A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Research Article
Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
Este protocolo delinea un método rutinario para usar la microscopia electrónica serial de la exploración de la bloque-cara (SBF-SEM), una técnica de proyección de imagen 3D potente. El uso acertado de SBF-SEM depende de técnicas apropiadas de la fijación y de la coloración del tejido, así como de la consideración cuidadosa de los ajustes de la proyección de imagen. Este protocolo contiene consideraciones prácticas para la totalidad de este proceso.
La microscopia electrónica serial de la bloque-cara de la exploración (SBF-SEM) permite la colección de centenares a millares de imágenes ultraestructurales en serie-registradas, ofreciendo una vista tridimensional sin precedentes del tejido microanatomy. Mientras que SBF-SEM ha visto un aumento exponencial en uso estos últimos años, los aspectos técnicos tales como preparación apropiada del tejido y parámetros de la proyección de imagen son supremos para el éxito de esta modalidad de la proyección de imagen. Este sistema de imágenes se beneficia de la naturaleza automatizada del dispositivo, lo que permite dejar el microscopio desatendido durante el proceso de obtención de imágenes, con la recopilación automatizada de cientos de imágenes posibles en un solo día. Sin embargo, sin la preparación apropiada del tejido la ultraestructura celular se puede alterar de una manera tal que las conclusiones incorrectas o engañosas pudieran ser dibujadas. Además, las imágenes se generan escaneando la cara de bloque de una muestra biológica incrustada en resina y esto a menudo presenta desafíos y consideraciones que deben abordarse. La acumulación de electrones dentro del bloque durante la proyección de imagen, conocida como "carga del tejido," puede llevar a una pérdida de contraste y a una inhabilidad de apreciar la estructura celular. Además, si bien el aumento de la intensidad/voltaje del haz de electrones o la disminución de la velocidad de escaneo del haz pueden aumentar la resolución de la imagen, esto también puede tener el desafortunado efecto secundario de dañar el bloque de resina y distorsionar las imágenes posteriores en la serie de imágenes. Aquí presentamos un protocolo de rutina para la preparación de muestras de tejido biológico que preserva la ultraestructura celular y disminuye la carga tisular. También proporcionamos las consideraciones de la proyección de imagen para la adquisición rápida de serial-imágenes de alta calidad con daño mínimo al bloque del tejido.
La microscopía electrónica de barrido facial de bloques en serie (SBF-SEM) fue descrita por primera vez por Leighton en 1981, donde creó un microscopio electrónico de barrido aumentado con un microtomo incorporado que podía cortar e imaginar secciones delgadas de tejido incrustadas en resina. Desafortunadamente, las limitaciones técnicas restringieron su uso a muestras conductoras, ya que las muestras no conductoras, como el tejido biológico, acumularon niveles inaceptables de carga (acumulación de electrones dentro de la muestra de tejido)1. Si bien el recubrimiento de la cara de bloque entre cortes con carbono evaporado redujo la carga de tejido, esto aumentó en gran medida el tiempo de adquisición de imágenes y el almacenamiento de imágenes siguió siendo un problema, ya que la tecnología informática en ese momento era insuficiente para administrar los grandes tamaños de archivo creados por el dispositivo. Esta metodología fue revisada por Denk y Horstmann en 2004 utilizando un SBF-SEM equipado con una cámara de presión variable2. Esto permitió la introducción de vapor de agua a la cámara de imágenes, lo que reduce la carga dentro de la muestra, haciendo que las imágenes de muestras no conductoras sean viables, aunque con una pérdida de resolución de imagen. Las mejoras adicionales en la preparación del tejido y los métodos de la proyección de imagen ahora permiten la proyección de imagen usando el alto vacío, y la proyección de imagen de SBF-SEM confía no más en el vapor de agua para disipar la carga3,4,5,6,7,8,9. Mientras que SBF-SEM ha visto un aumento exponencial en uso estos últimos años, los aspectos técnicos tales como preparación apropiada del tejido y parámetros de la proyección de imagen son supremos para el éxito de esta modalidad de la proyección de imagen.
SBF-SEM permite la recolección automatizada de miles de imágenes de microscopía electrónica registradas en serie, con una resolución plana tan pequeña como 3-5 nm10,11. El tejido, impregnado con metales pesados e incrustado en resina, se coloca dentro de un microscopio electrónico de barrido (SEM) que contiene un ultramicrotomo equipado con un cuchillo de diamante. Una superficie plana se corta con el cuchillo de diamante, el cuchillo se retrae y la superficie del bloque se escanea en un patrón ráster con un haz de electrones para crear una imagen de ultraestructura de tejido. A continuación, el bloque se eleva una cantidad especificada (por ejemplo, 100 nm) en el eje z, conocido como "paso z", y se corta una nueva superficie antes de que se repita el proceso. De esta manera se produce un bloque de imágenes de 3 dimensiones (3D) a medida que se corta el tejido. Este sistema de imágenes se beneficia aún más de la naturaleza automatizada del dispositivo, lo que permite dejar el microscopio desatendido durante el proceso de obtención de imágenes, con la recopilación automatizada de cientos de imágenes posibles en un solo día.
Mientras que las imágenes SBF-SEM utilizan principalmente electrones retrosperdicionados para formar una imagen de la cara de bloque, los electrones secundarios se generan durante el proceso de obtención de imágenes12. Los electrones secundarios pueden acumularse, junto con los electrones retrospersión y de haz primario que no escapan del bloque, y producen "carga de tejido", lo que puede conducir a un campo electrostático localizado en la cara del bloque. Esta acumulación de electrones puede distorsionar la imagen o hacer que los electrones sean expulsados del bloque y contribuir a la señal recogida por el detector de retrospersión, disminuyendo la relación señal/ruido13. Mientras que el nivel de carga del tejido puede disminuirse reduciendo el voltaje o la intensidad del haz de electrones, o reduciendo el tiempo de permanencia del haz, esto resulta en una relación señal/ruido disminuida14. Cuando se utiliza un haz de electrones de menor voltaje o intensidad, o el haz solo puede habitar dentro de cada espacio de píxeles durante un período de tiempo más corto, menos electrones retrodispersión son expulsados del tejido y capturados por el detector de electrones, lo que resulta en una señal más débil. Denk y Horstmann abordaron este problema introduciendo vapor de agua en la cámara, reduciendo así la carga en la cámara y en la cara del bloque a costa de la resolución de la imagen. Con una presión de cámara de 10-100 Pa, una parte del haz de electrones se dispersa contribuyendo al ruido de la imagen y una pérdida de resolución, sin embargo, esto también produce iones en la cámara de la muestra que neutraliza la carga dentro del bloque de muestra2. Los métodos más recientes para neutralizar la carga dentro del bloque de muestra utilizan la inyección focal de gas de nitrógeno sobre la cara del bloque durante la toma de imágenes, o la introducción de voltaje negativo en la etapa SBF-SEM para disminuir la energía de la sonda-haz-lading y aumentar la señal recogida6,7,15. En lugar de introducir sesgo de etapa, presión de cámara o inyección localizada de nitrógeno para disminuir la acumulación de carga en la superficie del bloque, también es posible aumentar la conductividad de la resina mediante la introducción de carbono en la mezcla de resina, lo que permite ajustes de imagen más agresivos16. El siguiente protocolo general es una adaptación del protocolo de Deerinck et al. publicado en 2010 y cubre las modificaciones en la preparación de tejidos y las metodologías de imagen que encontramos útiles para minimizar la carga de tejidos mientras se mantiene la adquisición de imágenes de alta resolución3,17,18,19. Mientras que el protocolo previamente mencionado se centró en el proceso del tejido y la impregnación del metal pesado, este protocolo proporciona la penetración en la proyección de imagen, el análisis de datos, y el flujo de trabajo de la reconstrucción inherentes a los estudios de SBF-SEM. En nuestro laboratorio, este protocolo se ha aplicado con éxito y reproduciblemente a una amplia variedad de tejidos, incluyendo córnea y estructuras del segmento anterior, párpado, glándula lagrimal y harderiana, retina y nervio óptico, corazón, pulmón y vía aérea, riñón, hígado, músculo cremaster y corteza cerebral / médula, y en una variedad de especies que incluyen ratón, rata, conejo, conejillo de Indias, peces, monocapa y cultivos celulares estratificados, cerdo, primate no humano, así como humanos20,21,22,23. Mientras que los pequeños cambios pueden valer la pena para tejidos y aplicaciones específicos, este protocolo general ha demostrado ser altamente reproducible y útil en el contexto de nuestra instalación de imágenes principales.
Todos los animales fueron manejados de acuerdo con las pautas descritas en la Declaración de manejo de animales para el uso de animales en la visión y la investigación oftálmica de la Universidad de Houston y la Facultad de Optometría de la Universidad de Houston. Todos los procedimientos de animales fueron aprobados por las instituciones en las que se manejaron: los procedimientos de ratón, rata, conejo, conejillo de Indias y primates no humanos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Houston, los procedimientos de pez cebra fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de DePauw, y los procedimientos de cerdos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de baylor College of Medicine. Todos los tejidos humanos se manipularon de conformidad con la Declaración de Helsinki relativa a la investigación sobre tejidos humanos y se obtuvo la aprobación de la junta de revisión institucional apropiada.
1. Procesamiento de tejidos
2. Preparación de bloques
Nota : el método dependerá de cómo se orienta el ejemplo en el bloque y cómo se va a realizar la sección. Sin embargo, la orientación más común del tejido encuentra el tejido centrado en la punta del bloque de resina, perpendicular al extremo largo del bloque de resina.
3. Configuración de SEM para obtener imágenes de la cara de bloque
NOTA: Los ajustes de imagen que siguen se produjeron en el dispositivo utilizado por los autores, que se enumera en la Tabla de materiales proporcionados. Si bien este dispositivo es capaz de obtener imágenes de presión variable, los mejores resultados se capturaron bajo alto vacío.
Córnea del ratón
Este protocolo se ha aplicado extensivamente a la córnea del ratón. Usando proyección de imagen de SBF-SEM una red de paquetes elastino-libres de la microfibrrilla (EFMBs) fue mostrado para estar presente dentro de la córnea adulta del ratón. Se creía previamente que esta red sólo estaba presente durante el desarrollo embrionario y postnatal temprano. SBF-SEM reveló una extensa red EFMB en toda la córnea, con fibras individuales encontradas para ser 100-200 nanómetro de diámetro cuando está medido en la sección representativa. También se encontró que esta red EFMB estaba organizada en distintas capas, con fibras estrechamente asociadas con los queratocitos, incluso dentro de invaginaciones superficiales en la superficie del queratocitos(Figura 5). El descubrimiento de fibras EFMB en la córnea adulta llevó a la microscopía electrónica de transmisión (TEM) de etiquetado inmunogold, fluorescencia y estudios confocales para comprender mejor la naturaleza de esta red23.
La aplicación adicional de este protocolo llevó al descubrimiento de una población previamente desconocida de nervios corneales centrales que se fusionan con las células epiteliales basales en el borde estromal-epitelial(Figura 6). Anteriormente, se creía que todos los nervios que interactuaba con el epitelio en esta frontera penetraban en el epitelio corneal y se ramificaban produciendo la plexxi subbasal y epitelial. En este estudio, el ~45% de los nervios centrales que obraban recíprocamente con el epitelio básico experimentaron la fusión de la célula-célula bastante que la penetración simple. Usando los métodos estereológicos aplicados a los conjuntos de datos de SBF-SEM, era posible demostrar que esta población nueva del nervio tenía un cociente de la superficie-a-volumen áspero mitad que de nervios penetrantes, constante con su aspecto "hinchado" (fusión del nervio - 3.32±0.25, penetración del nervio - 1.39±0.14, p ≤ 0.05). Se crearon reconstrucciones 3D de haces nerviosos penetrantes y fusionantes y sus mitocondrias, destacando la falta de mitocondrias en porciones fusionadas de los haces nerviosos. El descubrimiento de la fusión de células neuronales-epiteliales utilizando SBF-SEM llevó a estudios de fluorescencia que verificaron la continuidad de la membrana entre las dos células fusionadas21.
La córnea central es un tejido avascular, y como tal la vasculatura limbal periférica es de particular importancia para la salud general de la córnea. Las relaciones célula-célula y la ultraestructura de esta región son complejas; sin embargo, la capacidad de apreciar estas interacciones célula-célula y conexiones ultraestructurales se ha limitado en estudios de la fluorescencia y de la sola sección TEM. Por esta razón, una pila de imágenes SBF-SEM que contiene vasculatura limbal, haces nerviosos y células asociadas se segmentó manualmente para la reconstrucción 3D(Figura 7). En esta imagen la asociación cercana entre las ensambladuras endoteliales vasculares y un pericyte que se superpone, los gránulos individuales de una célula de mástil perivascularia, el núcleo y el borde de ataque de un neutrófilo que se arrastra a lo largo de la superficie externa de la pared del vaso sanguíneo, así como un paquete del nervio que pasa puede ser visto.
En conjunto, este cuerpo de trabajo demuestra la capacidad de este protocolo para producir conjuntos de datos de microscopía electrónica 3D de alta calidad en tejidos ricos en matriz extracelular y epitelio, así como vasculatura y células asociadas.
Retina de primates de orden superior - Plexo nervioso y red vascular
La capa de fibra nerviosa retiniana (RNFL) de los primates de orden superior contiene y depende de una extensa red vascular. A menudo, las enfermedades de la retina implican cambios en ambos parámetros de la capa de fibra nerviosa de la retina, así como la vasculatura que se encuentra dentro de ella. La comprensión de la relación entre el RNFL y su red vascular en tejido sano, no patológico es el primer paso para entender cualquier cambio que pueda ocurrir como resultado de enfermedad. Para comprender mejor esta relación, se aplicó el protocolo SBF-SEM a la retina normal de primates de orden superior y se realizó la reconstrucción de la red vascular y se extrajeron datos volumétricos de esta reconstrucción (Figura 8). Esta región de 4.642.307 μm3 de la RNFL contenía un lecho vascular de 1,207x10-4 μL de volumen, lo que suman el 2,6% del volumen total de la RNFL. Este trabajo demuestra la capacidad de este protocolo para producir conjuntos de datos de microscopía electrónica 3D de alta calidad en tejido neurológico denso.
Pez cebra y corazón gigante de Danio - Músculo estriado y vasculatura en desarrollo
Tanto el pez cebra como el danio gigante son modelos importantes para el desarrollo y la regeneración del corazón. Históricamente, se considera que el corazón del pez cebra consiste en dos segmentos miocárdicos anatómicamente distintos que funcionan juntos en apoyo de las demandas fisiológicas del pez cebra. Sin embargo, la interfaz entre estas dos capas ventriculares no era bien entendida. Usando este protocolo, una región junctional previamente desconocida fue descubierta consistiendo en una hoja fina de fibroblastos. Se encontró que las aberturas dentro de esta hoja permitieron que dos segmentos miocárdicos separados entraran en contacto y formaras complejas uniones de adhesión incluyendo desmosomas y adherentes de fascia22.
Este protocolo ha sido utilizado en trabajos posteriores de examen de la red vascular del corazón de danio gigante en desarrollo(Figura 9). Este método permite la apreciación 3D de la red de miocitos cardíacos en desarrollo y su relación con el desarrollo de la microvasculatura. En conjunto, este trabajo demuestra la capacidad de este protocolo para producir conjuntos de datos de microscopía electrónica 3D de alta calidad en músculos y tejidos altamente vascularizados.
Configuración de imagen, carga y resolución
Mientras que la fijación apropiada y la coloración del metal pesado son necesarias para la proyección de imagen de la calidad de SBF-SEM, igualmente importante es el uso de la resina conductora y de las configuraciones apropiadas de la proyección de imagen para las preguntas que son tratadas. En este protocolo, el uso de negro de carbón se emplea con el fin de aumentar la conductividad del bloque de muestra y proporcionar un conducto al pasador de montaje para la separación de electrones secundarios de la cara del bloque. Esto ha demostrado ser eficaz en la lucha contra la carga de tejidos que a menudo degrada la calidad de imagen en tejidos no preparados con negro de carbón16. Además, la pintura de plata y el sputtering de oro aplicados al bloque proporcionan una vía de disipación para la acumulación de electrones. Algunos dispositivos permiten la adición de un compensador de carga focal, que reduce la carga mediante la aplicación de una bocanada de nitrógeno sobre la cara del bloque, sin embargo, hemos tenido un éxito similar con el uso de negro de carbón y la aplicación de pintura de plata y pulverización de oro al bloque15. La falta de conductividad de la muestra puede conducir a la acumulación de electrones visible como carga de tejido (Figura 1), así como descargas que son visibles como desplazamiento brusco de la imagen y deformación que disminuyen drásticamente la calidad de la imagen (Figura 10B &F). El uso de negro de carbón permite la obtención de imágenes en alto vacío y el uso de ajustes de imagen que dan como resultado una alta relación señal-ruido y una resolución de imagen mejorada. Uno de estos ajustes que conduce a una mejor calidad de imagen es el tiempo de permanencia de píxeles. El proceso de imagen SBF-SEM implica el escaneo ráster de un haz de electrones a través de la superficie de la muestra para generar electrones retrospersión que el detector de microscopio puede recopilar e interpretar como señal. El tiempo que se permite que este haz habite dentro del espacio de cada píxel conduce a un valor de píxel más preciso que se asigna a cada ubicación de píxel (Figura 3A &B)2. Sin embargo, hay un equilibrio que debe lograrse entre el aumento de la señal a ruido, la resolución y el daño infligido a la cara del bloque. El haz irradia eficazmente la cara del bloque con electrones de alta energía que pueden descomponer y suavizar la resina, lo que resulta en la degradación de la imagen y las complicaciones de corte (Figura 10)28. Cuanto más delgada sea la resolución z requerida, más difícil será mantener imágenes de alta resolución. Generalmente usamos pasos z de 100-200 nm, sin embargo, se han reportado tamaños de pasos z de 25-50 nm5,29,30,31. Con pasos z de este tamaño, la descompresión y ablandamiento de la resina debido al daño del haz puede conducir a la compresión de la resina haciendo que el cuchillo pierda un corte o corte la cara del bloque, pero con "charla" donde el cuchillo salta a través de la superficie del bloque creando ondulaciones y bandas13. Si bien los pequeños pasos z son una perspectiva atractiva, es importante tener en cuenta la pregunta de investigación específica al elegir un paso z apropiado. El exceso de muestreo puede dar lugar a consideraciones sustanciales de almacenamiento de datos, así como a un aumento en el tiempo necesario para producir reconstrucciones 3D.
Fijación y tinción tisular
Antes de la incubación de metales pesados, los tejidos deben fijarse en glutaraldehído. Si bien recomendamos encarecidamente la fijación de microondas al vacío para la preservación de la ultraestructura detejidos 27,si un microondas de grado de laboratorio no está disponible, se puede sustituir un microondas inversor comercial con potencia variable32,33,34,35. Si esto se hace, el cuidado adicional se debe emplear para asegurarse de que la distorsión del tejido no ocurra. La fijación inadecuada del tejido puede resultar en una morfología tisular alterada como se puede ver en la Figura 10E. Este protocolo, al igual que la mayoría de los protocolos modernos de tinción SBF-SEM, ha sido adaptado del procedimiento de tinción descrito por Deerinck en2010 17,basado en las manchas de osmio-tiocarbohidrazida-osmio creadas por Willingham y Rutherford en 198436. Los metales pesados utilizados en este protocolo añaden contraste a las estructuras celulares dentro de una muestra de tejido (Figura 1). La incubación inicial de osmio ocurre con osmio reducido que se une a los enlaces C = C en grasas insaturadas que conducen a la tinción de membranas y lípidos37,38. El osmio se reduce por el ferrocianuro de potasio, que ayuda en la tinción de lípidos saturados y también actúa para estabilizar los fosfolípidos39,40. La tiocarbohidrazída se añade posteriormente como un mordiente que se une al osmio desde la primera incubación, actuando como un puente sobre el que se une más osmio en una etapa posterior en el protocolo41. El acetato de uranilo, que es una sal de uranio, es un agente de contraste eficaz para lípidos, ácidos nucleicos y proteínas, mientras que el citrato de plomo mejora el contraste de proteínas y glucógenos. Las afinidades variables de estos agentes por los componentes celulares aumentan aún más el contraste general dentro de los tejidos más allá de las incubaciones de osmio42.
Imágenes de la cara de bloque
La Figura 11, la Figura 12,la Figura 13 ilustran los efectos combinados del voltaje, el tiempo de permanencia de los píxeles y la intensidad del haz. La práctica convencional sugiere que una combinación de bajo voltaje, tiempo de permanencia corto y baja intensidad de haz son necesarios para obtener imágenes óptimas y prevenir el daño del haz al bloque de muestra. Contrariamente a estos ajustes, la Figura 11, la Figura 12, la Figura 13 ilustran que los voltajes más altos (por ejemplo, 7 kV), los tiempos de permanencia más largos (32 μs /px) y las intensidades de haz más altas (ajuste 6 en nuestro caso) pueden producir una calidad de imagen superior a la configuración convencional.
SBF-SEM permite la recopilación de imágenes de microscopía electrónica en serie que se pueden recopilar como un conjunto de datos 3D compuesto por vóxes. Si bien este es un uso increíblemente poderoso de SBF-SEM, este método también permite la obtención de imágenes rápidas y repetibles de eventos biológicos o células raras. La adquisición de imágenes mediante SBF-SEM se puede supervisar en busca de eventos raros y se pueden pausar las imágenes para recopilar imágenes de mayor ampliación/resolución de estos eventos. Además, el bloque se puede quitar de la cámara del microscopio y la bloque-cara seccionado para la proyección de imagen de la microscopia electrónica de transmisión (TEM). De esta manera, se pueden recopilar grandes conjuntos de datos de eventos raros utilizando SBF-SEM, así como apreciarse a escala de angstrom utilizando TEM.
Figura 1:Comparaciones SBF-SEM y TEM en varios pasos del protocolo. Este protocolo contiene múltiples pasos en los que el tejido de la muestra se tiñe con metales pesados. Esto afecta no solo al contraste tisular y a la apreciación de las estructuras celulares y los orgánulos, sino también a los niveles de carga que se producen cuando se toma una imagen del tejido. Esta figura contiene tres vistas distintas del tejido preparado: una vista de bajo aumento(A, D &G),una vista de gran aumento(B, E &H),y una comparación TEM de la córnea de ratón preparada(C, F &I). Se puede observar que las imágenes de mayor aumento pueden resultar en un aumento de la carga de tejido, ya que el haz de electrones se concentra en una región más pequeña de tejido. La fila superior(A-C)es una muestra representativa del tejido procesado hasta la finalización del paso 1.8, y ha sido impregnada con ferrocianuro de potasio, tetróxido de osmio y tiocarbohidrazida. Las flechas en las dos primeras columnas muestran la interfaz epitelial-estrofa como punto de referencia. Tenga en cuenta el bajo nivel de contraste en comparación con las dos filas inferiores, así como el aumento de los niveles de carga de tejido. La muestra en la fila central(D-F)se procesó hasta la finalización del paso 1.10 y se beneficia de un paso adicional de tetróxido de osmio, y está visiblemente más contrastada que la muestra en la fila superior. Si bien las estructuras celulares son discernibles, la carga todavía está presente. La muestra en la fila inferior(G-I)se beneficia del protocolo de tinción completo y tiene una carga mínima de tejido. Las imágenes TEM revelan los niveles de contraste tisular impartidos por los metales pesados presentes en cada paso (columna derecha): los orgánulos en el endotelio corneal (*) son más contrastados y evidentes a medida que el procesamiento de tejidos continúa a través del protocolo. Además, los detalles del colágeno y la fibrilina del estroma se vuelven más visibles (punta de flecha) a medida que se completa el protocolo. Panel A, D & G barra de escala = 50 μm. Panel B, E & H barra de escala = 10 μm. Panel C, F & I barra de escala = 1 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:Esquema del bloque de tejido embebido, el pasador de la muestra y la preparación final. (A) El tejido debe colocarse en una orientación conocida en la punta misma del molde de resina y el tercio superior del molde lleno de resina saturada de negro de carbón. La región del molde más alejada del tejido debe permanecer clara para que la etiqueta del experimento se pueda ver claramente. (B)La superficie del pasador de la muestra debe rayarse para producir un patrón de rejilla, esto permite una mayor área de contacto para que el pegamento de cianocrilato se endurezca entre el bloque de la muestra preparada y el pasador. (C)La resina saturada de negro de carbono debe hacer una amplia área de contacto con la cabeza del pasador de la muestra, sin embargo, la región que se corta con el cuchillo de diamante no debe ser mayor que 1x1 mm. Es una buena práctica para disminuir el bloque hacia la punta. Esto minimiza las fuerzas de corte en el cuchillo de diamante y al tener una base más ancha, el bloque es más resistente a la separación del pasador durante el seccionamiento. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 3:Comparación de la configuración de captura de imagen. ( A &B) Los paneles A y B comparan la calidad y la resolución de la imagen en función del tiempo de permanencia de píxeles. El panel A se creó utilizando un tiempo de permanencia de 32 μs/píxel a 4 kV y sufre de una disminución de la relación señal/ruido, como es evidente en la apariencia "granulada" del recuadro ampliado. El panel B se creó utilizando un tiempo de permanencia de 100 μs/píxel a 4 kV. El aumento del tiempo de permanencia de píxeles aumenta la relación señal/ruido y revela un mayor nivel de detalle celular, sin embargo, el aumento del tiempo de permanencia de píxeles tiene el potencial de conducir a la carga de tejido y / o acumulación de calor que suaviza el bloque e introduce artefactos de corte (charla) al seccionar. Los paneles C y D comparan las imágenes capturadas en condiciones de exposición idénticas pero con dos valores de kV de haz diferentes. El tejido en estos paneles fue impregnado con partículas de nanogold en tonos dorados para hacer más evidentes las diferencias en las profundidades de penetración del haz. El panel C fue capturado a 9 kV, mientras que el panel D fue capturado a 21 kV. El aumento de kV tiene la ventaja de un mayor contraste(D),sin embargo, los detalles se pierden como resultado de la recolección de electrones de una mayor profundidad del tejido(C). Como resultado del muestreo de una sección transversal más grande, un mayor número de partículas de inmunogold específicas para GAP 43 son visibles, mientras que el etiquetado no específico sigue siendo el mismo, lo que resulta en una mayor relación señal-ruido. Panel A & B barra de escala = 2 μm. Panel C & D barra de escala = 1 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Intensidad del haz, kV y tamaño del punto. (A) Al contactar con la muestra de tejido, el haz de electrones (azul claro) produce un volumen de interacción en forma de lágrima, a partir del cual se producen diferentes formas de energía a partir de la interacción entre los electrones del haz y la muestra de tejido. La forma de lágrima es una función de la densidad del tejido y la tinción de metales pesados junto con la energía del haz, y el ángulo de inclinación del haz de electrones43. Mientras que los rayos X, los electrones sinfín y los electrones terciarios se producen durante las imágenes SBF-SEM, la principal preocupación es con los electrones retroscapersión (azul oscuro) y secundarios (verde)13. La imagen producida con imágenes SBF-SEM se produce mediante la recolección de electrones retrospersión. Estos electrones se originan a partir de interacciones elásticas entre el haz y la muestra, y la señal recogida es altamente dependiente del número atómico de átomos con los que interactúan , de ahí la necesidad de tinción de metales pesados44. Los electrones secundarios se originan a partir de interacciones inelásticas entre el haz y la muestra y la detección de su señal depende en gran medida de la orientación de la superficie. Debido a que la cara de bloque es plana en SBF-SEM, los electrones secundarios no contribuyen significativamente a la señal recogida13. De hecho, la acumulación secundaria de electrones en la superficie del bloque puede ser una fuente importante de carga y tiene un efecto perjudicial en la calidad de la imagen2. (B) Este gráfico muestra la relación entre la intensidad del haz, la kV del haz y el tamaño del punto. El tamaño del punto es la resolución espacial del haz y determina el límite de resolución de las imágenes que se producen. La reducción de kV aumenta el tamaño del punto, pero también disminuye la profundidad de la imagen, lo que permite una apreciación más fina del detalle. Esto tiene el efecto de disminuir la señal detectable también. El aumento de la intensidad del haz ofrece una mejora inicial en el tamaño del punto y la detección de señales, pero aumenta rápidamente los niveles de carga de tejido. En última instancia, la intensidad del haz y los valores de kV elegidos dependen de la muestra y se determinan mejor empíricamente en relación con la pregunta científica que se hace. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 5:Red de haz de microfibrillas sin elastina en la córnea del ratón. Reconstrucción 3D de microfibrillas (blancas) estrechamente asociadas con queratocitos (amarillo, naranja y verde) dentro del estroma corneal. Las microfibrillas se pueden ver adyacentes a, y en algunos casos dentro de surcos poco profundos en, queratocitos corneales (flechas) (A). Esta red de microfibrillas sin elastina se organizan en distintas capas dentro del estroma corneal(B). Barra de escala = 2 μm. El bloque de imagen reconstruido es de 45x45 μm en el eje x & y, y de 30 μm en el eje z con voxel una resolución de 22x22x100 nm. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 6: Reconstrucción de los nervios corneales que pasan a través de la lámina basal en el borde estromal-epitelial. Reconstrucción 3D de un nervio penetrante (púrpura) a su paso a través de la lámina basal (verde). Este nervio se puede ver para bifurcar antes de la penetración. Después de penetrar en el epitelio, ambas ramas del nervio experimentaron la ramificación. Las mitocondrias (amarillas) son visibles en las porciones stromal y epitelial del haz nervioso. Barra de escala = 2,5 μm. El bloque de imagen reconstruido es de 25x25 μm en el eje x & y, y 14 μm en el eje z con una resolución de vóxel de 12x12x100 nm. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 7:Vasculatura limbal y células asociadas en la córnea periférica del ratón. Se puede ver una sola imagen(A)de un bloque de imágenes 3D(B)a través de la cual viajan un vaso, un haz nervioso y células asociadas. El panel C muestra un vaso reconstruido (rojo) con un pericito asociado (gris) envuelto a su alrededor que cubre las uniones celulares endoteliales. Un haz nervioso (azul) se bifurca muy cerca de este vaso a medida que viaja a través del tejido. Un neutrófilo (amarillo) se puede ver paralelo al eje largo del vaso, con su núcleo polimórfico visible dentro de su cuerpo celular y el urópodo final visible como una protuberancia hacia la derecha de la imagen. Un mastocitos (magenta) es visible en la parte inferior del recipiente. El panel D aísla este mastocitos, donde sus gránulos (verdes) se pueden ver más fácilmente superponiendo el núcleo (púrpura) dentro de la célula. El panel E destaca las estructuras celulares superpuestas en las reconstrucciones celulares, con núcleos endoteliales denotados en azul, y micropartículas adherentes visibles en la luz del vaso (naranja). Las flechas muestran las fronteras célula-célula entre las células endoteliales, que se pueden ver más a fondo como crestas elevadas que se extienden a lo largo de las células en el lado luminal del recipiente. Barra de escala del panel A = 2 μm. El bloque de imagen utilizado para reconstruir estas celdas es de 30x30 μm en el eje x & y de 42,5 μm en el eje z con una resolución de vóxel de 14,6x14,6x100 nm. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 8: Red vascular reconstruida de la capa de fibra nerviosa retiniana de primates no humanos. (A) Una imagen SBF-SEM de 200x200 μm de la retina del primate tomada a 8192x8192 px. La ubicación muestreada es de ~ 500 micras del margen del borde temporal inferior de un ojo sano sin patología. Las series de imágenes reconstruidas en los paneles C &D fueron capturadas a 2048x2048 px, con imágenes pausadas para que las regiones de interés pudieran ser fotovidas a 8192x8192 px. El panel B es la región retrasada del panel A,tomada directamente de la imagen original. Nótese el gran número de axones y sus mitocondrias. (C)Sección orthoslice a través de un volumen de tejido de 200x200x200 μm de una capa de fibra nerviosa temporal inferior del ojo de control, con vasculatura segmentada. (D) Z-proyección de la vasculatura de la capa de fibra nerviosa. Esta serie ilustra la resolución posible en un campo grande utilizando esta metodología. Barra de escala del panel A = 20 μm. Barra de escala del panel B = 2 μm. La resolución voxel de la serie de imágenes es de 97.6x97.6x500 nm. La resolución de píxeles de la región de interés es de 24,4 x 24,4 nm. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 9: Segmentación y representación en volumen 3D de vasos en el danio gigante (Devario malabaricus) corazón compacto. (A) Micrografía bidimensional en una pila de imágenes, que muestra el perfil de un vaso central de tamaño venular (flecha) y un núcleo endotelial (punta de flecha), con miocitos cardíacos circundantes ricos en mitocondrias y sarcómeros bien organizados (*). (B) Micrografía bidimensional de la pila de imágenes con un recipiente de tamaño capilar (flecha). (C)Proyecciones biorthogonales de la pila de micrografías que muestran el capilar en el panel B proyectado a través de una rebanada ortogonal. (D) representación 3D de células endoteliales segmentadas que recubren el vaso reconstruido. Ilustradas en verde, rojo, azul y púrpura hay cuatro células endoteliales separadas; la celda endotelial representada en azul se puede ver en la sección transversal en el panel B (flecha), mientras que las celdas endoteliales representadas en rojo (flecha) y verde (punta de flecha) se ven en la sección transversal en el panel A. Paneles A & B barra de escala = 2 μm. El bloque de imagen reconstruido es de 30x30 μm en el eje x & y, y de 16 μm en el eje z con una resolución de vóxel de 14.6x14.6x100 nm. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 10:Complicaciones y artefactos de las imágenes. (A) La naturaleza ondulada y distorsionada de esta imagen es el resultado de la obtención de imágenes que utilizan un tiempo de permanencia de píxeles que es demasiado largo. Esto calienta el bloque de resina, dejando la cara del bloque suave y gomosa, lo que resulta en una imagen distorsionada al cortar. (B) Esta imagen contiene una gran cantidad de artefactos. El asterisco indica una distorsión ondulada causada por imágenes previas a un aumento más alto y similar al panel A,la concentración del haz en una región más pequeña con un tiempo de permanencia de píxeles más largo ha suavizado la resina en esta región de interés. Si bien la imagen de mayor aumento recopilada estaba libre de artefactos, esto puede conducir a una serie posterior de imágenes donde la muestra subyacente a la región de interés parece distorsionada. Este panel también ilustra el problema de la acumulación de escombros en la cara del bloque (flecha) durante la toma de imágenes, también denotado por la flecha en el panel E. Si esto se convierte en un problema de imagen persistente, será necesario romper el vacío, abrir la cámara y soplar los escombros acumulados en el cuchillo de diamante y alrededor de la muestra. Pequeñas descargas de electrones de la cara del bloque pueden conducir a los rápidos cambios de contraste y líneas denotadas por la punta de flecha blanca. (C) Esta imagen ilustra arañazos de cuchillo en la cara del bloque. Esto puede ocurrir debido a un cuchillo dañado, o la acumulación de escombros en el borde del cuchillo. (D) El artefacto denotado (flecha) es el resultado del haz de electrones enfocado en (sin seccionar) la cara del bloque durante un período prolongado de tiempo con la muestra todavía en la cámara de imágenes. (E) La fijación inadecuada del tejido puede conducir a la separación de las estructuras celulares y el tejido conectivo (*). (F)Si se produce una gran cantidad de carga en su bloque de tejido o resina, puede ocurrir una acumulación y descarga posterior que lleva a que la imagen "se salte" como se ve en esta imagen. Tenga en cuenta la distorsión del tejido en la imagen en estos puntos de omisión (flechas). Barra de escala del panel A = 1 μm. Barra de escala del panel B = 2 μm. Barra de escala del panel C = 5 μm. Barra de escala del panel D = 2 μm. Barra de escala del panel E = 25 um. Barra de escala del panel F = 50 um. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 11:Tejido de imagen a 3 kV utilizando varios tiempos de permanencia de píxeles e intensidades de haz. Todas las imágenes se estaban recopilando utilizando un haz de 3 kV, la intensidad del haz está en una escala específica del dispositivo que va de 1 a 20. El campo que se imagen es de la luz vascular que contiene glóbulos blancos y rojos. En esta baja kV es difícil apreciar el detalle celular. El aumento del tiempo de permanencia de píxeles tuvo poco efecto. Aumento de la intensidad del haz a 6 mejoró el contraste de la imagen. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 12:Tejido de imagen a 7 kV utilizando varios tiempos de permanencia de píxeles e intensidades de haz. Todas las imágenes se recopilaron utilizando un haz de 7 kV, la intensidad del haz está en una escala específica del dispositivo que oscila entre 1 y 20. El campo que se imagen es de la luz vascular que contiene glóbulos blancos y rojos. A 7 kV, el aumento de la intensidad del haz y el tiempo de permanencia de píxeles contribuyeron a obtener imágenes de mayor calidad. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 13:Tejido de imagen a 12 kV utilizando varios tiempos de permanencia de píxeles e intensidades de haz. Todas las imágenes se recopilaron utilizando un haz de 12 kV, la intensidad del haz está en una escala específica del dispositivo que oscila entre 1 y 20. El campo que se imagen es de la luz vascular que contiene glóbulos blancos y rojos. A 12 kV, las imágenes se optimizan ajustando el tiempo de permanencia de los píxeles y la intensidad del haz. La carga se reduce/está ausente en tiempos de permanencia de píxeles más cortos, mientras que el detalle celular y el contraste de imagen son mejores con un tiempo de permanencia de píxeles más largo y una mayor intensidad del haz. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Los autores no tienen nada que revelar.
Este protocolo delinea un método rutinario para usar la microscopia electrónica serial de la exploración de la bloque-cara (SBF-SEM), una técnica de proyección de imagen 3D potente. El uso acertado de SBF-SEM depende de técnicas apropiadas de la fijación y de la coloración del tejido, así como de la consideración cuidadosa de los ajustes de la proyección de imagen. Este protocolo contiene consideraciones prácticas para la totalidad de este proceso.
Nos gustaría agradecer al Dr. Sam Hanlon, Evelyn Brown y Margaret Gondo por su excelente asistencia técnica. Esta investigación fue apoyada en parte por los Institutos Nacionales de la Salud (NIH) R01 EY-018239 y P30 EY007551 (Instituto Nacional del Ojo), en parte por la Fundación del León para la Vista, y en parte por nih 1R15 HD084262-01 (Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano).
| 1/16 x 3/8 Remaches de aluminio Remache | industrial & Sujetador Co. | 6N37RFLAP/1100 | Se utilizan como pasadores de muestra. |
| Destornillador de cabeza plana de 2,5 mm | Wiha Quality Tools | 27225 | |
| Acetona | Microscopía Electrónica Sciences | RT 10000 | Se utiliza para diluir la pintura plateada. |
| Ácido aspártico | Sigma-Aldrich | A8949 | |
| Cloruro de calcio | FisherScientific | C79-500 | |
| Pintura de plata conductora | Ted Pella | 16062 | |
| Dispositivo de pulverización catódica al vacío Denton Desk-II equipado con un objetivo de lámina de oro estándar | Denton Vacuum | N / A | Este es el dispositivo de pulverización catódica de oro utilizado por los autores, las alternativas son aceptables. |
| Maquinillas de afeitar de doble filo | Fisher Scientific | 50-949-411 | |
| Embed 812 | Electrónica Microscopy Sciences | 14120 | |
| Gatan 3View2 montadas en un Tescan Mira3 Emisión de campo SEM | Gatan & Tescan | N/A | Este es el dispositivo SBF-SEM utilizado por los autores, se aceptan alternativas. |
| Viales de carcasa de vidrio, 0,5 DRAM (1,8 ml) | Ciencias de la microscopía electrónica | 72630-05 | |
| la microscopía electrónica | de gluteraldehído | 16320 | |
| Gorilla Super Glue - Impact Tough | NA | NA | Referido como pegamento de cianoacrilato en el texto. |
| Ketjen Black | HM Royal | EC-600JD | Referido como negro de humo en el texto. |
| KOH | FisherScientific | 18-605-593 | |
| Nitrato de plomo | Fisher Scientific | L62-100 | |
| Microondas | Pelco | BioWave Pro | Este es el microondas utilizado por los autores, las alternativas son aceptables. |
| Tetróxido de osmio | Sigma-Aldrich | 201030 | |
| Ferrocianuro de potasio | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Molde de inclusión de silicona | Ted Pella | 10504 | |
| Cacodilato de sodio Trihidrato | Microscopía electrónica Sciences | 12300 | |
| Samco Pipeta de transferencia | ThermoFisher Scientific | 202 | Se utiliza para hacer alfileres de muestras tubos de almacenamiento. |
| Limas de aguja de patrón suizo | Ciencias de microscopía electrónica | 62115 | |
| Tiocarbohidrazida | Sigma-Aldrich | 223220 | |
| Acetato de uranilo | Polysciences, Inc. | 21447-25 | |
| Reconstruction Software | |||
| Amira Software | Thermo Scientific | N/A | Se utiliza para crear las reconstrucciones que se encuentran en las figuras 5-7 y 9. |
| Fiji (Fiji is Just ImageJ) | ImageJ.net | N/A | TrakEM2 se puede agregar a Fiji para ayudar en la segmentación manual. |
| Navegador de imágenes de microscopía (MIB) | Universidad de Helsinki, Instituto de Biotecnología | N/A | |
| Software de reconstrucción | Laboratorio de sistemas neuronales | N/A | |
| SuRVoS Workbench | Fuente de luz de diamante & La Universidad de Nottingham | N/A | |
| SyGlass | IstoVisio, Inc. | N/A | Permite la reconstrucción en realidad virtual y métodos de reconstrucción basados en histogramas. |
