Los fenotipos de crecimiento de levadura se miden con precisión a través de imágenes de lapso de tiempo altamente paralelas de células inmovilizadas que crecen en microcolonías. Simultáneamente, se puede monitorear la tolerancia al estrés, la expresión proteica y la localización de proteínas, generando conjuntos de datos integrados para estudiar cómo las diferencias ambientales y genéticas, así como la heterogeneidad de la expresión génica entre las células isogénicas, modulan el crecimiento.
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Artículo de método
Imágenes en vivo de alto rendimiento de microcolonias para medir la heterogeneidad en crecimiento y expresión génica
En este artículo
Resumen
Resumen
Las mediciones precisas de la heterogeneidad entre cepas y dentro de la cepa en las tasas de crecimiento microbiano son esenciales para comprender los insumos genéticos y ambientales en la tolerancia al estrés, la patogenicidad y otros componentes clave de la aptitud física. Este manuscrito describe un ensayo basado en microscopios que rastrea aproximadamente 10 microcoloníassaccharomyces cerevisiae por experimento. Después de la toma automatizada de imágenes de lapso de tiempo de levadura inmovilizadas en una placa multipobajo, las tasas de crecimiento de microcolonía se analizan fácilmente con software de análisis de imágenes personalizado. Para cada microcolonía, también se puede controlar la expresión y localización de proteínas fluorescentes y la supervivencia del estrés agudo. Este ensayo permite una estimación precisa de las tasas de crecimiento promedio de las cepas, así como una medición integral de la heterogeneidad en el crecimiento, la expresión génica y la tolerancia al estrés dentro de las poblaciones clonales.
Introducción
Los fenotipos de crecimiento contribuyen críticamente a la aptitud de la levadura. La selección natural puede distinguir eficientemente entre linajes con tasas de crecimiento diferentes por la inversa del tamaño efectivo de la población, que puede superar los 108 individuos1. Además, la variabilidad de las tasas de crecimiento entre los individuos dentro de una población es un parámetro relevante para la evolución, ya que puede servir como base para estrategias de supervivencia como la cobertura de apuestas2,3,4,....
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Protocolo
1. Preparación de placas aleatorizadas (antes del día del experimento)
- Planifique las cepas y condiciones a probar con el ensayo de crecimiento. En este punto, asigne aleatoriamente cepas y condiciones a cualquier pozo.
NOTA: Al considerar la configuración de la placa, es recomendable incluir más de una réplica por cepa y condición de crecimiento en una sola placa para tener en cuenta el ruido bien relacionado en las mediciones. Consulte Discusión para obtener más detalles. - Aleatoriza computacionalmente la ubicación de cada cepa y condición ambiental para las réplicas de placas que se ejecutarán en diferentes días.
- Cultivar todas las c....
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Resultados
La novedad de este protocolo es que la tasa de crecimiento se puede calcular para las células individuales dentro de una población mediante el seguimiento de su crecimiento en microcolonías a través de imágenes de lapso de tiempo (Figura 2A). Debido a que las microcolonías crecen durante muchas horas de manera plana debido a la presencia de concanavalina A, sus áreas pueden ser rastreadas a lo largo del experimento, y un ajuste lineal al cambio en el tronco natural de la zona con el tiempo s.......
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Discusión
El protocolo descrito aquí es un ensayo versátil que permite monitorear simultáneamente el crecimiento celular y la expresión génica a nivel de microcolonías individuales. La combinación de estas dos modalidades produce conocimientos biológicos únicos. Por ejemplo, trabajos anteriores han utilizado este ensayo para mostrar una correlación negativa entre la expresión del gen TSL1 y la tasa de crecimiento de microcolonía en células de tipo salvaje isogénico midiendo ambas simultáneamente7
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a Naomi Ziv, Sasha Levy y Shuang Li por sus contribuciones al desarrollo de este protocolo, David Gresham por equipos compartidos y Marissa Knoll por su ayuda con la producción de video. Este trabajo fue apoyado por la subvención R35GM118170 de los Institutos Nacionales de Salud.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| General Materials | |||
| 500 mL Bottletop Filter .22 µ m Esterilización PES, baja unión a proteínas, con cuello de 45 mm | CLS431154 | Fisher se utiliza para filtrar los medios | |
| BD Falcon*Placas de cultivo de tejidos, microtest u-bottom | Fisher | 08-772-54 | Tubos de cultivo de 96 pocillos utilizados para congelar células, pre-crecimiento de células y diluciones |
| BD Jeringas sin aguja, 50 mL | Fisher | 13-689-8 | Se utiliza para filtrar la Concanavalina A |
| Costar Depósitos de reactivos desechables estériles | Depósitos | 07-200-127 | utilizados para pipetear soluciones con pipeta multicanal |
| Cinta de sellado de aluminio Costar Thermowell | Fisher | 07-200-684 | Sellado de placa de 96 pocillos para precrecimiento y congelación |
| sin pelusas ni estática Kimwipes Toallitas | Fisher | 06-666A | pelusa ni estática para mantener el fondo de la placa del microscopio libre de residuos y arañazos |
| Filtros de jeringa Nalgene | ThermoFisher Scientific | 199-2020 | 0.2 μ m tamaño de poro, 25 mm de diámetro; utilizado para filtrar la concanavalina A |
| Componentes > < solución | |||
| Medios mínimos químicamente definidos (MD; 2% de glucosa) | Medios de microscopía alternativos utilizados para el precrecimiento de levaduras y el crecimiento durante la microscopía | ||
| Medios sintéticos completos (SC; 2% de glucosa) | Medios de microscopía utilizados para el precrecimiento de levaduras y el crecimiento durante la microscopía | ||
| Extracto de levadura-peptona-dextrosa (YEPD; 2% de glucosa) | antes de la congelación placas aleatorias | ||
| Materiales de microscopía | |||
| Breathe-Membrana de sellado fácil Membranas transpirables | Millipore Sigma | Z380059-1PAK | utilizadas para sellar la placa durante el experimento de microscopía. En esta etapa, se recomiendan las membranas transpirables porque evitan la condensación en los pocillos y permiten obtener mejores imágenes de microscopía Placa |
| de microscopía con fondo de vidrio transparente plano Brooks de 96 pocillos | Dot Scientific | MGB096-1-2-LG-L placa de | microscopio |
| Concanavalin A de canavalia ensiformis (Jack Bean), polvo liofilizado | Millipore Sigma | 45-C2010-1G | Haga 5 veces la solución de concanavalina A y congele 5 ml de 5 veces concanavalina A en tubos cónicos de 50 mL a -80 & grados; C |
| utilizadas | |||
| MAH.5, MAH.96, MAH.52, MAH.66, MAH.11, MAH.58, MAH.135, MAH.15, MAH.44, MAH.132 | Cepas de acumulación de mutaciones haploides en un entorno de laboratorio, descritas en Hall y Joseph 2010 | ||
| EP026.2A-2C | de la cepa de acumulación de mutaciones ancestral Hall y Joseph 2010, transformadas con YFR054cΔ::Scw11P: :GFP | ||
| Equipment | |||
| Misonix Sonicator S-4000 con accesorio | Sonicator https://www.labx.com/item/misonix-inc-s-4000-sonicator/4771281 | ||
| Nikon Eclipse Ti-E con sistema | Microscopio invertido con platina automatizada y sistema de enfoque automático |
Referencias
- Geiler-Samerotte, K. A., Hashimoto, T., Dion, M. F., Budnik, B. A., Airoldi, E. M., Drummond, D. A. Quantifying condition-dependent intracellular protein levels enables high-precision fitness estimates. PloS one. 8 (9), 75320(2013).
- Kussell, E., Leibler, S.
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Reimpresiones y permisos
