Artículo de método

Preservación de la fertilidad en pacientes con disfunción ovárica grave

DOI:

10.3791/62098

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25 de marzo de 2021

 , 
1Advanced Reproduction Medicine Research Center, Department of Obstetrics and Gynecology, International University of Health and Welfare School of Medicine

En este artículo

Resumen

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Presentamos los detalles de los procedimientos del laboratorio para la activación in vitro droga-libre (IVA) de los folículos ováricos para los pacientes con la disfunción ovárica severa. Este método podría aumentar el número de ovocitos recuperables por hiperestimulación ovárica y beneficiar la preservación de la fertilidad para esas pacientes.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La función ovárica disminuye progresivamente durante el envejecimiento y en algunas condiciones fisiopatológicas, incluyendo anomalías del cariotipo, enfermedades autoinmunes, quimio y radioterapias, así como cirugías ováricas. En mujeres solteras con la disfunción ovárica severa, la preservación de la fertilidad es importante para los embarazos futuros. Aunque el cryopreservation del oocyte sea un método establecido para la preservación de la fertilidad, estos pacientes podrían preservar solamente un número limitado de oocytes incluso después de la hiperestimulación ovárica, llevando a los estímulos repetidos para asegurar suficientes ovocitos para garantizar embarazo futuro. Para solucionar este problema, hemos desarrollado recientemente un procedimiento de activación in vitro libre de drogas (IVA), que nos permite estimular las primeras etapas de los folículos ováricos para que se desarrollen a la etapa del folículo preantral. Estos folículos preantrales pueden responder al protocolo único del estímulo de la gonadotropina, dando por resultado el número creciente de ovocitos recuperados por el estímulo ovárico para el cryopreservation. El IVA libre de fármacos se compuso desde el abordaje quirúrgico y la estimulación ovárica. Se extrae una parte de la corteza de uno o ambos ovarios de pacientes sometidos a cirugía laparoscópica. Los tejidos corticales ováricos fueron cortados en pequeños cubos para interrumpir el camino de la señalización del hipopótamo y para estimular el desarrollo de los folículos de la etapa temprana. Estos cubos fueron injertado orthotropically en ovarios restantes así como debajo del serosa de ambos tubos de Falopio. Ya hemos publicado el procedimiento quirúrgico del IVA libre de drogas y el protocolo de estimulación ovárica posterior, pero aquí presentamos los detalles de los métodos de laboratorio requeridos para el IVA libre de drogas.

Introducción

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La función ovárica disminuye progresivamente durante el envejecimiento y algunas condiciones patofisiológicas incluyendo anormalidad del karyotype, enfermedades autoinmunes, chemo- y radioterapias, y cirugías ováricas. La preservación de la fertilidad es una de las mejores opciones para que las mujeres solteras con disfunción ovárica grave preserven su potencial para el embarazo futuro. Para la preservación de la fertilidad, actualmente hay dos métodos disponibles principalmente en el campo de la oncofertilidad. La criopreservación de ovocitos es un procedimiento bien establecido para la preservación de la fertilidad y se han reportado muchos casos exitosos1,2. Por otro lado, la criopreservación del tejido ovárico también se estableció para la preservación de la fertilidad en pacientes con cáncer, pero sigue siendo una estrategia experimental3,4. En ambos métodos, se necesitan múltiples números de ovocitos maduros para que ocurra el embarazo. En general, las pacientes con insuficiencia ovárica prematura (POI), que se convierten en amenorrea antes de los 40 años de edad, y las mujeres de mediana edad con baja reserva ovárica mostraron una respuesta ovárica deficiente (POR) a la estimulación ovárica para la producción de ovocitos maduros5,6,7. Además, las pacientes jóvenes con un bajo número de folículos antrales también mostraron POR a la estimulación ovárica7. Estas pacientes tienen un número muy limitado de ovocitos recuperables incluso después de la hiperestimulación ovárica adecuada, lo que requiere múltiples procedimientos costosos para garantizar un número suficiente de ovocitos para el embarazo.

La donación de ovocitos seguida de la fecundación in vitro (FIV) con espermatozoides del marido y la transferencia de embriones (TE) es la única opción para estas pacientes de POI y POR que tienen dificultades para obtener sus propiosovocitos 8,9,10. Sin embargo, la donación de ovocitos se complica por cuestiones éticas, así como por complicaciones autoinmunes y del embarazo11,12,13,14. Para resolver estos problemas, se desea el establecimiento de un tratamiento de infertilidad utilizando los propios ovocitos de los pacientes. Para las pacientes con POI, hemos desarrollado el enfoque de activación in vitro (IVA) para permitir el crecimiento exitoso del folículo y la generación de ovocitos maduros, liderando una serie de embarazos y partos15. En IVA, fragmentamos las cortezas ováricas después de la extracción de ovarios bajo cirugía laparoscópica y los cultivamos durante dos días para activar folículos mediante fármacos estimulantes de Akt y luego realizar injertos heterotópicos de nuevo en bolsas artificiales hechas debajo de la serosa de las trompas de Falopio bajo segunda cirugía laparoscópica15. Este procedimiento promovió el crecimiento de folículos primordiales, primarios y secundarios después de la fragmentación de la corteza ovárica para promover la interrupción de la señalización de hipopótamo16,seguido de dos días de cultivo con estimuladores de señalización Akt17.

En contraste con casos severos del POI, los pacientes del POR con la reserva ovárica disminuida tienen folículos secundarios múltiples. Debido a que la interrupción de la señalización de hipopótamos por sí sola es eficaz en la promoción del crecimiento del folículo secundario16,recientemente demostramos embarazos y partos exitosos para pacientes con POR utilizando el procedimiento IVA libre de drogas que implica fragmentación cortical e injerto ortotópico sin tratamiento de los fármacos estimulantes Akt. El IVA libre de drogas estimula la etapa temprana de los folículos ováricos para que se desarrollen a la etapa del folículo preantral después de una sola cirugía y aumenta el número de ovocitos recuperados para la transferencia de embriones deFIV 15,18. El acercamiento droga-libre del IVA tiene varias ventajas con respecto a nuestro IVA original por 1) evitando pérdida potencial del folículo durante cultura, 2) minimizando invasividad y costes de la segunda cirugía, 3) implicando solamente resto de cama a corto plazo de la poste-cirugía y 4) potencial del embarazo espontáneo debido al injerto orthotopic. Recientemente publicamos un video artículo que muestra los procedimientos quirúrgicos del IVA libre de drogas19 y los protocolos detallados de estimulación ovárica después de la cirugía20. Aquí, presentamos los detalles de los métodos de laboratorio requeridos para el IVA libre de drogas.

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Protocolo

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El consentimiento informado escrito fue obtenido de cada paciente del POR con la reserva ovárica decreciente que alistó en el tratamiento droga-libre del IVA. Este estudio fue aprobado por el comité ético de la Universidad Internacional de Salud y Bienestar (No. 17-S-21). El ensayo clínico se registró con el número UMIN000034464 y se llevó a cabo de acuerdo con el Código de Ética de la Asociación Médica Mundial (Declaración de Helsinki).

1. Extracción de la corteza ovárica

  1. Extirpar parte de la corteza ovárica (10 x 10 mm, 2-3 mm de espesor) de uno o ambos ovarios bajo anestesia general mediante cirugía laparoscópica como se describió anteriormente19,20.
  2. Coloque las cortezas ováricas recogidas en un recipiente estéril que contenga 10 mL de HTF modificado (mHTF) a 37 °C.

2. Fragmentación de la corteza ovárica

NOTA: Antes de la disección de la corteza ovárica, caliente mHTF a 37 °C. Mantenga condiciones estériles durante todo el procedimiento. Todas las herramientas para este procedimiento se enumeran en tabla de materiales.

  1. Colocar las cortezas ováricas recogidas en un plato de plástico que contenga 5-10 mL de mHTF a 37 °C y colocarlas sobre la placa de calor para mantener el tejido a 37 °C (Figura 2A).
  2. Tome una foto de cada corteza usando una cámara digital con el nombre del paciente antes de comenzar el siguiente procedimiento para vincular los datos de fondo del paciente.
  3. Colocar una corteza individual sobre una gasa estéril humedecida con mHTF(Figura 2B).
    NOTA: Aplique mHTF adicional con una pipeta desechable en la gasa para evitar que la superficie de la corteza se seque durante este procedimiento.
  4. Retirar el tejido de la médula residual donde se ve rosado utilizando una micro-tijera para que el espesor del tejido alcance los 1-2 mm(Figura 2C y D).
    NOTA: Para evitar la pérdida de folículos en la etapa temprana, no prepare las tiras corticales de menos de 1 mm de espesor, porque los folículos en etapa temprana se encuentran dentro de 1-2 mm de la superficie de la corteza ovárica21.
  5. Diseccionar una pieza de tejido de 1 mm x 1 mm x 5 mm de cada tira cortical ovárica utilizando un bisturí fino y someterlo a análisis histológico para determinar la presencia de folículos residuales como se describió anteriormente18 (Figura 2E).
    NOTA: Los tejidos disecados para histología se sumergen en mHTF y se mantienen a 4 °C hasta su fijación(Figura 2F,ver Paso 4).
  6. Corte la corteza en tiras de 1 mm x 1 mm x 10 mm usando un bisturí fino (Figura 2G).
    NOTA: Es más fácil de cortar presionando hacia abajo sobre el bisturí que tirando de él.
  7. Corte estas tiras de tejido en cubos pequeños de 1 mm x 1 mm x 1 mm (Figura 2H).
    NOTA: Para evitar cambios de presión osmótica en el medio, agregue mHTF con moderación antes de autoinjerto tisular.

3. Autoinjerto de fragmentos corticales ováricos

  1. Abra el paquete de la cánula IVA y colócalo en una cortina estéril.
  2. Enjuague el interior de la cánula IVA con mHTF aspirando y descargando mHTF varias veces.
  3. Aspirar 100-200 μL de mHTF para llenar la punta de la cánula IVA para evitar que los cubos corticales se sequen durante la carga (Figura 3A).
  4. Cargue los cubos corticales en la punta de la cánula IVA usando una pinza fina (Figura 3B-E).
    NOTA: El número de cubos corticales para la carga depende del sitio de injerto. Generalmente, 20-30 cubos se pueden trasplantar en un ovario restante ortotrópico, mientras que 10-15 cubos se pueden trasplantar en una bolsa debajo del serosa del tubo de Falopio.
  5. Después de cargar los cubos corticales, sostenga la punta de la cánula que contiene los cubos corticales por los dedos hasta transferir la cánula IVA a un cirujano. Esto evitará que la temperatura del cubo disminuya.
    NOTA: Los detalles del procedimiento de autoinjerto bajo cirugía laparoscópica han sido reportadospreviamente 19. Para el injerto de cubos corticales ováricos, un dispositivo en forma de cánula (cánula IVA) fue desarrollado por nuestro colaborador, la Corporación Kitazato.

4. Análisis histológico de la corteza ovárica

NOTA: Para contar el número de folículos residuales, realice análisis histológicos como se describió anteriormente15.

  1. Marque la superficie de la tira cortical con un tinte de marcado de tejido antes de la fijación de la muestra. Esto indicará el lado de la corteza en la tira para la histología.
  2. Fije las tiras de tejido durante la noche a 4 °C usando la solución de Bouin.
    NOTA: Para detectar folículos atretic, no recomendamos usar el paraformaaldehído para la fijación para evitar la contracción del citoplasma del oocyte.
  3. Deshidratar e incrustar las tiras de tejido en la parafina.
  4. Seccione en serie el bloque de parafina que contiene la muestra de tejido.
  5. Manche cada sección usando hematoxilina y eosina para visualizar los folículos.
  6. Contar los folículos como se describió anteriormente17.

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Resultados

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En la primera publicación del enfoque IVA15,trasplantamos los cubos corticales ováricos uno por uno en los sitios de injerto bajo cirugía laparoscópica(Figura 1A). Porque 100-150 cubos ováricos fueron utilizados, tomó 3-4 horas para el injerto del tejido bajo cirugía laparoscopic. También, algunos cubos ováricos fueron perdidos antes de injertar. Debido a que la cánula IVA podría transferir 20-30 cubos a un sitio de injerto a la vez (Figura 1B

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Discusión

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En este manuscrito, mostramos un protocolo detallado del laboratorio para el IVA droga-libre. El IVA libre de fármacos es un nuevo enfoque de tratamiento de la infertilidad para pacientes con POR con reserva ovárica decreciente para promover el crecimiento de los folículos secundarios, lo que resulta en el rendimiento de ovocitos más maduros después de la estimulación ovárica y el aumento en el embarazo exitoso20. En 15 pacientes del POR con la reserva ovárica decreciente, este acercamiento alcanz...

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Divulgaciones

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Los autores confirman que no tienen ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a Tatsuji Ihana, Sachiyo Kurimoto, Kazuko Takahasih, Yuki Yoshizawa, Maho Arashi, Kentaro Fujita, Erina Kudo, Yuka Kurimoto y Mayuko Wakatsuki por apoyar el procedimiento de IVA libre de drogas y al Prof. Aaron J.W. Hsueh (Stanford University School of Medicine, Stanford, CA) por la lectura crítica y edición del manuscrito. También agradecemos a Rebecca Truman y Gregory Truman por insertar la narración en inglés. Este estudio fue apoyado por la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS), la Investigación Científica B (19H03801) y la Investigación Exploratoria Desafiante (18K19624).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Contenedor de muestras de 4.5 onzFALCON354013Otros productos también pueden ser adecuados
Plato de 60 mmFALCON351007Otros productos también pueden ser adecuados
Paño estéril de 50 x 50 cmHOGY MedicalSR-823Cualquier tipo de produsts estériles también puede ser adecuado
Pippete desechableFALCON357575Otros productos también pueden ser adecuados
Tijeras finas, curvasWPI#14224-GAunque otros productos también pueden ser adecuados, recomendamos encarecidamente utilizar estos productos
Placa calefactoraTOKAI HITTPiE-SPUso en quirófano para mantener la temperatura de las placas que contienen tejido ovárico antes del trasplante
Solución de albúmina sérica humanaIrvine Scientific9988Medio para la manipulación de tejido ovárico
CánulaIVAKITAZATO446030 IVA-6030ECánula específica para autoinjerto de tejidos
KAI medical Bisturí desechableWPI#5 10-AAunque otros productos también pueden ser adecuados, recomendamos encarecidamente el uso de estos productos
Micro tijeras, curvasWPI#503364Aunque otros productos también pueden ser adecuados, recomendamos encarecidamente el uso de estos productos
HTF modificado Medium-HEPESIrvine Scientific90126Medio para la manipulación de tejido ovárico
Gasa estérilOsaki Medical15004Cualquier tipo de producto estéril también puede ser adecuado
Pinzas suizas, puntas curvasKAI#504505Aunque otros productos también pueden ser adecuados, recomendamos encarecidamente utilizar estos productos

Referencias

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  1. Liang, T., Motan, T. Mature Oocyte Cryopreservation for Fertility Preservation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 951, 155-161 (2016).
  2. Yoon, T. K., et al. Live births after vitrification of oocytes in a stimulated in vitro fertilization-embryo transfer program. Fertility and Sterility. 79 (6), 1323-1326 (2003).
  3. Donnez, J., et al. Livebirth after orthotopic transplantation of cryopreserved ovarian tissue. Lancet. 364 (9443), 1405-1410 (2004).
  4. Meirow, D., et al. Pregnancy after transplantation of cryopreserved ovarian tissue in a patient with ovarian failure after chemotherapy. New England Journal of Medicine. 353 (3), 318-321 (2005).
  5. De Vos, M., Devroey, P., Fauser, B. C. Primary ovarian insufficiency. Lancet. 376 (9744), 911-921 (2010).
  6. Scott, R. T., et al. Follicle-stimulating hormone levels on cycle day 3 are predictive of in vitro fertilization outcome. Fertility and Sterility. 51 (4), 651-654 (1989).
  7. Ferraretti, A. P., et al. ESHRE consensus on the definition of 'poor response' to ovarian stimulation for in vitro fertilization: the Bologna criteria. Human Reproduction. 26 (7), 1616-1624 (2011).
  8. Huhtaniemi, I., et al. Advances in the Molecular Pathophysiology, Genetics, and Treatment of Primary Ovarian Insufficiency. Trends in Endocrinology and Metabolism. 29 (6), 400-419 (2018).
  9. Męczekalski, B., Maciejewska-Jeske, M., Podfigurna, A. Reproduction in premature ovarian insufficiency patients - from latest studies to therapeutic approach. Prz Menopauzalny. 17 (3), 117-119 (2018).
  10. Baker, V. Life plans and family-building options for women with primary ovarian insufficiency. Seminars in Reproductive Medicine. 29 (4), 362-372 (2011).
  11. Englert, Y., Govaerts, I. Oocyte donation: particular technical and ethical aspects. Human Reproduction. 13, Suppl 2 90-97 (1998).
  12. Englert, Y., Rodesch, C., Laruelle, C., Govoerts, I. Oocyte donation: ethical aspects related to the donor. Contraception, Fertilite, Sexualite. 25 (3), 251-257 (1997).
  13. Storgaard, M., et al. Obstetric and neonatal complications in pregnancies conceived after oocyte donation: a systematic review and meta-analysis. BJOG: An International Journal of Obstetrics and Gynaecology. 124 (4), 561-572 (2017).
  14. Storgaard, M., Malchau, S., Loft, A., Larsen, E., Pinborg, A. Oocyte donation is associated with an increased risk of complications in the pregnant woman and the fetus. Ugeskrift for Laeger. 179 (11), (2017).
  15. Kawamura, K., et al. Hippo signaling disruption and Akt stimulation of ovarian follicles for infertility treatment. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (43), 17474-17479 (2013).
  16. Hsueh, A. J., Kawamura, K., Cheng, Y., Fauser, B. C. Intraovarian control of early folliculogenesis. Endocrine Reviews. 36 (1), 1-24 (2015).
  17. Li, J., et al. Activation of dormant ovarian follicles to generate mature eggs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10280-10284 (2010).
  18. Suzuki, N., et al. Successful fertility preservation following ovarian tissue vitrification in patients with primary ovarian insufficiency. Human Reproduction. 30 (3), 608-615 (2015).
  19. Tanaka, Y., Hsueh, A. J., Kawamura, K. Surgical approaches of drug-free in activation and laparoscopic ovarian incision to treat patients with ovarian infertility. Fertility and Sterility. , (2020).
  20. Kawamura, K., Ishizuka, B., Hsueh, A. J. W. Drug-free in-vitro activation of follicles for infertility treatment in poor ovarian response patients with decreased ovarian reserve. Reproductive Biomedicine Online. 40 (2), 245-253 (2020).
  21. Haino, T., et al. Determination of Follicular Localization in Human Ovarian Cortex for Vitrification. Journal of Adolescent and Young Adult Oncology. 7 (1), 46-53 (2018).
  22. Baird, D. T., Webb, R., Campbell, B. K., Harkness, L. M., Gosden, R. G. Long-term ovarian function in sheep after ovariectomy and transplantation of autografts stored at -196 C. Endocrinology. 140 (1), 462-471 (1999).
  23. Qin, Y., Jiao, X., Simpson, J. L., Chen, Z. J. Genetics of primary ovarian insufficiency: new developments and opportunities. Human Reproduction Update. 21 (6), 787-808 (2015).
  24. Domniz, N., Meirow, D. Premature ovarian insufficiency and autoimmune diseases. Best Practice & Research: Clinical Obstetrics & Gynaecology. 60, 42-55 (2019).
  25. Laven, J. S. Primary Ovarian Insufficiency. Seminars in Reproductive Medicine. 34 (4), 230-234 (2016).
  26. Grynberg, M., et al. Fertility preservation in Turner syndrome. Fertility and Sterility. 105 (1), 13-19 (2016).
  27. Tomao, F., Spinelli, G. P., Panici, P. B., Frati, L., Tomao, S. Ovarian function, reproduction and strategies for fertility preservation after breast cancer. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 76 (1), 1-12 (2010).
  28. Kim, S., Lee, Y., Lee, S., Kim, T. Ovarian tissue cryopreservation and transplantation in patients with cancer. Obstetrics & Gynecology Science. 61 (4), 431-442 (2018).
  29. Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian tissue freezing: current status. Current Opinion in Obstetrics and Gynecology. 27 (3), 222-230 (2015).
  30. Wu, R. C., Kuo, P. L., Lin, S. J., Liu, C. H., Tzeng, C. C. X chromosome mosaicism in patients with recurrent abortion or premature ovarian failure. Journal of the Formosan Medical Association. 92 (11), 953-956 (1993).
  31. De Munck, N., Vajta, G. Safety and efficiency of oocyte vitrification. Cryobiology. 78, 119-127 (2017).
  32. Argyle, C. E., Harper, J. C., Davies, M. C. Oocyte cryopreservation: where are we now. Human Reproduction Update. 22 (4), 440-449 (2016).

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