Aquí, describimos un método simple que combina el hibridación in situ de la fluorescencia del ARN (RNA-PESCADO) con la inmunofluorescencia para visualizar el ARN agudo severo del coronavirus 2 del coronavirus del síndrome respiratorio (SARS-CoV-2). Este protocolo puede aumentar la comprensión de las características moleculares de las interacciones ARN-huésped SARS-CoV-2 a nivel unicelular.
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Artículo de método
Visualización Del SARS-CoV-2 Usando Inmuno ARN-Fluorescencia Hibridación In Situ
En este artículo
Resumen
Resumen
Este manuscrito proporciona un protocolo para la reacción en cadena in situ del hibridación (HCR) juntada con inmunofluorescencia para visualizar el ARN agudo severo del coronavirus 2 del coronavirus (SARS-CoV-2) del síndrome respiratorio agudo en variedades de células y culturas tridimensionales (3D) del epitelio humano de la vía aérea. El método permite la visualización altamente específica y sensible del ARN viral confiando en el HCR iniciado por la localización de la punta de prueba. Las sondas de iniciador dividido ayudan a amplificar la señal mediante amplificadores marcados fluorescentemente, lo que resulta en una fluorescencia de fondo insignificante en la microscopía confocal. El etiquetado de amplificadores con diferentes colorantes fluorescentes facilita el reconocimiento simultáneo de varios objetivos. Esto, a su vez, permite el mapeo de la infección en los tejidos para comprender mejor la patogénesis viral y la replicación a nivel unicelular. El acoplamiento de este método con la inmunofluorescencia puede facilitar una mejor comprensión de las interacciones huésped-virus, incluida la alternancia del epigenoma del huésped y las vías de respuesta inmune. Debido a la tecnología sensible y específica del HCR, este protocolo también se puede utilizar como herramienta de diagnóstico. También es importante recordar que la técnica puede modificarse fácilmente para permitir la detección de cualquier ARN, incluidos los ARN no codificantes y los virus de ARN que puedan surgir en el futuro.
Introducción
El SARS-CoV-2 es un nuevo betacoronavirus humano que surgió a finales de 2019, causando una pandemia sin precedentes unos meses después. Debido a que el virus es nuevo para la ciencia, gran parte de su biología y su impacto en las células huésped siguen siendo desconocidos. Por lo tanto, el mapeo del tropismo virus-célula y -tejido durante la infección es importante si se quieren entender sus características biológicas básicas y sus efectos sobre el huésped. Varias técnicas se utilizan para examinar la interacción virus-huésped incluyendo análisis bioquímicos, biológicos, y físicos. El hibridación in situ es un método común que emplea la DNA complementaria etiquetada,....
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Protocolo
1. Preparación del tampón
- Para 500 mL de tampón 2x PHEM, combine 18,14 g de piperazina-N,N′-bis(ácido 2-etanosulfónico) (PIPES), 6,5 g de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina etanesulfónico (HEPES), 3,8 g de ácido tetraacético de etilenglicol (EGTA) y 0,99 g de sulfato de magnesio (MgSO4). Haga el volumen hasta ~ 400 mL con agua destilada (dH2O), revuelva y ajuste el pH a 7.0 usando hidróxido de potasio (KOH) de 10 M o hidróxido de sodio (NaOH). Haga el volumen final hasta 500 mL, y luego divida en alícuotas de 50 mL. Conservar a -20 °C hasta que sea necesario.
Nota : el búfer no estará claro hasta que el pH alcanza 7.0.
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Resultados
El protocolo inmuno-ARN-FISH descrito en este manuscrito se llevó a cabo utilizando dos sistemas celulares: una línea celular Vero y un cultivo de AICH 3D. Los pasos principales para ambos modelos celulares se muestran en la Tabla 2. El protocolo RNA-FISH para la visualización del SARS-CoV-2 en cultivos de AHAE incluye pasos típicos para muestras de tejido, es decir, permeabilización con MeOH al 100% y rehidratación a través de una serie graduada de soluciones meOH-PBS y .......
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Discusión
Immuno-RNA-FISH es un método confiable para la doble-coloración del ARN y de las proteínas celulares. Aquí, se ha descrito un protocolo modificado de inmuno-ARN-FISH que permite la detección de ARN sars-CoV-2 y proteínas celulares en líneas celulares y cultivos de AE. Este protocolo se puede adaptar para su uso en diferentes modelos celulares, incluyendo monocapas celulares o tejidos específicos. El método se basa en el concepto de un HCR iniciado por la localización apropiada de la sonda. A continuación, el uso de sonda.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de Ciencia y Educación Superior para la investigación sobre el SARS-CoV-2, y por subvenciones del Centro Nacional de Ciencias (subvenciones UMO2017/27/B/NZ6/02488 a K.P. y UMO-2018/30/E/NZ1/00874 a A.K.-P.).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Equipo | |||
| Microscopio confocal LSM 880 | ZEISS | ||
| Grant Bio, Mini Rocker- Shaker | Fisher Scientific | 12965501 | |
| Incubadora Galaxy170R | New Brunswick | CO170R-230-1000 | |
| Thermomixer Comfort | Eppendorf | 5355 000 011 | |
| Materiales | |||
| 15 mm x 15 mm N.º 1 cubreobjetos | LabSolute | 7695022 | |
| tubos de 1,5 ml | FL-MEDICAL | 5.350.023.053 | |
| placa de 12 pocillos | TTP | 92412 | |
| Tubo centrífugo cónico | Sarstedt | 5.332.547.254 | |
| parafilm | Sigma | P7793-1EA | |
| pipetas serológicas | Colección VWR | 612-5523P, 612-5827P portaobjetos | |
| vidrio | PTH CHEMLAND | 04-296.202.03 | |
| Transwell ThinCerts | Grainer bio-one | 665641 | |
| Reactivos | |||
| Alexa fluoróforo 488 anticuerpos secundarios conjugados | Invitrogen | ||
| β 5-tubulina | Santa Cruz Biotechnology | sc-134234 | |
| DAPI | Thermo Scientific | D1306 | |
| Fosfato disódico | Sigma | S51136-500G | |
| EGTA | BioShop | EGT101.25 | |
| HCR Tampón de amplificación | Molecular Instruments, Inc. | BAM01522 | tampón también se puede preparar doi:10.1242/dev.165753: Información complementaria |
| Amplificador HCR B1-h1 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | ||
| Amplificador S013922 HCR B1-h2 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | ||
| Tampón de hibridación de sonda HCR | Molecular Instruments, Inc. | BPH03821 | tampón también se puede preparar doi:10.1242/dev.165753: |
| Conjunto de sondas HCR de información complementaria para SARS-CoV-2 Ncapsid | Molecular Instruments, Inc. | PRE134 | |
| Tampón de lavado con sonda HCR | Molecular Instruments, Inc. | BPW01522 | tampón también se puede preparar doi:10.1242/dev.165753: Información complementaria |
| HEPES | BioShop | HEP001.100 | |
| Sulfato de magnesio heptahidratado | Sigma | 63138-250G | |
| Metanol | Sigma | 32213-1L-M | |
| Fosfato monopotásico | Sigma | P5655-100G | |
| Paraformaldehído | Sigma | P6148-1KG | |
| TUBOS | BioShop | PIP666.100 | |
| Cloruro de potasio | Sigma | P5405-250G | |
| Prolong Diamond Antidecoloración Medio de montaje | Invitrogen | P36970 | |
| Cloruro de sodio | BioShop | SOD001.5 | |
| Citrato trisódico 2-hidrato | POCH | 6132-04-3 | |
| Tween-20 | BioShop | TWN580.500 | |
| Software | |||
| Fluorescence Spectraviewer | Modelado de parámetros espectrales | ||
| ImageJ Fiji | Adquisición y procesamiento de imágenes z-stack |
Referencias
- Choi, H. M. T., et al. Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development. 145, (2018).
- Milewska, A., et al.
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Reimpresiones y permisos
