Proporcionamos un protocolo paso a paso para la tinción de inmunofluorescencia de montaje completo del nódulo sinoauricular (SAN) y el nódulo auriculoventricular (AVN) en corazones murinos.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Tinción de inmunofluorescencia de montaje completo, imágenes confocales y reconstrucción 3D del nódulo sinoauricular y auriculoventricular en el ratón
En este artículo
Aviso de erratum
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Resumen
Resumen
La señal eléctrica generada fisiológicamente por las células marcapasos en el nódulo sinoauricular (SAN) se conduce a través del sistema de conducción, que incluye el nódulo auriculoventricular (AVN), para permitir la excitación y contracción de todo el corazón. Cualquier disfunción de SAN o AVN resulta en arritmias, lo que indica su papel fundamental en la electrofisiología y la arritmogénesis. Los modelos de ratón son ampliamente utilizados en la investigación de arritmias, pero la investigación específica de SAN y AVN sigue siendo un desafío.
La RAS se encuentra en la unión de la crista terminal con la vena cava superior y la AVN se encuentra en el vértice del triángulo de Koch, formado por el orificio del seno coronario, el anillo tricúspide y el tendón de Todaro. Sin embargo, debido al pequeño tamaño, la visualización por histología convencional sigue siendo un desafío y no permite el estudio de SAN y AVN dentro de su entorno 3D.
Aquí describimos un enfoque de inmunofluorescencia de montaje completo que permite la visualización local de SAN y AVN de ratón marcados. La tinción de inmunofluorescencia de montaje completo está diseñada para secciones más pequeñas de tejido sin necesidad de seccionamiento manual. Para este propósito, se disecciona el corazón del ratón, se elimina el tejido no deseado, seguido de fijación, permeabilización y bloqueo. Las células del sistema de conducción dentro de SAN y AVN se tiñen con un anticuerpo anti-HCN4. La microscopía de barrido láser confocal y el procesamiento de imágenes permiten diferenciar entre las células ganglionares y los cardiomiocitos que funcionan, y localizar claramente SAN y AVN. Además, se pueden combinar anticuerpos adicionales para etiquetar otros tipos de células, como las fibras nerviosas.
En comparación con la inmunohistología convencional, la tinción de inmunofluorescencia de montaje completo preserva la integridad anatómica del sistema de conducción cardíaca, lo que permite la investigación de AVN; especialmente en su anatomía e interacciones con el miocardio circundante y las células no miocitarias.
Introducción
Las arritmias son enfermedades comunes que afectan a millones de personas y son la causa de una morbilidad y mortalidad significativas en todo el mundo. A pesar de los enormes avances en el tratamiento y la prevención, como el desarrollo de marcapasos cardíacos, el tratamiento de las arritmias sigue siendo un desafío, principalmente debido al conocimiento muy limitado sobre los mecanismos subyacentes de la enfermedad 1,2,3. Una mejor comprensión tanto de la electrofisiología normal como de la fisiopatología de las arritmias puede ayudar a desarrollar estrategias de tratamient....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
El cuidado de los animales y todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Comité de Cuidado y Ética Animal de la Universidad de Munich, y todos los procedimientos realizados en ratones fueron aprobados por el Gobierno de Baviera, Munich, Alemania (ROB-55.2-2532.Vet_02-16-106, ROB-55.2-2532.Vet_02-19-86). Los ratones C57BL6/J fueron comprados en el Laboratorio Jackson.
NOTA: La figura 1 muestra los instrumentos necesarios para el experimento. La figura 2 muestra una ilustración de la a....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Mediante el uso del protocolo descrito anteriormente, se pueden realizar imágenes de microscopía confocal de SAN y AVN de manera confiable. La tinción específica del sistema de conducción utilizando anticuerpos fluorescentes dirigidos a HCN4 y la tinción del miocardio de trabajo utilizando anticuerpos fluorescentes dirigidos a Cx43 permite la identificación clara de SAN (Figura 5, Video 1) y AVN (Figura 6, Video 2
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
La anatomía cardíaca ha sido tradicionalmente estudiada utilizando secciones histológicas delgadas11. Sin embargo, estos métodos no preservan la estructura tridimensional del sistema de conducción y, por lo tanto, solo proporcionan información 2D. El protocolo de tinción de inmunofluorescencia de montaje completo descrito aquí permite superar estas limitaciones y se puede usar de forma rutinaria para imágenes SAN y AVN.
En comparación con los métodos estándar, como la i.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Consejo de Becas de China (CSC, a R. Xia), el Centro Alemán de Investigación Cardiovascular (DZHK; 81X2600255 a S. Clauss, 81Z0600206 a S. Kääb), la Fundación Corona (S199/10079/2019 a S. Clauss), el SFB 914 (proyecto Z01 a H. Ishikawa-Ankerhold y S. Massberg y proyecto A10 a C. Schulz), el ERA-NET sobre Enfermedades Cardiovasculares (ERA-CVD; 01KL1910 a S. Clauss) y la Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (a S. Clauss). Los financiadores no tuvieron ningún papel en la preparación del manuscrito.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| anestesia fuerte< / fuerte> | |||
| isoflurano | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Incluye una cámara de inducción, una unidad de evacuación de gases y filtros de carbón |
| vegetal Circuito Bain modificado | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Incluye una máscara de anestesia para ratones |
| Plataforma quirúrgica | Kent Scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentación | |||
| Pinzas finas | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Tijeras de iris | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Tijeras de resorte | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Pinzas de tejido | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Alfileres de pañuelo | Fine Science Tools | 26007-01 | Podría usar agujas de 27G como sustituto |
| General lab instruments | |||
| Orbital agitador Sunlab | D-8040 | ||
| Agitador magnético | IKA | básica | |
| , volumen 10 y micro; L, 100 y micro; L, 1000 y micro; L | Microscopios Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Microscopio | |||
| estereoscópico de disección con zoom | VWR | 10836-004 | |
| Microscopio confocal de barrido láser | Zeiss | LSM 800 | |
| Software | |||
| Imaris 8.4.2 | Oxford instruments | ||
| ZEN 2.3 SP1 negro | Zeiss | ||
| General Lab Material | |||
| 0,2 y micro; m filtro de jeringa | Sartorius | 17597 | |
| placa de Petri de 100 mm | Falcon | 351029 | |
| 27G aguja | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Tubo cónico de polipropileno | Falcon | 352070 | |
| 5ml Jeringa | Braun | 4606108V | |
| Cubrecubreobjetos | Thermo Scientific | 7632160 | |
| Tubos Eppendorf | Eppendorf | 30121872 | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | Componentes de la solución de |
| formaldehído al 16% | Thermo Scientific | 28908 | uso como solución al 4% |
| Ácido acético | Merck | 100063 | Componentes del TÉ |
| Agarosa | Biozym | 850070 | |
| Albúmina sérica bovina | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco | Gibco | 14190-094 | |
| Suero de cabra normal | Sigma | NS02L | |
| Sacarosa | Sigma | S1888-1kg | |
| Tris-base | Roche | TRIS-RO | Componentes de TEA |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ml | diluido al 1% en PBS |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ml | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 y nbsp; mL | Braun Melsungen | ||
| Isoflurano 1 mL/mL | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxígeno 5 L | Linde | 2020175 | Incluye un regulador |
| de presiónAnticuerpos | |||
| Cabra anti-Conejo IgG Alexa Fluor 488 y semejanzas; | Tecnología de Señalización Celular | #4412 | diluido a 1:200 |
| IgG anti-Rata de cabra Alexa Fluor 647 | Invitrogen | #A-21247 | diluido a 1:200 |
| Hoechst 33342, Triclorhidrato, Trihidrato (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluido a 1:1000 |
| Conejo Anti-Connexina-43 | Sigma | C6219 | diluido a 1:200 |
| Rata anti-HCN4 (SHG 1E5) | Invitrogen | MA3-903 | diluido a 1:200 |
| Otro | |||
| plexiglás | |||
| Plastilina | Cernit | 49655005 | |
| , Baysilone | VWR | 291-1220 | |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | El Laboratorio |
Referencias
- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Reviews Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Clauss, S., et al. Characte....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
Erratum
Formal Correction: Erratum: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse
Posted by JoVE Editors on 2/21/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse. The Authors section was updated from:
Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilian University Munich
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine, Ludwig Maximilian University Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance
to:
Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
2Institute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance
