Aquí se presenta un protocolo de microinyección embrionaria de Helicoverpa armigera (Hübner) e identificación de mutantes knockout creado por la edición del genoma CRISPR / Cas9. Los insectos mutantes permiten una mayor investigación de la función génica y la interacción entre diferentes genes in vivo.
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Artículo de método
Microinyección embrionaria e identificación de mutantes knockout de Helicoverpa armigera editada por el genoma CRISPR/Cas9 (Hübner)
En este artículo
Resumen
Resumen
El gusano del algodón, Helicoverpa armigera, es una de las plagas más destructivas del mundo. Una combinación de genética molecular, fisiología, genómica funcional y estudios de comportamiento ha hecho de H. armigera una especie modelo en Lepidoptera Noctuidae. Para estudiar las funciones in vivo y las interacciones entre diferentes genes, la tecnología de edición del genoma agrupadas regularmente interespaciadas de repeticiones palindrómicas cortas (CRISPR) / proteína 9 asociada (Cas9) es un método conveniente y efectivo utilizado para realizar estudios genómicos funcionales. En este estudio, proporcionamos un método sistemático paso a paso para completar la eliminación de genes en H. armigera utilizando el sistema CRISPR / Cas9. El diseño y la síntesis del ARN guía (ARNg) se describen en detalle. Luego, se resumen los pasos posteriores que consisten en el diseño de cebadores específicos de genes para la creación de ARN guía (ARNg), la recolección de embriones, la microinyección, la cría de insectos y la detección de mutantes. Finalmente, se proporcionan consejos y notas para la solución de problemas para mejorar la eficiencia de la edición de genes. Nuestro método servirá como referencia para la aplicación de la edición del genoma CRISPR/Cas9 en H. armigera así como en otras polillas lepidópteras.
Introducción
La aplicación de la tecnología de edición del genoma proporciona una herramienta eficiente para lograr mutantes de genes objetivo en diversas especies. La aparición del sistema agrupado de repeticiones palindrómicas cortas (CRISPR)/proteína 9 asociada (Cas9) agrupadas regularmente interespaciadas proporciona un método novedoso para manipular genomas1. El sistema CRISPR/Cas9 consiste en un ARN guía (ARNg) y la endonucleasa Cas92,3, mientras que el ARNg se puede dividir en dos partes, un ARN CRISPR complementario objetivo (ARNcr) y un ARNcr transactivante (ARNtra). El ARNg se integra con ....
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Protocolo
1. Diseño de cebadores específicos de genes y preparación de sgRNA
- Verificar una región genómica conservada en el gen de interés mediante análisis de amplificación y secuenciación por PCR. Amplificar el gen diana del ADN genómico de H. armigera y distinguir los exones e intrones.
NOTA: La especificidad de la secuencia del sitio guía es necesaria para evitar la edición de genes fuera del objetivo. Busque posibles sitios guía en los exones que están cerca de los 5' UTR del gen. Entonces, es importante asegurarse de que el gen no funcione por completo. Un resumen de la ruta de flujo para la preparación de sgRNA se ilustra en la ....
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Resultados
Este protocolo proporciona pasos detallados para obtener líneas de eliminación de genes de H. armigera utilizando la tecnología CRISPR/Cas9. Los resultados representativos obtenidos por este protocolo se resumen para la selección de gDNA, la recolección e inyección de embriones, la cría de insectos y la detección de mutantes.
En este estudio, el sitio objetivo de nuestro gen de interés se localizó en su segundo exón (
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Discusión
La aplicación del sistema CRISPR/Cas9 ha proporcionado un potente soporte técnico para el análisis de la función génica y la interacción entre varios genes. El protocolo detallado que presentamos aquí demuestra la generación de un mutante homocigoto en H. armigera a través de la edición del genoma CRISPR/Cas9. Este procedimiento confiable proporciona una forma sencilla para la mutagénesis genética dirigida en H. armigera.
La elección de los sitios diana CRISPR podría afectar .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen ningún conflicto de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31725023, 31861133019 a GW y 31171912 a CY).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Escalera de ADN de 2kb | TransGen Biotech | BM101 | |
| Vidrio capilar | World Precision Instrucments | 504949 | conoce como "vidrio capilar" en el protocolo |
| Cinta de doble cara | Mining and Manufacturing Corporation | 665 | |
| Eppendorf FemtoJet 4i Microinyector | Eppendorf Eppendorf Corporate | E5252000021 | |
| Micromanipulador Eppendorf InjectMan 4 | Eppendorf Corporate | 5192000051 | |
| Puntas de pipeta de microcargador Eppendorf | Eppendorf Corporate | G2835241 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Fisher Scientific | A29377 | |
| Microscopio Slide | Sail Marca | 7105 | |
| Microscopio Olympus | Olympus Corporation | SZX16 | |
| PrimeSTAR HS (Premezcla) | Takara Biomedical Technology | R040 | utilizado para la detección de mutantes |
| Sutter Micropipeta Puller Sutter | Instrument Company | P-1000 | |
| TIANamp Kit de ADN Genómico TIANGEN | Corporate | DP304-03 | |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36499 |
Referencias
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
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Reimpresiones y permisos
