferenciación, la mayoría de las células aparecerán cargadas de lípidos. Los adipocitos terminalmente diferenciadores se pueden mantener en cultivo por más tiempo o utilizarse en esta etapa para experimentos.

5. Re-chapado para experimentos de bioenergética

NOTA: Si la intención es realizar estudios bioenergéticos en adipocitos maduros en el formato de 96 pozos, se deben tomar los siguientes pasos. Idealmente, se deben usar células que acaban de diferenciarse completamente (día 4 o 5). El procedimiento descrito a continuación comienza a partir de 1 pozo de una placa de 6 pozos.

  1. Antes de la digestión de la tripsina, prepare el recubrimiento para placas de 96 pocillos. Añadir 50 μL de gelatina al 0,1% a cada pozo. Deje la placa en una incubadora de cultivo de tejidos hasta que las células estén listas para ser sembradas.
  2. En el día 4 o 5 de diferenciación, aspirar el medio, lavar con 1 mL de PBS, y añadir 300 μL de 0,25% de tripsina-etilendiamina tetraacético ácido (para 1 pocillo de una placa de 6 pocillos). Incline suavemente la placa para asegurarse de que la tripsina cubra completamente la parte inferior del pozo; incubar durante 2 min a temperatura ambiente. Bloquee la acción de la tripsina con 700 μL de medio de mantenimiento, pipetee hacia arriba y hacia abajo para maximizar la recuperación celular, y transfiera la suspensión celular a un nuevo tubo de 1,5 mL.
  3. Centrifugar las células a 1200 × g durante 5 min. Retire el sobrenadante, resuspend el pellet en 1 mL de medio de mantenimiento, y contar las células.
    NOTA: Un pozo de una placa de 6 pozos debe producir aproximadamente 1.5-1.8 millones de células.
  4. Diluya las células para tener una concentración final de 60.000 a 80.000 células/mL para los adipocitos marrones y de 100.000 a 120.000 células/mL para los adipocitos blancos. Placa 100 μL de la suspensión celular por pozo en placas de 96 pozos recubiertas de gelatina.
    NOTA: Un pozo de una placa de 6 pozos proporciona suficientes células para hasta dos placas de 96 pozos. Para los experimentos de bioenergética, se necesita chapado de baja densidad (30-40% de confluencia) para permitir la medición precisa del consumo de oxígeno y evitar el agotamiento de oxígeno en los pozos durante el ensayo.
  5. Deje que las células se adhieran a la parte inferior de la placa durante al menos 48 h. Si las células se mantienen en la placa durante más de 48 h, refresque el medio después de 2 días.
  6. El día del ensayo, aspire el medio y reemplácelo por un medio de ensayo. Incubar durante 1 h a 37 °C en una incubadora no controlada por CO2,y realizar el ensayo según las instrucciones del fabricante.

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Resultados

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La sección 1 del protocolo producirá una suspensión heterogénea de células que son visibles bajo un microscopio de luz estándar. El filtrado de tejidos digeridos con un colador celular (sección 2) eliminará el tejido no digerido. Sin embargo, algunos desechos celulares, células sanguíneas y adipocitos maduros pasarán a través de (Figura 1C). Los lavados suaves 1 h después del revestimiento eliminarán las células no relevantes, ya que los preadipocitos se unen...

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Discusión

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El tejido adiposo es crítico para la sensibilidad sistémica a la insulina y la homeostasis de la glucosa20. la disfunción obesidad-ligada del adipocyte se asocia firmemente al inicio del tipo - diabetes 2. Por lo tanto, una mayor comprensión de la biología y de la fisiología básicas del tejido adiposo puede permitir el diseño de nuevos tratamientos para los desordenes metabólicos. Como complemento al análisis funcional y transcripcional directo de adipocitos maduros aislados de depósitos de grasa<...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Los autores agradecen a Cristina Godio en el Centro Nacional de Biotecnología en Madrid, España, Mari Gantner en el Scripps Research Institute, La Jolla, y Anastasia Kralli en la Universidad Johns Hopkins, Baltimore, por la ayuda para optimizar este protocolo basado en el trabajo inicial de Kahn et al.18. Este trabajo fue financiado por las subvenciones DK114785 y DK121196 de los NIH a E.S.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
3-isobutil-1-metilxantina (IBMX)Sigma-AldrichI7018
placas de 6 pocillosCorning353046
AdipoRed (Rojo Nilo)LonzaPT-7009
Antimicina ASigma-AldrichA8674
BenchMark Suero fetal bovinoGemini Bioproducts LLC100-106
CaCl2Sigma-AldrichC4901
Filtro de célulasFisher Scientific
Colagenasa, Tipo 1   Worthington Biochemical CorpLS004196
ddH2OSigma-Aldrich6442
DexametasonaSigma-AldrichD4902
DMEMSigma-AldrichD5030Para estudios bioenergéticos
DMEM, alta glucosa, GlutamaxGibco10569010
DPBS, sin calcio, sin magnesioGibco14190144
sin ácidos grasos BSASigma-AldrichA8806
FCCPSigma-AldrichC2920
GelatinaSigma-AldrichG1890
GlucosaSigma-AldrichG7021
HEPESSigma-AldrichH3375
Hoechst 33342InvitrogenH1399
InsulinaSigma-AldrichI6634
KClSigma-AldrichP9333
NaClSigma-AldrichS7653
NorepinefrinaCayman Chemical16673
OligomicinaSigma-Aldrich75351
Pluma/EstreptococoGibco15140122
RosiglitazonaSigma-AldrichR2408
RotenonaSigma-Aldrich557368
Caballito de mar XFe96 FluxPakAgilent Technologies102416-100Para estudios de bioenergética
pinza quirúrgicaROBOZ Surgical Instrument CoRS-5158
Tijeras quirúrgicasROBOZ Surgical Instrument CoRS-5880
ThermoMixerEppendorfT1317
triyodotironina (T3)Sigma-Aldrich642511
22363549

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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