Artículo de método

Montaje Y Operación De Un Dispositivo Acoustofluidic Para La Entrega Mejorada De Compuestos Moleculares A Las Células

DOI:

10.3791/62035

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21 de enero de 2021

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1Department of Bioengineering, University of Louisville, 2School of Medicine, University of Louisville, 3Department of Biology, University of Louisville

En este artículo

Resumen

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Este protocolo describe el montaje y la operación de un dispositivo acoustofluidic de bajo costo para la entrega molecular rápida a las células vía el sonoporation inducido por los agentes del contraste del ultrasonido.

Resumen

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La entrega intracelular eficiente de biomoléculas es necesaria para una amplia gama de investigaciones biomédicas y aplicaciones terapéuticas basadas en células. el sonoporation Ultrasonido-mediado es una técnica emergente para la entrega intracelular rápida de biomoléculas. La sonoporación se produce cuando la cavitación de microburbujas llenas de gas forma poros transitorios en las membranas celulares cercanas, lo que permite una rápida absorción de biomoléculas del fluido circundante. Las técnicas actuales para la sonoporación in vitro de células en suspensión están limitadas por el rendimiento lento, la variabilidad en las condiciones de exposición al ultrasonido para cada célula y el alto costo. Para abordar estas limitaciones, se ha desarrollado un dispositivo acoustofluidic de bajo costo que integra un transductor de ultrasonido en un dispositivo fluídico basado en PDMS para inducir la sonoporación constante de las células a medida que fluyen a través de los canales en combinación con agentes de contraste de ultrasonido. El dispositivo se fabrica utilizando técnicas de fotolitografía estándar para producir el chip fluídico basado en PDMS. Un transductor de disco piezoelécrico de ultrasonido está conectado al dispositivo y accionado por un microcontrolador. El conjunto se puede integrar dentro de una caja impresa en 3D para mayor protección. Las células y las microburbujas se empujan a través del dispositivo utilizando una bomba de jeringa o una bomba peristáltica conectada a tubos de PVC. La entrega aumentada de biomoléculas a las células de T humanas y a las células cancerosas del pulmón se demuestra con este sistema acoustofluidic. En comparación con los enfoques de tratamiento a granel, este sistema acoustofluidic aumenta el rendimiento y reduce la variabilidad, lo que puede mejorar los métodos de procesamiento celular para aplicaciones de investigación biomédica y la fabricación de terapias basadas en células.

Introducción

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Las plataformas virales y no virales se han utilizado para mejorar la entrega molecular a las células. La entrega viral (transducción) es una técnica común utilizada en terapias basadas en células que requieren modificación genómica. Las limitaciones con la entrega viral incluyen mutagénesis de inserción potencial, capacidad transgénica limitada, y multiplicidad no deseada de infección1,2. Por lo tanto, las técnicas de administración molecular no viral están en desarrollo para una amplia gama de aplicaciones biomédicas y de investigación. Las técnicas comunes incluyen mecánica, eléctrica, hidrodinámica, o el u....

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Protocolo

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Las donaciones de sangre entera se recogieron de donantes sanos siguiendo los protocolos aprobados por la junta de revisión institucional de la Universidad de Louisville.

1. Fabricación de un dispositivo acoustofluidic

  1. Obtener una fotomáscara con un diseño en espiral concéntrico que contiene canales con un diámetro de 500 μm. Se proporciona un archivo CAD en los archivos complementarios como ejemplo. Una máscara fotográfica personalizada se puede pedir a un proveedor comercial o estampada utilizando un escritor de máscaras.
  2. Prepare un molde del diseño en espiral concéntrico en una oblea de silicio recubi....

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Resultados

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Una imagen del sistema acoustofluidic montado dentro de una caja impresa en 3D se muestra en la Figura 1. Este protocolo produce un sistema acoustofluidic que se pueda utilizar para aumentar entrega molecular intracelular en variedades de células múltiples usando agentes del contraste del ultrasonido.

Figura 2   demuestra la entrega intracelular aumentada de un compuesto fluorescente, fluoresceína, a las células de T .......

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Discusión

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Este protocolo describe el montaje y el funcionamiento de un sistema acoustofluidic de bajo costo que mejora la entrega intracelular de biomoléculas para aplicaciones de investigación. Hay varios factores importantes a tener en cuenta al ensamblar y operar este sistema. El dispositivo acoustofluidic se fabrica en PDMS, que es un material biocompatible que se puede moldear fácilmente con dimensiones de canalconsistentes 27. Los canales del dispositivo se pueden enjuagar con 15 mL de solución de eta.......

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Divulgaciones

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Los coautores MAM y JAK poseen la propiedad de DesiCorp, que puede beneficiarse financieramente de los productos relacionados con esta investigación.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado en parte por fondos de la National Science Foundation (#1827521, #1827521, #1450370) y los Institutos Nacionales de Salud (U01HL127518). Los servicios de fotolitografía fueron proporcionados por el Centro de Tecnología Micro/Nano de la Universidad de Louisville.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Fabricación de un dispositivo acustofluido
DOW SYLGARD 184 ENCAPSULANTE DE SILICONA TRANSPARENTE 0,5 KG KITEllsworth Adhesives4019862 (SKU)https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/
Harris Uni-Core (2,5 mm)Ciencias de la Microscopía Electrónica69039-25
Depósito microfluídico para tubo Falcon de 15 mL - S (puerto 2/4)Portaobjetos de microscopio de Darwin MicrofluidicsLVF-KPT-S-2 (SKU)https://darwin-microfluidics.com/products/15-ml-falcon-tube-microfluidic-reservoir-s-2-4-port
VWR16004-430https://us.vwr.com/store/product/4646174/vwr-vistavisiontm-microscope-slides-plain-and-frosted-premium
triclorosilanoGelest105732-02-3 (Nº Cas.)El clorosilano es muy hazarado, inflamable. La exposición causa quemaduras graves y daño ocular.
Tubo de plástico blando de PVC Tygon (1/16" ID, 1/8" OD)McMaster-Carr5233K51 (Parte #)https://www.mcmaster.com/pvc-tubing/soft-tubing-for-air-and-water/
Assembly of Acoustofluidic System
Arduino UnoArduino 7630049200050(código de barras)https://store.arduino.cc/usa/arduino-uno-rev3
Preparación de agentes de contraste ultrasónicos
1,2-distearoyl-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DSEPC)Avanti Lipids890703P-25mg (SKU)https://avantilipids.com/product/890703
1,2-distearoyl-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC)Avanti Lipids850365P-25mg (SKU)https://avantilipids.com/product/850365
1,2- distearoyl-sn-glicero-3-fosfoglicerol (DSPG)Avanti Lipids840465P-25mg (SKU)https://avantilipids.com/product/840465
APF-140HP (gas decafluorobutato)FlouroMed355-25-9 (Cas No.)http://www.fluoromed.com/products/perfluorodecalin/
DB-338 Amalgamadores COXOhttps://www.coxotec.com/coxo/db-338-amalgamators/
estearato de polioxietileno 40 Sigma-AldrichP3440-250G (SKU)https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3440?lang=en®ion=US&gclid=
Cj0KCQjwy8f6BRC7ARIsAPIXOjjj
Jh_151mYVEUyLZRavt4re9YQMLS
vID64X-1KbO3LUKGjVUwb
PDAaAqvOEALw_wcB
Q125 SonicatorQsonicaQ125-110 (Ref.)https://www.sonicator.com/products/q125-sonicator?_pos=1&_sid=406df3776&_ss=r
Preparación de células T Primate funcionamiento fuerteautoMACs
Miltenyi Biotec130-091-221 (Nº de pedido)https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-running-buffer-macs-separation-buffer.html#gref
Kit de aislamiento de células Pan T, humano (Cóctel de anticuerpos de biotina de células T Pan & Cóctel de microperlas de células T pan) Miltenyi Biotec130-096-535 (Nº de pedido)https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/pan-t-cell-isolation-kit-human.html#130-096-535
clasificador de células magnéticas (autoMACS Pro Separator)Miltenyi Biotec130-092-545 (Nº de pedido)https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-pro-separator-starter-kit.html#130-092-545
fuerte de células de cáncer de pulmón A549< / kit de ensayo >
trehalosa fuerte MegazymeK-TREH (Cat. No.)https://www.megazyme.com/trehalose-assay-kit
Azul de tripano (0,4% en solución acuosa listo para usar, estéril)VWR97063-702 (n.º de cat. No.)https://us.vwr.com/store/product/7437427/trypan-blue-0-4-in-aqueous-solution-ready-to-use-sterile

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gardlik, R., et al. Vectors and delivery systems in gene therapy. Medical Science Monitor. 11 (4), 110-121 (2005).
  2. Wahlers, A., et al. Influence of multiplicity of infection and protein stability on retroviral vecto....

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Reimpresiones y permisos

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Etiquetas

T cnica de sonoporaci nEntrega intracelularTransductor de ultrasonidoCavitaci n de microburbujasChip flu dico de PDMSPermeabilizaci n de la membrana celularC lulas T humanasC lulas de c ncer de pulm nIntegraci n de microcontroladores

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