Uso de la inmunofluorescencia para detectar el daño al ADN inducido por PM2.5en corazones de embriones de pez cebra

Summary

Este protocolo utiliza un ensayo de inmunofluorescencia para detectar el daño en el ADN inducido por PM_2.5en los corazones disecados de embriones de pez cebra.

Abstract

La exposición a partículas finas ambientales (PM_2.5)puede conducir a toxicidad para el desarrollo cardíaco, pero los mecanismos moleculares subyacentes aún no están claros. La 8-hidroxi-2'desoxigenasa (8-OHdG) es un marcador de daño oxidativo del ADN y γH2AX es un marcador sensible para las roturas de doble cadena del ADN. En este estudio, nuestro objetivo fue detectar cambios en PM_2.5-inducidos por 8-OHdG y γH2AX en el corazón de embriones de pez cebra utilizando un ensayo de inmunofluorescencia. Los embriones de pez cebra fueron tratados con materia orgánica extraíble (EOM) a partir de PM_2.5 a 5 μg/mL en presencia o ausencia de antioxidante N-acetil-L-cisteína (NAC, 0.25 μM) a las 2 h después de la fertilización (hpf). DMSO se utilizó como control de vehículos. A 72 hpf, los corazones se diseccionaron de embriones usando una aguja de jeringa y se fijaron y permeabilizaron. Después de ser bloqueadas, las muestras fueron sondeada con anticuerpos primarios contra 8-OHdG y γH2AX. Las muestras se lavaron e incubaron con anticuerpos secundarios. Las imágenes resultantes se observaron bajo microscopía de fluorescencia y se cuantificaron utilizando ImageJ. Los resultados muestran que la OMA de PM_2.5 mejoró significativamente las señales 8-OHdG y γH2AX en el corazón de los embriones de pez cebra. Sin embargo, NAC, actuando como un eliminador de especies reactivas de oxígeno (ROS), contrarrestó parcialmente el daño del ADN inducido por la OMA. Aquí, presentamos un protocolo de inmunofluorescencia para investigar el papel del daño en el ADN en los defectos cardíacos inducidos por PM_2.5que se pueden aplicar a la detección de cambios en la expresión de proteínas inducidas por químicos ambientales en los corazones de embriones de pez cebra.

Introduction

La contaminación del aire es ahora un grave problema ambiental que enfrenta el mundo. Las partículas finas ambientales (PM_2.5),que es uno de los indicadores más importantes de la calidad del aire, pueden transportar una gran cantidad de sustancias nocivas y entrar en el sistema circulatorio de la sangre, causando graves daños a la salud humana¹. Los estudios epidemiológicos han demostrado que la exposición a PM_2.5 puede conducir a un mayor riesgo de defectos cardíacos congénitos (CHD)^2,3. La evidencia de experimentos con animales también mostró que PM_2.5....

Protocol

El pez cebra de tipo salvaje (AB) utilizado en este estudio se obtuvo del Centro Nacional de Recursos de Pez Cebra en Wuhan, China. Todos los procedimientos de animales descritos aquí han sido revisados y aprobados por la Institución de Cuidado Animal del Comité de Ética de la Universidad de Soochow.

1. Muestreo de PM_2.5 y extracción de compuestos orgánicos

NOTA: PM_2.5 se recolectó en un área urbana en Suzhou, China, del 1 al 7 de agosto de 2015, como se describió anteriormente⁵.

1. Hornea filtros de membrana de cuarzo de 47 mm en un horno de silenciador de 500....

Results

Este ensayo de inmunofluorescencia es un método sensible y específico para medir los cambios en la expresión de proteínas en los corazones de embriones de pez cebra expuestos a productos químicos ambientales.

En este análisis representativo, se evaluaron embriones expuestos a PM_2.5 en ausencia o presencia del antioxidante NAC para la presencia de malformaciones cardíacas (Figura 1). Como .......

Discussion

Aunque el pez cebra es un excelente modelo de vertebrados para estudiar la toxicidad del desarrollo cardíaco de los productos químicos ambientales, debido al pequeño tamaño del corazón embrionario, es difícil obtener suficiente proteína para el análisis de western blot. Por lo tanto, presentamos un método de inmunofluorescencia sensible para cuantificar los niveles de expresión de proteínas de los biomarcadores de daño al ADN en los corazones de embriones de pez cebra expuestos a PM_2.5.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anticuerpo 8-OHdG	Santa Cruz Biotechnology, EE. UU.	SC-66036	Anticuerpo primario
Balanza analítica	Sartorius, China	BSA124S
BSA	Solarbio, Beijing, China	SW3015	Para bloquear
DAPI	Abcam, EE. UU	ab104139	Para contratinción nuclear.
DMSO	Solarbio,Pekín,China	D8371
Microscopio de fluorescencia	Olympus, Japón	IX73	Para la obtención de imágenes de señales de fluorescencia/
Cabra Anti-Conejo IgG Cy3	Carlsbad,EE.UU.	CW0159	Anticuerpo secundario
Cabra Anti-Conejo IgG FITC	Carlsbad,EE.UU.	RS0003	Anticuerpo secundario
N-acetil-L-cisteína(NAC)	Adamas-Beta, Shanghai, China	616-91-1
Agitador orbital	QILINBEIER, China	TS-1
Paraformaldehído Sigma	, China	P6148	Hacer 4% de paraformaldehído para la fijación.
Solución salina tamponada con fosfato	HyClone, EE. UU.	SH30256.01	Prepare 0.1% Tween en PBS para el lavado.
Muestreador de PM2.5	TianHong, Wuhan, China	TH-150C	Para muestreo ininterrumpido de PM2.5 las 24 horas.
Sistema de acuicultura de recirculación	HaiSheng, Shanghai, China		El pez cebra se mantuvo en él.
Extractor Soxhlet	ZhengQiao, Shanghai, China	BSXT-02	Para la extracción de componentes orgánicos.
Microscopio estereoscópico	Nikon, Canadá	SMZ645	Para la disección del corazón de embriones de pez cebra.
Metanosulfonato de tricaína (MS222)	Sigma,China	E10521	Para anestesiar embriones de pez cebra
Tween 20	Sigma,China	P1379
γ Anticuerpo H2AX	Abcam, EE. UU	ab26350	Anticuerpo primario