Definición del programa de traducción del ARNm materno durante la maduración in vitro utilizando un solo ensayo de reportero de ovocitos

Resumen

Este protocolo describe un análisis del reportero para estudiar la regulación de la traducción del mRNA en solos ovocitos durante la maduración in vitro.

Resumen

Los eventos asociados con la maduración nuclear de ovocitos han sido bien descritos. Sin embargo, se sabe mucho menos acerca de las vías moleculares y procesos que tienen lugar en el citoplasma en preparación para la fertilización y adquisición de totipotency. Durante la maduración de los ovocitos, los cambios en la expresión génica dependen exclusivamente de la traducción y degradación de los ARN mensajeros maternos (ARNm) en lugar de la transcripción. La ejecución del programa traslacional, por lo tanto, juega un papel clave en el establecimiento de la competencia de desarrollo de ovocitos para sostener el desarrollo embrionario. Este papel es parte de un foco en la definición del programa de la traducción maternal del mRNA que ocurre durante la maduración meiótica y en la transición del oocyte-a-cigoto. En este trabajo de método, se presenta una estrategia para estudiar la regulación de la traducción de arns diana durante la maduración in vitro de los ovocitos. Aquí, un reportero de Ypet se fusiona a la región sin traducir 3' (UTR) del gen de interés y luego se microinyecta en ovocitos junto con la codificación de ARNm poliadenilada para que mCherry controle el volumen inyectado. Mediante el uso de microscopía de lapso de tiempo para medir la acumulación de reporteros, las tasas de traducción se calculan en diferentes transiciones durante la maduración meiótica de los ovocitos. Aquí, los protocolos para el aislamiento y la inyección del oocyte, la grabación del lapso de tiempo, y el análisis de datos se han descrito, usando el Ypet/interleukin-7 (IL-7) - 3' UTR reportero como ejemplo.

Introducción

Un ovocito mamífero completamente crecido sufre cambios rápidos en la preparación para la fertilización y la adquisición de totipotency. Estos cambios son esenciales para sostener el desarrollo embrionario después de la fertilización. Aunque los eventos asociados con la maduración nuclear están relativamente bien descritos, se sabe mucho menos sobre los procesos moleculares y las vías en el citoplasma de los ovocitos. Durante las etapas finales de la maduración de los ovocitos, los ovocitos son transcripcionalmente silenciosos, y la expresión génica depende totalmente de la traducción y degradación del^{ARNm 1,2.}

Protocolo

Los procedimientos experimentales con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de California en San Francisco (protocolo AN182026).

1. Preparación de medios

1. Añadir todos los componentes, como se describe en la Tabla 1,para hacer el medio básico de recolección de ovocitos y el medio de maduración de ovocitos. Para el medio de recolección básico, establezca el pH en 7.4. Tanto para el medio de recolección como para el de maduración, añadir 3 mg/mL de albúmina sérica bovina (BSA) y 1 μM de cilostamida el día de su uso.

2. Prep....

Resultados

Los ovocitos I-arrestados de la profase denudada de 21 ratones de un día C57/BL6 fueron inyectados con una mezcla del reportero que contenía el mRNA que codificaba el reportero de Ypet fundido al 3' UTR de IL-7 y del mRNA que codificaba mCherry. La expresión de YFP y de mCherry fue registrada en 39 ovocitos, cuyo 30 fueron madurados, y 9 fueron arrestados en la profase I como control negativo. Tres ovocitos maduros fueron excluidos para el análisis porque tenían un GVBD retrasado (N=2) o movidos en el plato durante la gr.......

Discusión

El actual método describe una estrategia para estudiar la activación y la represión de la traducción del mRNA de la blanco en diversas transiciones durante la maduración meiótica in vitro del oocyte. IL-7, un cytokine lanzado por el oocyte que se puede implicar en la comunicación⁸de la célula del oocyte-cumulus,^13,fue elegido con el fin de describir este método. Il-7 se sabe para ser traducido cada vez más durante la maduración^{del oocyt.......}

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Preparación de medios
Albúmina sérica bovina en polvo Bioxtra	Sigma-Aldrich	SIAL-A3311
Cilostamida	EMD Millipore	231085
MEM alpha	Gibco	12561-056
Medio esencial mínimo Eagle	Sigma-Aldrich	M2645
Penicilina-Estreptomicina 100x Solución, Estéril Filtrado	Genesee Scientific Corporation (GenClone)	25-512
Bicarbonato de sodio	JT-Baker	3506-1
Piruvato de sodio	Gibco	11360-070
Agua destilada ultrapura	Invitrogen	10977-015
Preparación de ARNm que codifica YFP/3' UTR y mCherry
Agarose	Apex Biomedical	20-102QD
Sal disódica de carbenicilina	Sigma-Aldrich	C1389-1G
Choo-Choo Clonación Kit	McLab	CCK-20
CutSmart Buffer (10x)	New England Biolabs	B7204
Colorante de carga de ADN (6x)	Thermo Scientific	R0611
dNTP Solution	New England Biolabs	N0447S
DpnI	New England Biolabs	R0176
GeneRuler 1 kb Escalera de ADN	Thermo Fisher	SM1333
LB Placas de agar con 100 µ g/mL de carbenicilina, Teknova	Teknova	L1010
LB Medio (Cápsulas)	MP Biomedicals	3002-021
MEGAclear Kit de limpieza de transcripción	Life Technologies	AM1908
MfeI-HF enzima de restricción	New England Biolabs	R3589
mMESSAGE mMACHINE T7 Kit de transcripción	Invitrogen	AM1344
Phusion ADN de alta fidelidad polimerasa	New England Biolabs	M0530
Poly(A) Kit de relaves	Invitrogen	AM1350
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
QIAquick Kit de extracción de gel	Qiagen	28704
S.O.C. medio	Thermo Fisher	15544034
tampón TAE	Apex Biomedical	20-193
Solución de bromuro de etidio ultrapuro	Life Technologies	15585011
ovocitos fuertes tubo de
aspiración fuerte para micropipetas calibradas	Sigma-Aldrich	A5177-5EA
Micropipetas calibradas	Drummond Scientific Company	2-000-025
PMSG- 5000	Mybiosource	MBS142665
Aguja PrecisionGlide 26 G x 1/2	BD
1 ml	BD	309659
Plato de microinyección de ovocitos
35 mm | Nº 0 Cubreobjetos | Diámetro de vidrio de 20 mm |	MatTek	P35G-0-20-C	sin recubrimiento Para microscopía time-lapse
Vidrio de borosilicato con filamento	Sutter Instrument	BF100-78-10
Aceite para el cultivo de embriones	Irvine Scientific	9305
Placa de Petri	Falcon	351006	para microinyección
Placa de cultivo de tejidos	Falcon	353001	Para la incubación de ovocitos
VacuTip Holding Capillary	Eppendorf	5195000036
Software
BioRender	BioRender		Preparación de Figure 1S
MetaMorph, versión 7.8.13.0	Dispositivos moleculares		Para microscopía de lapso de tiempo, análisis de la traslación UTR 3'