Evaluación Funcional De La Permeabilidad Intestinal Y La Migración Transepitelial Neutrófilo En Ratones Usando Un Modelo De Bucle Intestinal Estandarizado

La mucosa intestinal abarca una sola capa de células epiteliales intestinales columnares (IECs), las células inmunes subyacentes del propria de la lámina y las mucosas de los muscularis. Además de su papel en la absorción de nutrientes, el epitelio intestinal es una barrera física que protege el interior del cuerpo de las bacterias comensales luminales, patógenos y antígenos dietéticos. Además, los IECs y las células inmunes de la lámina propia coordinan la inmunorespuesta que induce tolerancia o respuesta dependiendo del contexto y de los estímulos. Se ha divulgado que la interrupción de la barrera epitelial puede preceder el inicio de la inflamación de la mucosa patológica y contribuir a la enfermedad de intestino inflamatoria (IBD) que abarca colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn^{1,2,3,4,5,6,7.} Los individuos con colitis ulcerosa presentan migración transepitelial excesiva (TEpM) de neutrófilos polimorfonucleares (PMN) formando abscesos de cripta, hallazgo que se ha asociado con la gravedad de la enfermedad^8,9. Aunque la función epitelial comprometida de la barrera y las inmunorespuestas excesivas sean sellos de IBD, hay una carencia de análisis in vivo experimentales para realizar evaluaciones cuantitativas de la permeabilidad intestinal y del reclutamiento de la célula inmune en la mucosa intestinal.

Los métodos más comunes utilizados para estudiar la permeabilidad epitelial intestinal y PMN TEpM emplean enfoques basados en cámaras ex vivo utilizando monocapas IEC cultivadas en insertos de membrana porosa semipermeables^10,11,12. La integridad de la barrera epitelial es supervisada por mediciones de la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) o el flujo paracelular del isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrano marcado desde el compartimento apical al basal^13,14,15. Del mismo modo, pmn TEpM se estudia típicamente en respuesta a un quimioatrayente que se añade en la cámara baja¹⁶. Los PMN se colocan en la cámara superior y después de un período de incubación, los PMN que han migrado al compartimento basal se recogen y cuantifican. Si bien estos métodos son útiles, fáciles de realizar y muy reproducibles, son obviamente enfoques reduccionistas y no necesariamente representan un reflejo preciso de las condiciones in vivo.

En ratones, un ensayo común para estudiar la permeabilidad paracelular intestinal es por sonda oral de FITC-dextrano y posterior medición de la aparición de FITC-dextrano en el suero sanguíneo^13,17. La desventaja de este análisis es que representa una evaluación de la integridad total de la barrera del aparato gastrointestinal bastante que la de contribuciones intestinales regionales. Además, el azul de Evans se utiliza comúnmente para evaluar la fuga vascular in vivo¹⁸ y también se ha empleado para evaluar la permeabilidad de la mucosa intestinal en ratones y ratas^19,20,21. La cuantificación del azul de Evans en la mucosa intestinal requiere la extracción del tejido que emplea la incubación en formamida durante la noche. Por lo tanto, el mismo tejido no se puede utilizar para estudiar la permeabilidad epitelial intestinal y la infiltración de neutrófilos.

Aquí destacamos un protocolo simple que reduce el número de animales necesarios para recoger datos reproducibles sobre la permeabilidad de la mucosa colónica y la migración transepitelial leucocito in vivo. Por lo tanto, recomendamos el uso de FITC-dextrans que son fácilmente perceptibles en suero sanguíneo sin comprometer la integridad de los lazos intestinales que se pueden cosechar para el análisis adicional. Cabe destacar que los bucles ligados intestinales se han utilizado en varias especies (incluyendo ratón, rata, conejo, ternero) para estudiar la infección bacteriana (como Salmonella, Listeria monocytogenes y Escherichia coli)^22,23,24,25, así como la permeabilidad intestinal^26; sin embargo, al mejor de nuestro conocimiento no hay estudios que investigan mecanismos de PMN TEpM en regiones específicas en el intestino tal como íleo o dos puntos que están implicados comúnmente en IBD.

Aquí describimos el modelo del lazo intestinal del ratón (iLoop) que es un método in vivo microquirúrgico robusto y confiable que emplea un segmento intestinal bien-vascularizado y exteriorizado del íleon o de los dos puntos próximos. El modelo iLoop es fisiológicamente relevante y permite la evaluación de la integridad de la barrera intestinal y pmn TEpM en ratones vivos bajo anestesia. Demostramos dos aplicaciones: 1) cuantificación de los niveles séricos de 4 kDa FITC-dextrano después de la administración intraluminal en el iLoop 2) cuantificación de PMN transmigrado en el lumen iLoop después de la inyección intraluminal del potente quimiotractor Leucotrieno B₄ (LTB₄₎^27. Por otra parte, la utilización del modelo iLoop con Jam-a-null ratones o ratones que albergan la pérdida selectiva de JAM-A en IECs (Villin-cre; Jam-a ^fl/fl)en comparación con los ratones control, podemos corroborar estudios previos que han reportado una importante contribución de la proteína jam-A asociada a la unión apretada a la permeabilidad intestinal y la transmigración de neutrófilos^{15,28,29,30,31.}

El modelo iLoop es un método altamente funcional y fisiológico que se puede utilizar para corroborar ensayos in vitro. Además, se trata de un modelo experimental versátil que permite el estudio de diversos reactivos que se pueden inyectar en la luz del asa, incluyendo quimiocinas, citoquinas, patógenos bacterianos, toxinas, anticuerpos y terapéuticas.

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices y políticas de los Institutos Nacionales de Salud y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Michigan.

1. Preparación preoperatoria

NOTA: Este método se generó empleando ratones adultos de fondo genético C57BL/6, de 8 a 12 semanas de edad. Todos los ratones fueron mantenidos bajo condiciones libres específicas estrictas del patógeno con el acceso ad libitum al chow y al agua normales. Los resultados se obtuvieron utilizando C57BL/6, Jam-a - ratones nulos (Jam-a^-/-) o ratones que albergan pérdida selectiva de JAM-A en IECs (Villin-cre; Jam-a^fl/fl) y littermate Jam-a^fl/fl controles como se describió anteriormente³⁰.

1. Preparación del área
   1. Realizar cirugía en zona limpia. El modelo de bucle intestinal, sin embargo, es una cirugía de no supervivencia que no requiere una técnica aséptica / estéril. Observe las prácticas de saneamiento veterinario y use instrumentos quirúrgicos limpiados (es decir, fregados con jabón, enjuagados con agua seguidos de etanol al 70%).
   2. Encienda una tabla quirúrgica con temperatura controlada (o almohadillas de calefacción) y una fuente de luz adaptada para evitar que el animal se hígena durante la anestesia y la cirugía.
   3. Preparar ligaduras cortando segmentos de 6 cm de suturas quirúrgicas de seda 4-0 no absorbibles.
   4. Preparar gasas de algodón (5 cm x 5 cm) que se cortan en el centro siguiendo una forma elipsoide. Estos se utilizarán para cubrir la laparotomía de la línea media y evitar el contacto directo entre el iLoop exteriorizado y el pelaje animal. Remoje las gasas cortadas en la solución de sal balanceada (HBSS) de Hanks caliente en un recipiente de placa de Petri.
   5. Prepare hisopos de algodón húmedo empapados en HBSS caliente que se utilizarán para manejar órganos y iLoop exteriorizado.
   6. Prepare una jeringa de 10 ml llena de HBSS caliente y adjúntela a una sonda de alimentación amarilla. Esta jeringa se utilizará para hidratar los tejidos expuestos durante la cirugía y para enjuagar suavemente el iLoop de contenido fecal.
2. Preparación animal
   1. Anestesiar al animal de acuerdo con el protocolo animal aprobado. En este protocolo se administra una mezcla de isoflurano y oxígeno a través de un vaporizador de anestesia. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, ajuste el caudal de oxígeno a 1 L/min. Fije el vaporizador al 5% y precarte la cámara de inducción. Después de 5 min, reduzca el vaporizador de isoflurano al 2% - 2.5%.
   2. Coloque el animal en la cámara de inducción durante 3 min - 5 min, luego transfiera el animal a una tabla de cirugía calentada y conecte un tapón de nosecona de anestesia. Sujete al animal en decúbito supino por las cuatro extremidades con cinta adhesiva.
      NOTA: Como alternativa anestésica, una mezcla de ketamina (80 mg/kg - 100 mg/kg) y xilazina (5 mg/kg - 10 mg/kg) diluida en solución salina (0,9% NaCl) puede administrarse por inyección intraperitoneal. La anestesia se debería mantener durante toda la cirugía por la administración intramuscular de ketamina/xylazine (en 0.1 - 0.25 veces de dosis iniciales) para asegurar profundidad anestésica. Si está disponible, se recomienda encarecidamente un vaporizador de anestesia con isoflurano para asegurar una mejor reproducibilidad, supervivencia y prevenir el dolor animal.
   3. Aplique ungüento oftálmico en ambos ojos para prevenir la desecación corneal.
   4. Realizar un examen físico que incluya frecuencia cardíaca (alrededor de 500 latidos/min) y ritmo, color de la membrana mucosa (rosa), tiempo de recarga capilar (< 2 s), frecuencia respiratoria (no inferior a 40 - 60 respiraciones/min) y temperatura (36,5 °C)^32.
   5. Antes de proceder a los siguientes pasos, evalúe la profundidad anestésica mediante el reflejo de retirada del pedal. Emplear un estímulo doloroso (pellizco) de la piel entre los dedos de los dedos de los dedos y / o almohadillas de los dedos de los dedos de los dedos de los artículos. El ratón responderá contrayéndose y quitando su pierna. Este reflejo del pedal desaparece cuando el animal es anestesiado profundamente.
      NOTA: El monitoreo de los signos vitales y el reflejo del pedal se recomiendan durante toda la anestesia como mínimo cada 15 min. Las pautas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC, por sus, para evaluar la profundidad anestésica) recomiendan el monitoreo de lo siguiente: (a) el color de la cola, el pie y la membrana mucosa (como la lengua). Color rosado como normal y pálido o azul como indicativo de disminución de la perfusión sanguínea o dificultad respiratoria; (b) evaluación del patrón de respiración como respiraciones regulares versus irregulares. Una sonda de temperatura rectal, oxímetro de roedores y monitores de frecuencia cardíaca se pueden utilizar para la evaluación de la temperatura corporal, las frecuencias cardíacas y respiratorias, respectivamente.

2. Generación del bucle iléil

1. Preparación de la piel: Frote el pelaje de la línea media abdominal con hisopos de alcohol o esponja de gasa empapada con etanol al 70%. No moje una amplia área de piel con alcohol para prevenir la hipotermia.
2. Usando tijeras, realice una laparotomía de la línea media. Haga una incisión vertical en el centro del abdomen (aproximadamente 2 cm de longitud) y exponga el peritoneo. Tenga cuidado de no lesionar los órganos intraabdominales.
3. Coloque una gasa de algodón húmeda precorte sobre la cavidad intraabdominal expuesta.
4. Use hisopos de algodón húmedos para movilizar y exteriorizar el ciego. Coloque cuidadosamente el ciego en la gasa de algodón mojada.
   NOTA: El ciego se localiza en el cuadrante caudal izquierdo de la cavidad abdominal en la mayoría de los ratones independientemente del sexo del animal.
5. Utilice hisopos de algodón húmedos para movilizar y exteriorizar suavemente el íleon cuya sección terminal (extremo distal) está unida al ciego (Figura 1B).
6. Despliegue al menos 6 cm de íleon terminal en la gasa de algodón húmeda sin interrupción de los vasos mesentéricos y el suministro de sangre. El suministro de sangre se mantiene si no hay sangrado y el tejido mantiene su color rosado (Figura 1B).
   NOTA: Evite el secado de los tejidos expuestos manteniendo los tejidos húmedos en todo momento con HBSS caliente (cada 2 - 3 min) utilizando una jeringa de 10 ml unida a una sonda de alimentación amarilla (paso 1.1.6).
7. Cerca del ciego, identifique la arteria principal que suministra el íleon en el mesenterio. Luego localice dos sitios de ligadura en el mesenterio que estén libres de vasos sanguíneos críticos.
8. Usando fórceps de tejido romo, agarrar firmemente el íleon terminal (más cercano al ciego) y usar fórceps de punta fina, fenestrar el mesenterio evitando los vasos sanguíneos. Coloque la sutura de seda a través de la perforación y ate un nudo quirúrgico para crear la primera ligadura (extremo distal del asa).
9. Utilice la regla para medir 4 cm de distancia de la primera ligadura y crear la segunda ligadura (extremo proximal del bucle) como se menciona en el paso 2.8 (Figura 1C).
10. Con tijeras finas cortar cuidadosamente junto a cada ligadura para aislar el asa iléica de 4 cm, manteniendo intacto el suministro de sangre y la membrana mesentérica.
    NOTA: Corte ambos extremos del segmento exteriorizado del iLoop, luego enjuague suavemente como un paso necesario que evite la interferencia con el contenido luminal (materia fecal), facilitando así la dispersión uniforme de FITC-dextrans o estímulos quimiotácticos a lo largo de toda la longitud del segmento aislado, así como permitiendo una cuantificación más precisa de los leucocitos por citometría de flujo. Este procedimiento también permite la distensión uniforme de la mucosa después de la inyección de volúmenes especificados de reactivo y una mejor reproducibilidad entre los animales.
11. Enjuague suavemente el contenido del segmento del asa ilérea con HBSS caliente utilizando una sonda de alimentación amarilla flexible conectada a una jeringa de 10 ml (ver paso 1.1.6).
12. Ligar los dos extremos de corte del lazo iléleo enrojecido usando sutura de seda.
13. Use una jeringa de 1 ml con aguja de 30 G para inyectar lentamente 250 μL de reactivo como FITC-dextrans (paso 4.2) o quimioquina (paso 5.3) en la luz intestinal. El asa ilérea se inflará provocando una distensión moderada de la mucosa(Figura 1D).
    NOTA: Inyecte el reactivo en la luz del asa en el lado opuesto de la arteria mesentérica. Tenga cuidado de no sacar el asa iléil del animal mientras se inyecta para evitar el desgarro de los vasos sanguíneos e inducir sangrado.
14. Usando hisopos de algodón húmedos, vuelva a colocar suavemente el asa ilélea, el íleon proximal y el ciego.
15. Use un porta agujas, espérceps anatómicos y 3.0 suturas de seda no absorbibles con aguja de corte inverso para cerrar la pared abdominal.
16. Coloque al animal en una cámara de anestesia regulada por temperatura durante el período de incubación.

3. Generación del bucle del colon proximal (pcLoop)

Nota : para obtener detalles acerca de los ratones que se utilizaron para la generación de pcLoop, consulte la información proporcionada al principio de la sección de protocolo.

1. Realice los pasos 2.1. - 2.4. como se describió anteriormente para el bucle ileal.
2. Usando hisopos de algodón húmedos, exteriorice todo el íleon y colócelo en la parte superior de una gasa de algodón húmeda. Identificar el colon proximal y el suministro de sangre localizado en el mesocolon. Movilizar el colon proximal y mediante el uso de fórceps de punta fina crear la primera ligadura en un área libre de vasos en el mesocolon a unos 0,5 cm distales del ciego (Figura 2B).
3. Medir 2 cm desde la primera ligadura y crear una segunda ligadura en una zona libre de suministro de sangre en el mesocolon (Figura 2C).
4. Usando tijeras finas corta cuidadosamente al lado de cada ligadura para aislar un pcLoop de 2 cm de largo.
   Nota : como se menciona en la nota en el paso 2.10, es importante cortar ambos extremos para aislar un pcLoop que se limpia suavemente de contenido luminal. Corte cuidadosamente a través del tejido colónico y el mesocolon para evitar que los pequeños vasos sangran en la luz intestinal. Si es necesario, use cauterización térmica para limitar el sangrado en el sitio de la incisión.
5. Enjuague suavemente el pcLoop con HBSS caliente para eliminar las heces utilizando una sonda de alimentación amarilla flexible conectada a la jeringa de 10 ml (ver paso 1.1.6).
6. Ligar los dos extremos de corte del pcLoop enrojecido usando sutura de seda.
7. Use una jeringa de 1 ml con aguja de 30G para inyectar lentamente 200 μL de reactivo como FITC-dextrans (paso 4.2) o quimioquina (paso 5.3) en la luz intestinal. El pcLoop se inflará provocando una distensión moderada de la mucosa(Figura 2D).
   NOTA: Inyecte el reactivo en el lumen pcLoop en el lado opuesto de la arteria mesentérica. Asegurar la consistencia entre los animales y crear un pcLoop de 2 cm de largo para asegurar la misma distensión de la mucosa.
8. Utilice hisopos de algodón húmedos para colocar suavemente de nuevo el pcLoop, el íleon y el ciego ligados en la cavidad abdominal.
9. Use un porta agujas, espérceps anatómicos y 3.0 suturas de seda no absorbibles con aguja de corte inverso para cerrar la pared abdominal.
10. Coloque al animal en una cámara de anestesia regulada por temperatura durante el período de incubación.

4. Evaluación cuantitativa de la permeabilidad intestinal: ensayo fitc-dextrano de 4 kDa

1. Realice un bucle ileal o pcLoop (como se describió anteriormente).
2. Usando una jeringa de 1 mL con aguja de 30 G, inyecte en la luz intestinal ya sea 250 μL (íleon - paso 2.13) o 200 μL (colon - paso 3.7) de 4 kDa solución de FITC-dextrano (1 mg / mL en HBSS). Mantenga la solución fitc-dextrano no utilizada protegida de la luz para preparar la curva estándar después de la recolección de suero.
3. Para el bucle ileal, siga los pasos 2.14 a 2.16, para los pasos de pcLoop 3.8 a 3.10. Brevemente, coloque los órganos y iLoop de nuevo en su lugar en la cavidad abdominal, cierre la pared abdominal.
4. Coloque el animal durante 120 minutos en una cámara de anestesia calentada.
5. Después del período de incubación abra la pared abdominal, acceda al corazón y realice la punción cardíaca utilizando una jeringa de 1 mL con aguja 25G para recoger la sangre. Transfiera sangre a un tubo activador de coágulos séricos de 1,3 mL, mezcle suavemente y mantenga el hielo protegido de la luz. Recoger al menos 500 μL de sangre por ratón.
   NOTA: Los animales son eutanasiados cuando están bajo anestesia mediante el uso de un método físico como la decapitación o la dislocación cervical, y de acuerdo con el protocolo animal aprobado.
6. Tubo activador de coágulos de suero centrífuga durante 5 min a 10.000 x g a temperatura ambiente según las recomendaciones del fabricante. Recoger el suero (sobrenadante) y transferir en un tubo de centrífuga de 1,7 mL. Mantenga el tubo sobre hielo y protegido de la luz.
7. Cuantificación de la fluorescencia en el suero sanguíneo
   1. Preparar una curva estándar de FITC-dextrano 4 kDa en suero de ratones control (solución salina o HBSS es una alternativa válida). Cree una dilución en serie doble con una concentración inicial de 1 mg/mL de FITC-dextrano. Las concentraciones de FITC-dextrano 4 kDa que se miden oscilan entre 0,25 mg/mL y 2 μg/mL.
   2. Transferir el mismo volumen de la muestra y los estándares a una placa negra de 96 pozos (fondo plano) y medir FITC en un lector de placas de fluorescencia (Excitación 490 nm, Emisión 520 nm), de acuerdo con las instrucciones del fabricante y los protocolos publicados³³. Calcule la concentración de FITC basándose en la curva estándar o presente los valores de permeabilidad como cambio de pliegue normalizado al grupo de control experimental.

5. Evaluación cuantitativa de PMN migrado en el lumen intestinal después del estímulo intraluminal con chemokines

NOTA: Muy pocos PMN residen en la mucosa intestinal en el nivel de la línea de fondo. El tratamiento previo de animales con cytokines favorable-inflamatorios da lugar a un ambiente inflamatorio que facilite el reclutamiento de PMN de la circulación sanguínea en la mucosa intestinal.

1. Usando una jeringa de 1 ml con aguja de 30 G, realice la inyección intraperitoneal (i.p.) de una solución estéril de 100 ng de factor de necrosis tumoral α (TNFα) y 100 ng de interferón-γ (INFγ) en 200 μL de solución salina tamponada de fosfato (PBS).
2. Después de 4 - 24 h de pretratamiento con citoquinas proinflamatorias, realice un bucle ilétil o pcLoop (como se describió anteriormente).
3. Usando una jeringa de 1 ml con aguja de 30 G, inyecte en la luz intestinal 250 μL (íleon - paso 2.13) o 200 μL (colon - paso 3.7) de solución quimioatrayente Leukotriene B4 (LTB₄₎1 nM en HBSS.
   NOTA: El leucotrieno B4 (LTB₄₎se utiliza en este protocolo como quimioatrayente potente para el PMN. Otros quimioatrayentes como el ligando 1 de N-Formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLF) o del ligand 1 del chemokine (motivo de C-X-C) (CXCL1/KC) se pueden también utilizar para inducir el reclutamiento significativo de PMN en el lumen colónico^30.
4. Para el bucle ileal, siga los pasos 2.14 a 2.16. Para pcLoop, siga los pasos 3.8 a 3.10. Brevemente, coloque los órganos y iLoop de nuevo en su lugar en la cavidad abdominal, cierre la pared abdominal.
5. Coloque al animal durante 60 minutos en una cámara de anestesia calentada.
6. Colección del contenido intestinal del lazo
   1. Preparar soluciones y almacenar sobre hielo: Para el asa iléica y pcLoop, preparar un tampón de lavado que contenga 2 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), 5 mM de ditiotretol (TDT) y 2% de FBS en PBS estéril sin calcio y magnesio.
   2. Después del período de incubación y bajo mantenimiento con anestesia, abra la pared abdominal y saque el iLoop (bucle iléico o pcLoop). Eutanasiar a los animales cuando estén bajo anestesia mediante el uso de un método físico como la decapitación o la dislocación cervical, y de acuerdo con el protocolo animal aprobado.
   3. Enjuague el asa con PBS frío para eliminar cualquier contaminante residual de la sangre y absorber el exceso de PBS con toallitas de tejido. Recoja cuidadosamente el contenido del bucle en un tubo centrífugo de 1,7 mL (aproximadamente 250 μL para el bucle iléil y 200 μL para pcLoop). Enjuague el lazo con un tampón de lavado en frío de 500 μL e, inmediatamente después de la recolección, coloque el tubo sobre hielo.
      NOTA: La TDT ayuda a disolver el moco. Si el contenido luminal de iLoop es muy viscoso (dependiendo del fondo genético del ratón), diluirlo 1:2 o 1:3 con tampón de lavado que contenga TDT.
   4. Pase la solución de contenido luminal a través de un filtro de malla de nylon de 35 μm utilizando un tubo de fondo redondo de 5 mL con tapa de colador celular. Este paso ayuda a eliminar fragmentos de tejido y agregados celulares. Enjuague el colador celular con 1 mL de tampón de lavado.
   5. Tubo centrífugo a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante, enjuague el pellet con 500 μL - 1 mL de tampón de lavado, luego centrífuga a 400 x g durante 5 min, 4 °C.
   6. Resuspend iLoop pellet de células luminales en 200 μL de tampón citometría de flujo (FCB) que contiene 2% de FBS en PBS estéril sin calcio ni magnesio. Las células se pueden mantener en un tubo o transferir a una placa inferior redonda de 96 pozos para la tinción y el análisis de citometría de flujo.
7. Tinción y análisis de citometría de flujo
   1. Controles de compensación: glóbulos blancos
      1. Prepare una jeringa de 1 ml con aguja de 25 G precargada con EDTA estéril de 0,5 M (pH 8,0). 10% de EDTA por volumen de sangre esperado (100 μL de EDTA para 1 mL de sangre).
      2. Recoger sangre bajo anestesia por punción cardíaca. Transferir sangre en un tubo de 1,7 mL, luego centrífuga a 400 x g durante 10 min, 4 °C.
         NOTA: Mientras el ratón está bajo anestesia, use un método físico para confirmar la muerte de acuerdo con el protocolo animal aprobado (como la dislocación cervical).
      3. Aspirar el sobrenadante. Resuspend la pelotilla en 1 mL de tampón de lisis de amonio-cloruro-potasio (ACK) para la lisis de glóbulos rojos. Incubar durante 3 min - 5 min sobre hielo. Centrífuga 400 x g durante 5 min, 4 °C. Si el pellet todavía está rojo, repita este paso de tampón de lisis de ACK hasta que el pellet se vuelva blanco.
      4. Resuspend el pellet en 1 mL fcb y placa 0.5 x 10⁶- 1 x 10⁶ de células por pozo. Prepare cinco pozos de una placa de fondo redondo de 96 pozos. Coloque el plato sobre hielo.
         NOTA: Utilice la misma placa de 96 luminales que contiene el contenido luminal del bucle (consulte el paso 5.6.6).
   2. Tinción de citometría de flujo
      1. Centrifugar la placa de 96 pozos durante 5 min a 400 x g,4 °C. Deseche el sobrenadante y resuspend los pellets con 50 μL de rata purificada anti-ratón CD16/CD32 como un Fc-Block (1 μg por 100 μL de FCB). Incubar durante 5 min - 10 min en hielo.
      2. Inmunotensión del contenido luminal de iLoop: Preparar una mezcla que contenga todos los anticuerpos conjugados con fluorocromo (dilución 1:50 en FCB): anti-CD45-PerCP, anti-CD11b-PE y anti-Ly-6G-Alexa Fluor 647. Añadir 50 μL de la combinación por pozo, para un volumen final de 100 μL.
      3. Inmunotensión de los glóbulos blancos para compensaciones (dilución 1:50 en FCB): Use 50 μL de FCB solo (muestra no manchada, pozo 1), 50 μL de cada anticuerpo conjugado con fluorocromo individual (pozos 2 - 4), 50 μL de la combinación de todos los anticuerpos conjugados con fluorocromo (pozo 5). Volumen final de 100 μL.
      4. Incubar la placa durante 30 min sobre hielo protegido de la luz.
      5. Centrifugar la placa durante 5 min a 400 x g,4 °C. Deseche el sobrenadante y lave con 200 μL de FCB. Repita este paso de lavado dos veces.
      6. Agregue FCB 150 μL/well a las muestras de sangre.
      7. Agregue FCB de 100 μL/pozo a la muestra de contenido luminal de iLoop. Luego 50 μL/pozo de perlas fluorescentes de conteo.
   3. Análisis de citometría de flujo
      1. Puerta para eventos positivos CD45 y para la expresión de Ly-6G-/Gr-1 y CD11b³⁰.
      2. Utilice 100 μL del volumen de la muestra como condición de parada.
      3. Calcule el número absoluto de PMN que ha migrado al lumen iLoop siguiendo la información proporcionada por el fabricante de las perlas fluorescentes de conteo.
         NOTA: Los datos pueden presentarse como (1) número total de PMN en el lumen^30,34,35,(2) número de PMN por gramo de tejido, así como (3) número de PMN por mm³ utilizando la fórmula para el volumen de un cilindro: V = π (pi) r 2 h (V para el volumen, r para el radio y h para la altura).

Una representación esquemática de los modelos de bucle ilérico y pcLoop se representa en la Figura 1 y la Figura 2,respectivamente. Las imágenes anatómicas muestran los pasos críticos del procedimiento incluyendo la exteriorización del segmento intestinal (Figura 1B y Figura 2B), la identificación de una ubicación adecuada para las ligaduras que permita una mínima perturbación del suministro de sangre (Figura 1C y Figura 2C) y la limpieza seguida de la ligadura de los extremos de corte del iLoop que se puede llenar con solución reactiva ( Figura1D y Figura 2D). Es importante destacar que el modelo iLoop preserva el suministro de sangre vital y permite la absorción fisiológica de reactivos aplicados como FITC-dextrans o el potente quimioatrayente PMN LTB4. Al final del ensayo, el iLoop debe ser inflado (como se ve en la Figura 1D y la Figura 2D)y mostrar una perfusión mucosa normal con vasos mesentéricos de color rojo brillante. Dependiendo del ensayo, la sangre se recoge para medir fitc-dextrano en suero o iLoop contenido luminal se procesan para la cuantificación de PMN TEpM antes de la eutanasia del animal.

Con el fin de verificar la precisión del modelo iLoop para la evaluación de la permeabilidad intestinal, se realizó un ensayo FITC-dextran pcLoop para evaluar el papel de la proteína asociada a TJ JAM-A en la regulación de la función de barrera intestinal in vivo. Cabe destacar que se ha reportado que la deficiencia de JAM-A conduce a un aumento de la permeabilidad intestinal epitelial in vitro28 y después de la sonda oral in vivo29. En este documento, utilizando el modelo pcLoop, se cuantificó un aumento de 2,5 veces en los niveles séricos de FITC-dextrano de 4 kDa en ratones Jam-a-null(Jam-a-/-)en comparación con los controles(Jam-a+/+)(Figura 3A)30. Además, se obtuvieron resultados similares con ratones que albergaban pérdida selectiva de JAM-A en IECs(Villin-cre; Jam-a fl/fl) en comparación con los controles de littermate (Jam-a fl/fl) (Figura 3B)30. Por lo tanto, el modelo pcLoop fue capaz de corroborar estudios previos que han reportado una contribución positiva para JAM-A a la función de barrera intestinal.

Entonces el modelo del pcLoop fue empleado para estudiar el reclutamiento de PMN en la mucosa intestinal y TEpM subsecuente in vivo. Como se muestra en la Figura 4A,el número de PMN en el contenido luminal del pcLoop se cuantificó mediante análisis de citometría de flujo. PMN se definieron como células positivas para cada uno de los fabricantes de superficie celular CD45, CD11b y Ly6G36. Los glóbulos blancos de circulación fueron utilizados como control positivo para la estrategia del gating. Como era de esperar, el número de PMN presentes en un segmento de colon proximal similar al pcLoop fue bajo condiciones fisiológicas (Figura 4B). El pretratamiento con citoquinas proinflamatorias TNFα e IFNγ antes de la cirugía dio lugar a un aumento del número de PMN reclutados en el lumen pcLoop. La administración del quimioatrayente PMN LTB4 condujo a un aumento dramático en los recuentos de PMN que apoyan un reclutamiento de LTB4-dependiente de PMN(Figura 4B). La tinción inmunohistoquímica de pmn en la mucosa colónica corrobora el reclutamiento elevado de PMN después de la estimulación con citoquinas y LTB4 en comparación con el tratamiento con citoquinas sin LTB4 (Figura 4C)30. El modelo pcLoop fue empleado para estudiar la contribución de JAM-A a PMN TEpM usando Villin-cre; Jam-a fl/fl ratones. La pérdida de JAM-A epitelial llevó a un número reducido de PMN transmigrado en la luz colónica en comparación con los controles de camada(Figura 4D)30. Estos hallazgos apoyan fuertemente un papel de JAM-A en la facilitación de la migración de PMN a través del epitelio intestinal y proporcionan información complementaria a los estudios que han reportado la participación de JAM-A en la migración de PMN a través del endotelio vascular en varios modelos de inflamación31,37,38.

Figura 1: El modelo de bucle ileal. (A) Visión general esquemática del modelo de bucle ilérico. La laparotomía mediana se realiza en ratones bajo anestesia y se coloca en un tablero de cirugía de temperatura controlada. (B) Exteriorización del ciego (*), íleon y mesenterio. Se identifican dos sitios adecuados para la ligadura (1,2). (C)Aislar un segmento de 4 cm de longitud: la primera ligadura (1) se coloca cerca de la unión ileo-cecal y una segunda ligadura (2) se coloca a 4 cm de distancia de la primera ligadura. (D)Se realizan dos pequeñas incisiones en el mesenterio (1, 2) para crear un bucle iléilo de 4 cm de longitud. Después de la eliminación del contenido luminal y la ligadura de los extremos cortados, se pueden inyectar reactivos como marcadores fluorescentes y quimioatrayentes en la luz. El asa ilérea está bien vascularizado (puntas de flecha negras). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 2: El modelo de bucle de colon proximal. (A) Descripción general esquemática del modelo pcLoop. La laparotomía mediana se realiza en ratones bajo anestesia colocados en un tablero de cirugía de temperatura controlada. (B) Exteriorización del ciego (*), colon proximal, mesocolon e íleon. Se identifican dos sitios adecuados para la ligadura (1,2). (C)La primera ligadura (1) se coloca cerca del ciego y una segunda ligadura (2) se coloca 2 cm más distal de la primera ligadura. (D)El pcLoop se exterioriza, se limpia de contenido luminal y se infla con reactivos como marcadores fluorescentes y quimioatrayentes. El pcLoop es un segmento bien vascularizado de 2 cm del colon proximal (las puntas de flecha negras indican suministro de sangre). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 3:JAM-A regula la permeabilidad intestinal in vivo. (A)La deficiencia de JAM-A(Jam-a-/-) llevó a un aumento de la permeabilidad colónica a 4 kDa FITC-dextrano. El atasco-/- (animales 13x; puntos negros) fue comparado con los controles del atasco+/+ (animales 12x; puntos blancos). 4 kDa FITC-dextrano (1 mg/mL) en HBSS fue inyectado en el lumen del pcLoop. La fluorescencia fue medida en suero de sangre después de un período de incubación de 120 minutos. Los datos se expresan como medios ± SEM; n = 3 experimentos independientes. ****P < 0,0001; Prueba U de Mann-Whitney. (B)Aumento de la permeabilidad colónica a 4 kDa FITC-dextrano en Villin-cre; Jam-afl/fl (18x animales, puntos negros) en comparación con los controles(Jam-afl/fl,12x animales, puntos blancos). Los datos son medios ± SEM; n = 4 experimentos independientes. ****P < 0,0001; Prueba U de Mann-Whitney. Esta cifra ha sido modificada de Flemming S, Luissint AC et al.30. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 4: JAM-A promueve ltb4-dependientes del reclutamiento de PMN en la luz del pcLoop. (A)Estrategia de gating para cuantificar pmn (CD45+,CD11b+, y Ly-6G / Gr1+ células) en el contenido luminal por citometría de flujo con perlas de conteo fluorescentes. Los leucocitos de muestras de sangre fueron utilizados como control positivo para la estrategia del gating. (B)Número de PMN reclutados en el lumen pcLoop después del tratamiento de citoquinas (TNFα+IFNγ, 100ng cada uno) (10x animales; puntos blancos) o después de una combinación de citoquinas y 1 nM LTB4 (10x animales; puntos negros). Los cuadrados negros representan el número de PMN en la línea de fondo según lo evaluado en un segmento colónico intacto idéntico en longitud al pcLoop que no fue sujetado a ninguna cirugía o tratamiento con los cytokines proinflammatory y LTB4 (animales del 9x). Los datos son la media ± SEM (n = 3 experimentos independientes), prueba de Kruskal-Wallis con la prueba de comparación múltiple de Dunn. *P < 0,05, ****P < 0,0001. (C)Tinción inmunohistoquímica de PMN (anticuerpo anti-Ly6G/Gr1) en el epitelio del pcLoop después del tratamiento con citoquinas solas (panel izquierdo, TNFα+IFNγ) o una combinación de citoquinas y LTB4 (panel derecho). El número de PMN reclutados en el pcLoop se incrementa en presencia de LTB4 (puntas de flecha negras). Barra de escala: 100 μm. (D) Número de PMN reclutados en el lumen pcLoop en Villin-cre; Jam-afl/fl ratones (11x animales; puntos negros) en comparación con Jam-afl/fl ratones (10x animales; puntos blancos) en respuesta a 1 nM LTB4. Los datos son medios ± SEM; n = 3 experimentos independientes. *P < 0,05; Prueba t de Student de 2 colas. Esta cifra ha sido modificada de Flemming S, Luissint AC et al.30. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.