Artículo de método

Fabricación De Plataformas Magnéticas Para La Organización A Escala De Micras De Las Neuronas Interconectadas

DOI:

10.3791/62013

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14 de julio de 2021

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1Department of Physics, Bar-Ilan University, 2Faculty of Engineering, Bar-Ilan University, 3Department of chemistry, Bar-Ilan University, 4The Institutes of Nanotechnology & Advanced Materials, Bar-Ilan University

En este artículo

Resumen

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Este trabajo presenta un enfoque ascendente para la ingeniería de las fuerzas magnéticas locales para el control de la organización neuronal. Las células similares a neuronas cargadas con nanopartículas magnéticas (MNPs) están plateadas encima y controladas por una plataforma micro-modelada con magnetización perpendicular. También se describen la caracterización magnética, la absorción celular de MNP, la viabilidad celular y el análisis estadístico.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La capacidad de dirigir las neuronas a redes neuronales organizadas tiene grandes implicaciones para la medicina regenerativa, la ingeniería de tejidos y la bio-interfaz. Muchos estudios han tenido como objetivo dirigir las neuronas utilizando señales químicas y topográficas. Sin embargo, los informes de control organizacional a escala de micras sobre grandes áreas son escasos. Aquí, se ha descrito un método eficaz para colocar neuronas en sitios preestablecidos y guiar la consecuencia neuronal con resolución a escala de micras, utilizando plataformas magnéticas incrustadas con micro-patrones, elementos magnéticos. Se ha demostrado que la carga de neuronas con nanopartículas magnéticas (MNPs) las convierte en unidades magnéticas sensibles que pueden ser influenciadas por gradientes magnéticos. Siguiendo este enfoque, se ha fabricado una plataforma magnética única en la que las células PC12, un modelo común similar a una neurona, se platearon y se cargaron con nanopartículas superparamagnéticas. Se depositaron películas delgadas de multicapas ferromagnéticas (FM) con magnetización perpendicular estable para proporcionar fuerzas de atracción efectivas hacia los patrones magnéticos. Estas células PC12 cargadas de MNP, plateadas y diferenciadas encima de las plataformas magnéticas, se unieron preferentemente a los patrones magnéticos, y la excrecencia de neurita estaba bien alineada con la forma del patrón, formando redes orientadas. Los métodos cuantitativos de la caracterización de las propiedades magnéticas, de la absorción celular de MNP, de la viabilidad de la célula, y del análisis estadístico de los resultados se presentan. Este enfoque permite el control de la formación de redes neuronales y mejora la interfaz neurona-electrodo a través de la manipulación de fuerzas magnéticas, que puede ser una herramienta eficaz para estudios in vitro de redes y puede ofrecer nuevas direcciones terapéuticas de biointerfase.

Introducción

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Micropatterning de neuronas tiene un gran potencial para la regeneración de tejidos1,2,3,4,5 y el desarrollo de dispositivos neuroelectr electrónicos6,7,8. Sin embargo, el posicionamiento a escala micronescular de las neuronas a alta resolución espacial, como en los tejidos biológicos, plantea un desafío significativo. La formación de estructuras prediseñadas a esta escala requiere la guía de los procesos de las células nerviosas mediante el control local de la motilidad del soma y la excrecencia axonal. Estudios anteriores han sugerido el uso de señales químicas y físicas9,10,11,12 para guiar el crecimiento neuronal. Aquí, un nuevo enfoque se centra en el control del posicionamiento celular mediante gradientes de campo magnético13,14,15,16,17,convirtiendo las células cargadas con MNPs en unidades sensibles magnéticas, que pueden ser manipuladas remotamente.

Kunze et al., que caracterizaron la fuerza necesaria para inducir respuestas celulares utilizando células cargadas con chip magnético y MNP, demostraron que el alargamiento axonal temprano puede ser desencadenado por la tensión mecánica dentro de las células18. Tay et al. confirmaron que los sustratos microfabricados con gradientes de campo magnético mejorados permiten la estimulación inalámbrica de circuitos neuronales dosificados con MNPs utilizando colorantes indicadores de calcio19. Además, Tseng et al. unieron nanopartículas dentro de las células, dando lugar a fuerzas localizadas mediadas por nanopartículas que se acercaron a la tensión celular20. Esto condujo a la fabricación de patrones definidos de sustratos micromagnéticos que ayudaron a estudiar la respuesta celular a las fuerzas mecánicas. La tensión celular derivada de la aplicación de fuerzas localizadas mediadas por nanopartículas se logró mediante la fusión de nanopartículas dentro de las células20. Un sistema híbrido microfluídico-semiconductor complementario de óxido metálico (CMOS) fue desarrollado por Lee et al., quienes integraron una matriz de microelectroimanes en el chip CMOS para controlar el movimiento de células individuales etiquetadas con perlas magnéticas21.

Utilizaron almohadillas magnéticas preprogramadas a microescala como "puntos calientes" magnéticos para localizar las células22. La actividad específica también podría estimularse dentro de las células utilizando matrices magnéticas micro-modeladas para localizar nanopartículas en ubicaciones subcelulares específicas23. La absorción celular de MNP se ha demostrado con éxito en las neuronas primarias de sanguijuela, rata y ratón24,25,26. Aquí, esto se ha demostrado en una línea celular del feocromocitoma pc12 de la rata, que se ha divulgado previamente para demostrar la alta absorción de MNPs27. En los últimos años, ha habido varias aplicaciones médicas de los MNPs, incluyendo la administración de fármacos y la termoterapia en tratamientos contra el cáncer28,29,30,31. En concreto, los estudios se ocupan de la aplicación de MNPs y redes neuronales32,33,34,35. Sin embargo, la organización magnética de las neuronas que utilizan MNPs a nivel unicelular merece una mayor investigación.

En este trabajo, se ha descrito un enfoque ascendente para diseñar fuerzas magnéticas locales a través de plataformas prediseñadas para controlar la disposición neuronal. Se ha presentado la fabricación de patrones a escala micron de multicapas fm. Esta estructura única de múltiples capas de FM crea una magnetización perpendicular estable que resulta en fuerzas de atracción efectivas hacia todos los patrones magnéticos. A través de la incubación, los MNPs se cargaron en células PC12, transformándolas en unidades magnéticas sensibles. Las células cargadas de MNP, plateadas y diferenciadas sobre las plataformas magnéticas, se unieron preferentemente a los patrones magnéticos, y la consecuencia de la neurita se alineó bien con la forma del patrón, formando redes orientadas. Se han descrito varios métodos para caracterizar las propiedades magnéticas de las multicapas fm y los MNPs, y también se han presentado técnicas para la absorción celular de MNP y ensayos de viabilidad celular. Además, se detallan los parámetros morfométricos del crecimiento neuronal y el análisis estadístico de los resultados.

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Protocolo

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NOTA: Realizar todas las reacciones biológicas en un gabinete de bioseguridad.

1. Fabricación de plataformas magnéticas

  1. litografía
    1. Corte las diapositivas de vidrio en 2 x 2 cm2 usando una pluma de escribano. Limpie los portaobjetos de vidrio en acetona y luego isopropanol durante 5 minutos cada uno en un baño de ultra sonicación. Secar con nitrógeno de ultra alta pureza (UHP).
    2. Cubra el vidrio con fotorresistente usando recubrimiento de espín a 6,000 rpm durante 60 s, para alcanzar un espesor de 1.5 μm, y hornee a 100 ° C durante 60 s. Exponga la muestra a una fuente de luz, utilizando una longitud de onda apropiada para fotorresistes, con un patrón deseado, utilizando una fotomáscara o litografía sin máscara.
    3. Desarrollar durante 40 s en un revelador, diluido en agua destilada (DW) de acuerdo con las instrucciones del fabricante; lavar en DW durante 45 s y secar con gas nitrógeno UHP. Inspeccione el patrón con un microscopio óptico.
  2. Deposición de sputter
    1. Inserte la muestra en la cámara principal del sistema de deposición y espere la presión base (~ 5 × 10-8 Torr). Abra el flujo de gas; establecer el flujo de argón para la pulverización estándar (28 sccm [cm cúbico estándar por minuto) en este documento. Encienda los objetivos de sputter, luego establezca la presión de sputter en 3 mTorr.
    2. Aumente la potencia de cada objetivo hasta que se alcance la velocidad deseada.
      NOTA: Velocidad de Pd: 0,62 A/s = 1,0 nm en 16 s; Co80Fe20 Velocidad: 0,32 A/s, 0,2 nm en 6,25 s.
    3. Activar la rotación. Deposite la fm multicapa, alternando entre los objetivos Co80Fe20 y Pd, abriendo y cerrando los obturadores objetivo, respectivamente. Deposite 14 bicapas de Co80Fe20 (0,2 nm)/Pd (1,0 nm), y termine con una capa de tapado de Pd adicional de 2 nm.
    4. Despegue: Remoje la muestra en acetona durante 30 min, y enjuague con isopropanol. Luego, seque con nitrógeno UHP, y mantenga la muestra en un ambiente limpio y seco hasta su uso.

2. Caracterización del dispositivo magnético a través de mediciones de transporte

  1. Utilice un sustrato si o una corredera de vidrio con una barra magnética en forma de cruz de 100 μm de ancho, depositada con multicapas de FM (ver recuadro de la Figura 1C). Acople la muestra al soporte mediante cinta de doble cara.
  2. Usando un bonder de alambre, una 4 alambres a la muestra, uno en cada pierna del electrodo cruzado. Fije el soporte de la muestra y la muestra dentro del sistema de medición de transporte con un campo magnético para que el campo magnético sea perpendicular a la muestra. Realizar mediciones a temperatura ambiente.
  3. Realizar la medición de voltaje transversal (VT)del dispositivo; siga las marcas de la Figura 1C (recuadro): aplique una corriente de 1 mA entre los contactos 1 y 3; medir la VT entre los contactos 2 y 4; luego, aplique una corriente entre 2 y 4, y mida el voltaje entre 1 y 3. Finalmente, se calcula la diferencia entre las tensiones tanto de las mediciones como de la división por 2 para obtener VT. Utilice un sistema de conmutación para cambiar automáticamente entre las dos configuraciones de medición.
  4. Barrer el campo magnético entre 0,4 T a -0,4 T en pasos de 5 mT y medir la VT en función del campo. Trazar la resistencia transversal (VT/I) frente al campo magnético para determinar la señal hall anómala, que es proporcional a la magnetización perpendicular en la película.

3. Caracterización de MNPs y multicapas magnéticas mediante mediciones de magnetometría

  1. Medición magnetométrica para multicapas fm
    1. Deposite la multicapa FM en el sustrato Si (ver sección 1.2). Cortar la muestra en 6 cuadrados de 4 x 4 mm2 tamaño. Apile las muestras una encima de la otra y organémoslas en la cápsula perpendicular a la dirección del campo magnético (ver recuadro de la Figura 1D).
    2. Inserte la cápsula en el magnetómetro y mida la magnetización a temperatura ambiente. Barrer el campo magnético entre -0,4 T y 0,4 T.
    3. Calcule el volumen total del material magnético, considerando el espesor de la capa magnética, el tamaño de las muestras y el número de sustratos. Divida la magnetización por el volumen total del material magnético.
    4. Trazar la magnetización (por unidad de volumen) frente al campo magnético. Restar el fondo diamagnético del sustrato de la respuesta de alto campo magnético y extrapolar la magnetización de saturación de la FM de la gráfica.
  2. Medición magnetométrica para MNPs
    1. Inserte una masa designada de MNPs en una cápsula de polímero sintético. Considere un volumen mayor si mide valores de saturación de magnetización pequeños.
    2. Si los MNPs están suspendidos en un solvente, seque los MNPs dejando la cápsula abierta durante la noche. Inserte la cápsula en el magnetómetro y mida la magnetización a temperatura ambiente. Barrer el campo magnético entre -0,2 T y 0,2 T.
    3. Calcule la masa total de los MNPs multiplicando el volumen designado por la concentración de partículas. Normalizar los resultados a 1 g.
    4. Trazar la magnetización normalizada (por gramo) frente al campo magnético. Extrapolar la saturación de magnetización de los MNPs a partir del gráfico.

4. Protocolo de recubrimiento de colágeno

  1. Revestimiento de platos de plástico
    1. Preparar 0,01 M de HCl añadiendo 490 μL de HCl a 500 mL de agua de doble destilación en autoclave (DDW).
      NOTA: Realice este paso sólo en la campana química.
    2. Diluir el colágeno tipo 1 (solución de cola de rata) 1:60-1:80 en 0,01 M HCl para obtener la concentración de trabajo final de 50 μg/mL. Colocar 1,5 mL de la solución diluida en un plato de cultivo de 35 mm. Dejar el plato en la campana durante 1 h, cubierto.
    3. Retire la solución y lave 3 veces en solución salina estéril 1x tamponada con fosfato (PBS). El plato está listo para la siembra celular.
  2. Revestimiento de portaobjetos de vidrio
    1. Diluya el colágeno tipo 1 (solución de cola de rata) 1:50 en etanol al 30% v/v. Para recubrir un plato de 35 mm, añadir 20 μL de colágeno a 1 mL de etanol al 30%.
    2. Cubra el plato con la solución, y espere hasta que toda la solución se evapore, dejando el plato al descubierto durante unas horas. Lavar 3x en estéril 1x PBS; el portaobjetos de vidrio está listo para la siembra celular.

5. Captación y viabilidad del MNP celular

  1. Absorción celular de MNP
    1. Prepare el medio básico de crecimiento para el cultivo celular pc12 agregando el suero del caballo del 10% (HS), el suero bovino fetal del 5% (FBS), la L-glutamina del 1%, la penicilina/la estreptomicina del 1%, y la anfotericina del 0,2% al medio del instituto médico del parque de Roswell (RPMI), y filtre usando un filtro de nylon de 0,22 μm.
    2. Agregue suero de caballo (HS) al 1%, L-glutamina al 1%, penicilina/estreptomicina al 1% y anfotericina al 0,2% al medio RPMI para preparar el medio de diferenciación PC12 y filtre con un filtro de nylon de 0,22 μm.
    3. Cultivar células en un matraz de cultivo no tratado con 10 ml de medio de crecimiento básico; añadir 10 mL de medio de crecimiento básico al matraz cada 2-3 días, y sub-cultivar las células después de 8 días.
    4. Para la absorción celular, centrífuga la suspensión celular en un tubo de centrífuga durante 8 minutos a 200 × g y temperatura ambiente, y deseche el sobrenadante.
    5. Resuspend las células en 3 mL de medio de crecimiento básico fresco. Una vez más, centrífuga la suspensión celular durante 5 min a 200 × g y temperatura ambiente, y deseche el sobrenadante. Resuspend las células en 3 mL de medio de diferenciación fresco.
    6. Aspirar las células 10x usando una jeringa y una aguja para romper los grupos celulares. Cuente las células usando un hemocytometer, y la semilla 106 células en un plato regular sin revestir 35 milímetros.
    7. Añadir a la antena parabólica el volumen calculado de suspensión MNP y el volumen de medio de diferenciación para lograr la concentración de MNP deseada y el volumen total. Mezcle las células, los MNPs, y el medio de la diferenciación; incubar el plato en una incubadora humidificada al 5% de CO2 a 37 °C durante 24 h.
    8. Centrifugar la suspensión celular durante 5 min a 200 × g a temperatura ambiente, y desechar el sobrenadante. Resuspend las células en 1 mL del medio fresco de la diferenciación, y cuente las células usando un hemocytometer.
  2. Diferenciación celular cargada con MNP
    1. Realizar el protocolo de captación (sección 5.1). Semilla 8 × 104 células cargadas con MNP en un plato recubierto de colágeno de 35 mm, tipo l en presencia de medio de diferenciación (ver protocolo de recubrimiento de colágeno en la sección 4.1). Después de 24 h, añadir 1:100 factor de crecimiento del beta-nervio murino fresco (β-NGF) (concentración final 50 ng/mL).
    2. Renovar el medio de diferenciación y añadir β-NGF murino fresco cada 2 días. Imagen de las células cada 2 días utilizando microscopía óptica. Después de la formación de la red (6-8 días para las células PC12), la imagen de las células usando microscopia confocal, y observar la fluorescencia de las partículas.
  3. Ensayo de viabilidad para células cargadas con MNP: prueba de viabilidad celular de 2,3 bis-(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-2H-tetrazolio-5-carboxanilide (XTT).
    1. Prepare el medio de crecimiento básico de acuerdo con el paso 5.1.1. Cultivar las células PC12 con MNPs a diferentes concentraciones (0,1 mg/mL, 0,25 mg/mL y 0,5 mg/mL en medio de crecimiento básico) y también sin MNPs para el control por triplicado en una placa plana de 96 pocillos (volumen total de 100 μL/pocillo). Incubar las células durante 24 h en una incubadora humidificada al 5% deCO2,a 37 °C.
    2. Prepare pozos en blanco que contengan medio sin celdas para la corrección de fondo. Descongelar la solución de reactivo XTT y la solución de reacción que contiene N-metil dibenzopirazina metil sulfato) en un baño de 37 °C inmediatamente antes de su uso. Gire suavemente hasta que se obtengan soluciones claras.
    3. Para una placa de 96 pozos, mezcle 0,1 mL de solución de activación con 5 mL de reactivo XTT. Añadir 50 μL de la solución de reacción a cada pozo, agitar ligeramente la placa para una distribución uniforme del tinte en los pozos, y luego incubar la placa en una incubadora durante 5 h.
    4. Mida la absorbancia de la muestra contra los pozos en blanco utilizando un lector de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) a una longitud de onda de 450 nm. Mida la absorbancia de referencia utilizando una longitud de onda de 630 nm y reste de la medición de 450 nm.
    5. Como se produce una ligera absorbancia espontánea en el medio de cultivo incubado con el reactivo XTT a 450 nm, reste la absorbancia media de los pozos en blanco de la de los otros pozos. Reste los valores de la señal de muestras paralelas de MNPs en las mismas concentraciones probadas que las muestras de la célula.
  4. Ensayo de viabilidad para células cargadas con MNP: prueba de viabilidad celular basada en resazurínico
    1. Preparar el medio de crecimiento básico de acuerdo con el paso 5.1.1. Cultivar las células PC12 con MNPs a diferentes concentraciones (0,1 mg/mL, 0,25 mg/mL y 0,5 mg/mL en medio de crecimiento básico) y sin MNPs como control por triplicado en una placa plana de 96 pocillos durante 24 h. Incubar las células durante 24 h en una incubadora de CO2 al 5% a 37 °C. Prepare pozos en blanco que contengan medio sin celdas.
    2. Lave las células con 1x PBS. Añadir el reactivo a base de resazurin (10% p/v) al medio e incubar durante 2 h en una incubadora de 37 °C.
    3. Coloque 150 μL alícuotas de las muestras en el lector ELISA y mida la absorbancia a una longitud de onda de excitación de 560 nm y una longitud de onda de emisión de 590 nm. Reste los valores de la señal de las muestras paralelas de MNPs en las mismas concentraciones probadas que las muestras de la célula.

6. Caracterización de la concentración de MNP dentro de las células utilizando plasma acoplado inductivamente (ICP)

  1. Preparar el medio de crecimiento básico de acuerdo con el paso 5.1.1. Cultivar las células PC12 con MNPs a diferentes concentraciones (0,1 mg/mL, 0,25 mg/mL y 0,5 mg/mL en medio de crecimiento básico) y sin MNPs como control por triplicado en una placa plana de 96 pocillos (volumen total de 100 μL/pocillo). Incubar en una incubadora humidificada al 5% deCO2,a 37 °C durante 24 h.
  2. Transfiera la suspensión a un tubo de centrífuga (de cada pozo por separado), centrifuge las células a 200 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente y deseche el sobrenadante. Resuspend las células en 1 mL del medio fresco de la diferenciación, y cuente las células usando un hemocytometer.
  3. Lyse las células por tratamiento con 100 μL de ácido nítrico al 70% a cada pozo por separado durante al menos 15 min. Agregue 5 mL de DDW a las células deslizado y filtre las soluciones.
  4. Mida la concentración del hierro usando el ICP y utilice la cuenta de célula para registrar la concentración del FE por la célula.

7. Diferenciación celular y crecimiento en plataforma magnética

  1. Limpie el sustrato estampado con etanol al 70% v/v/ y coloque el sustrato en un plato de cultivo de 35 mm en la campana. Coloque un imán grande (~ 1500 Oe) debajo del sustrato estampado durante 1 minuto y retire el imán moviendo primero el plato hacia arriba y lejos del imán, y luego saque el imán de la campana. Encienda la luz ultravioleta durante 15 min.
  2. Recubre el sustrato con colágeno tipo 1 según la sección 4.2. Suspender las células después de la absorción celular de MNP (sección 5.1), sembrar 105 células en un plato de cultivo de 35 mm, y añadir 2 mL de medio de diferenciación. Incubar el cultivo en una incubadora humidificada al 5% deCO2,a 37 ºC.
  3. Después de 24 h, añadir 1:100 murine fresco β-NGF (concentración final de 50 ng/mL). Renovar el medio de diferenciación y añadir β-NGF murino fresco cada 2 días. Realice una imagen de las células cada 2 días utilizando microscopía de luz y, después de la formación de la red, realice inmunotensiones en las células (sección 8.1).

8. Tinción de células cargadas con MNP

  1. Inmunotenstenimiento de tubulina
    1. Prepare una solución de paraformadehído al 4% (PFA) mezclando 10 mL de solución de PFA al 16%p/v, 4 mL de PBS 10x y 26 mL de DDW. Preparar 50 mL de PBT al 1% añadiendo 500 μL de un surfactante no iónico a 50 mL de 1x PBS. Preparar 50 mL de PBT al 0,5% mezclando 25 mL de PBT al 1% con 25 mL de 1x PBS. Prepare la solución de bloqueo mezclando 1% de albúmina sérica bovina y 1% de suero de burro normal en PBT al 0,25%.
      NOTA: Utilice PFA sólo dentro de la campana química.
    2. Retire el medio sobrenadante de las células. Fije las células cargadas de MNP en 4% de PFA durante 15 minutos a temperatura ambiente dentro de una campana química. Lave las células cargadas de MNP 3x en 1x PBS, 5 min cada lavado, dentro de una campana química.
    3. Permeabilizar las células cargadas de MNP con PBT al 0,5% durante 10 min. Incubar las células cargadas de MNP primero en solución de bloqueo durante 45 min a temperatura ambiente y luego con anticuerpos anti-α-tubulina de conejo en solución de bloqueo durante la noche a 4 °C. Lave las células cargadas de MNP 3x en 1x PBS, 5 min cada lavado.
    4. Incubar las células cargadas con MNP con anticuerpo secundario anti-conejo de burro conjugado con Cy2 durante 45 min en la oscuridad y a temperatura ambiente. Lave las células cargadas de MNP 3x en 1x PBS, 5 min cada lavado.
    5. Realizar imágenes confocales. Para la tubulina, utilice una longitud de onda de excitación de 492 nm y una longitud de onda de emisión de 510 nm. Para los MNPs (rodamina), utilice una longitud de onda de excitación de 578 nm y una longitud de onda de emisión de 613 nm.
  2. Tinción nuclear con 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)
    1. Lave las células cargadas de MNP 3x en 1x PBS, 5 min cada lavado. Retire el exceso de líquido alrededor de la muestra, agregue 1 gota (~ 50 μL) de medio de montaje que contenga DAPI para cubrir un área de 22 mm x 22 mm, e incube durante 5 min en la oscuridad y a temperatura ambiente.
    2. Lave las células cargadas de MNP 3x en 1x PBS, 5 min cada lavado. Realizar imágenes confocales. Para DAPI, utilice una longitud de onda de excitación de 358 nm y una longitud de onda de emisión de 461 nm. Para los MNPs (rodamina), utilice una longitud de onda de excitación de 578 nm y una longitud de onda de emisión de 613 nm.

9. Mediciones y análisis estadísticos

  1. Análisis morfométrico de la diferenciación celular cargada de MNP
    1. Para medir el número de intersecciones a varias distancias del cuerpo celular, adquiera imágenes de fase de células cultivadas hasta 3 días después del tratamiento con NGF.
      NOTA: Si se hace más tarde, las células pueden desarrollar redes, lo que impide las mediciones de resolución unicelular.
      1. Abra las imágenes en el programa de procesamiento de imágenes, ImageJ, y utilice el plug-in NeuronJ, que permite un trazado de neurita semiautomático y medición de longitud36. Utilizando el plug-in de trazador de neurita, rastree las neuritas y convierta los datos en imágenes binarias. Defina el centro del soma.
      2. Realizar análisis Sholl, disponible en el plug-in NeuronJ. Defina el radio máximo. Repita el experimento tres veces. Analice más de 100 células en cada experimento.
  2. Análisis de localización celular
    1. Para determinar el porcentaje de células localizadas en el área magnética después de 3 días de incubación, adquiera imágenes microscópicas confocales de células con y sin absorción de MNP. Utilizar tinción DAPI (sección 8.2).
    2. Cuente manualmente las celdas encima o parcialmente encima del patrón (celdas táctiles) y las celdas que no lo están. Repita para tres experimentos. Analizar más de 400 células con MNP y sin captación.
    3. Calcule la proporción relativa de las células que están encima de los patrones magnéticos a partir del número total de células, con y sin MNPs. Además, calcule el porcentaje del área efectiva del patrón magnético agregando el diámetro del cuerpo de la celda al ancho del patrón para determinar la probabilidad aleatoria de que las células aterrice en un patrón magnético.
    4. Realice una prueba Zde una sola muestra para analizar si la distribución celular es el resultado del aterrizaje de células isotrópicas, o si hay un sesgo preferido al patrón magnético.
  3. Análisis de direccionalidad de crecimiento
    1. Para cuantificar el efecto sobre la direccionalidad de la consecuencia de la neurita, adquiera imágenes microscópicas confocales de las células con y sin el tratamiento de MNP después de 8 días de incubación. Realizar inmuno-tinción (sección 8.1).
    2. Usando el software ImageJ, mida el ángulo entre la neurita celular y las bandas magnéticas en ambas condiciones.
      NOTA: Analice sólo las neuritas que se originan en somas ubicados en las bandas magnéticas.
    3. Trazar la distribución de los ángulos de las neuritas en relación con la dirección de las rayas (Δθ). Realizar una prueba de Chi cuadrado de la distribución de Δθ para demostrar que la distribución no es normal o uniforme.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se fabricaron plataformas magnéticas con diferentes formas geométricas (Figura 1A). Los patrones magnéticos fueron depositados por sputtering: 14 multicapas de Co80Fe20 y Pd, 0,2 nm y 1 nm, respectivamente. La microscopía electrónica reveló que la altura total de los patrones magnéticos era de ~18 nm (Figura 1B). Esta única deposición multicapa fm crea una plataforma estable con anisotropía de magnetización ...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los resultados representativos demuestran la eficacia de la metodología presentada para controlar y organizar la formación de redes neuronales a escala de micras. Las células PC12 cargadas con MNP siguieron siendo viables y se transformaron en unidades sensibles magnéticas que fueron atraídas por las fuerzas magnéticas de los electrodos fm a sitios específicos. Esto se demuestra mejor en la Figura 5C,donde las celdas se adhirieron preferentemente a los vértices más grandes de los hexágonos y...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta investigación fue apoyada por el Ministerio de Ciencia y Tecnología de Israel y por la Fundación Israelí para la Ciencia (569/16).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Solución acuosa de paraformaldehído (formaldehído) al 16%CIENCIAS DE LA MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA15710
placa de cultivo celular de 6 pocillosFALCON353846
placa de cultivo celular de 96 pocillosSPL ciencias de la vida30096
Solución de anfotericina BIndustrias Biológicas03-028-1B
AZ 1514H fotorresistenteMicroChemicals
AZ 351 B reveladorMicroChemicals GmbH
Albúmina sérica bovina (BSA)Biological Industries03-010-1B
Matraz de cultivo de células y tejidosBiofil TCF00225075.0 cm^2 250 mL Tapón de ventilación, no tratado
Placa de cultivo celularGreiner Bio-One627-160 Kit de35 mm
(basado en XTT)Biological Industries20-300-1000
Tubo de centrífugaBiofilCFT02150050 mL
Co80Fe20 al % de pulverización catódicaobjetivo ACI Alloys99.95%
Colágeno tipo ICorning Inc.354236Cola de rata, rango de concentración 3-4 mg/mL
Microscopio confocalLeicaTCS SP5
Cy2-conjugado AffiniPure Donkey Anticuerpo secundario anti-conejoJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.711-165-152
DAPI fluoromount-GSouthernBiotech0100-20
Aguja desechableKDL23 G
Jeringa desechableMedispo116022764010 mL
Suero de caballo donanteBiological Industries04-124-1A Lector
ELISAMerk MilliporeBioTek synergy 4 hybrid lector de microplacas
Etanol 70%ROMICAL LTD19-009102-80
Etanol absoluto (deshidratado)Biolab-chemicals52505
Suero fetal bovino (FBS)Industrias Biológicas04-127-1A
Murina fresca β-NGFPeprotech450-34
GMW Electroimán de marco C .Buckley systems LTD3470, 45 mm
Ácido clorhídrico 32%DAEJUNG CHEMICAL & METALES4170-4100
ImageJInstitutos Nacionales de Salud de EE. UU., BethesdaComplemento NeuronJ
Plasma acoplado inductivamente (ICP)Ametek SpectroSPECTRO ARCOS ICP-OES, FHX22 Plasma MultiView
Keithley fuente-medida Keithley2400
Sistema de conmutación KeithleyKeithley3700
L-glutaminaIndustrias Biológicas03-020-1B
Microscopio ópticoLeicaDMIL LED
Fotolitografía sin mascarillaHeidelberg Inst.MLA150
Portaobjetos de microscopioBAR-NAORBN1042000C
Ácido nítrico 70%Sigma-Aldrich438073
Suero de burro normal (NDS)SigmaD9663
PBS 10xhylabsBP507/1LD
PC12 línea celularATCCCRL-1721
Pd objetivo de pulverización catódicaACI Alloys99.95%
Solución de nistatina de penicilina-estreptomicinaBiological Industries03-032-1B
Reactivo de viabilidad celular PrestoBlueSondas molecularesA-13261anticuerpo de conejo a base de resazurina
contra &alfa;-tubulinaSanta Cruz Biotechnology, Inc.
Sistema de pulverización catódica de magnetrón RFOrion AJA Int.Orion 8
RPMI 1640 con l-glutaminaBiological Industries01-100-1A
Baño de sonicaciónKUDOSSK3210HPFrecuencia: 53 kHz. Potencia ultrasónica: 135 W
Magnetómetro SQUIDQuantum Design, CA
Triton X-100CHEM-IMPEX INTERNATIONAL1279surfactante no iónico
viabilidad celular XTT
GmbH proliferación celular de Reactivo de

Referencias

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