Artículo de método

Ingeniería confiable y control de circuitos genéticos optogenéticos estables en células de mamíferos

DOI:

10.3791/62109

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6 de julio de 2021

 ,  ,  , 
1Biomedical Engineering Department, Stony Brook University, 2Laufer Center for Physical and Quantitative Biology, Stony Brook University, 3Stony Brook Medical Scientist Training Program

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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El control fiable de las células de mamíferos sensibles a la luz requiere la estandarización de los métodos optogenéticos. Hacia este objetivo, este estudio describe una línea de construcción de circuitos genéticos, ingeniería celular, operación de equipos optogenéticos y ensayos de verificación para estandarizar el estudio de la expresión génica inducida por la luz utilizando un circuito genético optogenético de retroalimentación negativa como estudio de caso.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El control confiable de la expresión génica en células de mamíferos requiere herramientas con alto cambio de pliegue, bajo ruido y funciones determinadas de transferencia de entrada a salida, independientemente del método utilizado. Hacia este objetivo, los sistemas de expresión génica optogenética han ganado mucha atención en la última década para el control espaciotemporal de los niveles de proteínas en las células de mamíferos. Sin embargo, la mayoría de los circuitos existentes que controlan la expresión génica inducida por la luz varían en arquitectura, se expresan a partir de plásmidos y utilizan equipos optogenéticos variables, lo que crea la necesidad de explorar la caracterización y estandarización de los componentes optogenéticos en líneas celulares estables. Aquí, el estudio proporciona una línea experimental de construcción, integración y caracterización de circuitos genéticos confiables para controlar la expresión génica inducible por la luz en células de mamíferos, utilizando un circuito optogenético de retroalimentación negativa como ejemplo de caso. Los protocolos también ilustran cómo la estandarización de equipos optogenéticos y regímenes de luz puede revelar de manera confiable las características del circuito génico, como el ruido de expresión génica y la magnitud de la expresión de proteínas. Por último, este documento puede ser de utilidad para los laboratorios que no están familiarizados con la optogenética que deseen adoptar dicha tecnología. La tubería descrita aquí debería aplicarse a otros circuitos optogenéticos en células de mamíferos, lo que permite una caracterización y un control más confiables y detallados de la expresión génica a nivel transcripcional, proteómico y, en última instancia, fenotípico en células de mamíferos.

Introducción

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Al igual que otras disciplinas de la ingeniería, la biología sintética tiene como objetivo estandarizar los protocolos, permitiendo utilizar herramientas con funciones altamente reproducibles para explorar cuestiones relevantes para los sistemas biológicos1,2. Un dominio de la biología sintética donde se han construido muchos sistemas de control es el área de regulación de la expresión génica3,4. El control de la expresión génica puede dirigirse tanto a los niveles de proteínas como a la variabilidad (ruido o coeficiente de variación, CV = σ/μ, medido como la desviación estándar sobre la media), que son características celulares cruciales debido a su papel en los estados celulares fisiológicos y patológicos5,6,7,8. Muchos sistemas sintéticos que pueden controlar los niveles de proteínas y el ruido4,9,10,11,12 han sido diseñados, creando oportunidades para estandarizar protocolos en todas las herramientas.

Un nuevo conjunto de herramientas que pueden controlar las redes génicas que ha surgido recientemente es la optogenética, que permite el uso de la luz para controlar la expresión génica13,14,15,16,17. Al igual que sus predecesores químicos, los circuitos genéticos optogenéticos pueden introducirse en cualquier tipo de célula, desde bacterias hasta mamíferos, permitiendo la expresión de cualquier gen de interés aguas abajo18,19. Sin embargo, debido a la rápida generación de nuevas herramientas optogenéticas, han surgido muchos sistemas que varían en la arquitectura del circuito genético, el mecanismo de expresión (por ejemplo, la integración basada en plásmidos frente a la viral) y los equipos de control de suministro de luz11,16,20,21,22,23,24,25 . Por lo tanto, esto deja espacio para la estandarización de las características optogenéticas, como la construcción y optimización de circuitos genéticos, el método de utilización del sistema (por ejemplo, integración frente a expresión transitoria), las herramientas experimentales utilizadas para la inducción y el análisis de resultados.

Para avanzar en la estandarización de protocolos optogenéticos en células de mamíferos, este protocolo describe una tubería experimental para diseñar sistemas optogenéticos en células de mamíferos utilizando un circuito genético de retroalimentación negativa (NF) integrado en células HEK293 (línea celular de riñón embrionario humano) como ejemplo. NF es un sistema ideal para demostrar la estandarización, ya que es muy abundante26,27,28 en la naturaleza, lo que permite ajustar los niveles de proteínas y minimizar el ruido. En resumen, nf permite un control preciso de la expresión génica mediante un represor que reduce su propia expresión lo suficientemente rápido, limitando así cualquier cambio lejos de un estado estacionario. El estado estacionario puede ser alterado por un inductor que inactiva o elimina el represor para permitir una mayor producción de proteínas hasta que se alcanza un nuevo estado estacionario para cada concentración de inductor. Recientemente, se creó un sistema optogenético NF diseñado que puede producir una respuesta ampliamente dinámica de la expresión génica, mantener un ruido bajo y responder a los estímulos de la luz, lo que permite el potencial de control de la expresión génica espacial11. Estas herramientas, conocidas como sintonizadores inducibles por la luz (LITers), se inspiraron en sistemas anteriores que permitían el control de la expresión génica en células vivas4,10,29,30 y se integraron de manera estable en las líneas celulares humanas para garantizar el control de la expresión génica a largo plazo.

Aquí, usando el LITer como ejemplo, se describe un protocolo para crear circuitos genéticos sensibles a la luz, inducir la expresión génica con un Aparato de Placa de Luz (LPA, un hardware de inducción optogenética)31 y analizar las respuestas de las líneas celulares diseñadas y controlables optogenéticamente a estímulos de luz personalizados. Este protocolo permite a los usuarios utilizar las herramientas LITer para cualquier gen funcional que deseen explorar. También se puede adaptar para otros sistemas optogenéticos con diversas arquitecturas de circuitos (por ejemplo, retroalimentación positiva, regulación negativa, etc.) mediante la integración de los métodos y equipos optogenéticos que se describen a continuación. Al igual que otros protocolos de biología sintética, las grabaciones de video y los protocolos optogenéticos descritos aquí se pueden aplicar en estudios unicelulares en diversas áreas, que incluyen, entre otras, la biología del cáncer, el desarrollo embrionario y la diferenciación de tejidos.

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Protocolo

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1. Diseño de circuitos genéticos

  1. Seleccionar componentes genéticos para combinarlos en un solo circuito genético/plásmido (por ejemplo, motivos de secuencia de integración de ADN de mamíferos32, elementos sensibles a la luz33 o genes funcionales34).
  2. Utilizando cualquier software de ingeniería genética y/o clonación molecular, almacene las secuencias de ADN para su uso y referencia posteriores, anote cada secuencia y examine todas las características necesarias (por ejemplo, codones START, secuencias regulatorias o traducidas)35.
  3. Desarrollar o adoptar partes de acuerdo con el diseño general del circuito genético36. A modo de ejemplo, para los represores optogenéticos como en los LITers11, fusionar una secuencia de genes que codifica para un dominio capaz de degradación inducible por la luz37,38 o inactivación de la capacidad de unión al ADN de un represor39, adyacente y en el marco del gen represor (por ejemplo, TetR)4.
    1. Para los activadores optogenéticos, asegurar la presencia de un dominio activador40 que promueva la expresión génica sobre la unión al ADN inducida por la luz41. Para la autorregulación negativa o positiva, asegúrese de la presencia de un sitio de unión reguladora en o aguas arriba del promotor del gen regulador (por ejemplo, sitios tetO en o aguas arriba del promotor que expresa TetR)42.
  4. Diseñar los cebadores para la amplificación de la secuencia de ADN o secuenciación del plásmido utilizando el software de clonación molecular para cada circuito genético.
  5. Valide los cebadores computacionalmente para la construcción de plásmidos a través de los feastures incorporados del software de clonación molecular (por ejemplo, alineación de secuencias).
  6. Solicite cebadores de oligonucleótidos al fabricante. Los plásmidos construidos y utilizados en este trabajo se pueden encontrar en el material de soporte original11 junto con los cebadores diseñados y utilizados.
  7. Diluya los cebadores a una concentración de stock de 100 mM en agua de doble destilación (ddH2O).
  8. Diluya el stock de imprimaciones de stock de 100 mM a una concentración de 10 mM para PCR.
  9. Preparar la mezcla de PCR con 1 μL de cebador hacia adelante, 1 μL de cebador inverso, 1 μL de ADN plantilla a una masa total de 0,5-500 ng para genómica o 0,5 pg-5 ng para ADN plásmido o viral, 12,5 μL de mezcla maestra de ADN polimerasa 2x (o el volumen que satisface el factor de dilución del fabricante) y 9,5 μL de ddH2O para un volumen de reacción total de 25 μL.
  10. Incubar la mezcla de PCR en un termociclador en los ajustes adecuados en función de la enzima elegida43. Los ciclos de reacción sugeridos incluyen:
    Paso 1: Un ciclo de 30 s paso de desnaturalización inicial a 95 °C.
    Paso 2: 40 ciclos de 5 s de paso de desnaturalización a 98 °C.
    Paso 3: Un ciclo de 30 s de paso de recocido a 65 °C (determinado por cebadores diseñados anteriormente).
    Paso 4: Un ciclo de 1 min de extensión a 72 °C (~1 kilobase (kb) de longitud de fragmento de plantilla).
    Paso 5: Un ciclo de una extensión de 2 minutos a 72 °C.
    Mantenga la reacción a 4 °C hasta que se pueda probar mediante electroforesis en gel. Este protocolo variará dependiendo de los reactivos utilizados (por ejemplo, polimerasa y tampones).
  11. Repita el paso 1.9 para amplificar todos los fragmentos que se utilizarán en una reacción de ensamblaje de ADN necesaria para vincular productos de PCR lineal en un solo vector de ADN circular.
  12. Ejecute los productos de PCR en un gel de agarosa al 1% seguido de purificar las bandas de la longitud deseada.
  13. Preparar la mezcla maestra para una reacción de ensamblaje de ADN (Tabla 1).
    NOTA: En este ejemplo, el vector madre se divide en dos fragmentos para aumentar la eficiencia de los pasos de PCR sin causar cambios significativos en el resultado general del ensamblaje.
  14. Incubar la mezcla maestra de reacción de ensamblaje de ADN en un termociclador a 50 °C durante 1 h (a menos que se especifique lo contrario en el protocolo de reactivo de ensamblaje de ADN) y almacenar la reacción a 4 °C para usar el producto de reacción para la transformación bacteriana.
  15. Establecer la transformación bacteriana (química o electroporación) utilizando células competentes de E. coli (Escherichia coli) y el protocolo de transformación bacteriana correspondiente. Después de la transformación, use las placas de agar bacteriano Luria-Bertani (LB) que contienen el marcador de selección bacteriana elegido (por ejemplo, ampicilina) para colocar la placa de la mezcla de transformación. Incubar las placas a 37 °C durante la noche44.
  16. Revisa los platos al día siguiente. Para inocular las colonias, recoja colonias individuales de las placas y resuspóngalas en un caldo líquido LB con el marcador de selección bacteriana correspondiente en tubos de cultivo. Incubar en una incubadora agitadora a 37 °C, 300 rpm durante la noche.
  17. Realizar el protocolo de preparación de plásmidos para extraer el ADN plásmido del cultivo bacteriano.
  18. Valida el circuito en dos pasos. Primero, realice una prueba de digestión utilizando enzimas de restricción como una verificación cruda para ver si se obtuvo el producto plásmido aproximado. En segundo lugar, si la digestión de la prueba se pasa / confirma, envíe el plásmido a una instalación de secuenciación de Sanger (o proceso utilizando el equipo disponible) para obtener la secuencia precisa de ADN para compararla más tarde con la secuencia esperada en el software de diseño.
    1. Para realizar la digestión de prueba, seleccione al menos dos enzimas de restricción que produzcan al menos dos fragmentos, según el software de clonación molecular utilizado. Una vez seleccionadas las enzimas, prepare las muestras de prueba agregando 1 μL de cada enzima, 5 μL del ADN generado y 13 μL de agua con sales y tampones apropiados dependiendo de las enzimas utilizadas. Incubar la reacción a 37 °C durante 1 h, o como sugiere el fabricante de la enzima. Ejecute los productos de digestión de prueba en un gel de agarosa al 1% y determine si las bandas son correctas.
      NOTA: Si las bandas son correctas, proceda a la secuenciación.
    2. Para realizar la secuenciación, genere cebadores basados en el ADN almacenado en el software de modo que las regiones de recocido de los cebadores estén separadas por aproximadamente 500 pb (pares de bases) y cubran el fragmento de interés (componente del circuito genético) o el plásmido completo. Diluya los cebadores con agua pura libre de nucleasas (NF-H2O) a una concentración de 10 mM. Prepare las muestras de secuenciación agregando 1 μL de ADN de 10 ng/μL, 1 μL de cebador y 8 μL de NF-H2O a un tubo de 0,2 mL. Repita esto para cada imprimación.
      NOTA: Cuando se preparen las muestras, déjelas en la instalación de secuenciación y compare los resultados con la secuencia de plásmidos utilizando un software de clonación molecular.
  19. En este paso, genere aproximadamente 100-1000 ng / μL de muestra de ADN para integrar los plásmidos que contienen circuitos genéticos en la línea celular apropiada.

2. Ingeniería de línea celular estable

  1. Ordene una línea celular de mamíferos diseñada para la generación rápida de sublíneas estables que aseguren la expresión de alto nivel de la proteína de interés a partir de un vector de expresión de mamíferos. El tipo de célula y la facilidad de la ingeniería de líneas celulares pueden ser variables dependiendo de lo que los usuarios prefieran o pretendan lograr.
    1. Por ejemplo, si los usuarios prefieren la ingeniería de líneas celulares con pasos intermedios mínimos, ordene las células que contienen un solo sitio de integración estable (por ejemplo, FRT) en un locus genómico transcripcionalmente activo. Si se prefiere una ingeniería celular más matizada, cree sitios de integración en ubicaciones preferidas utilizando herramientas de ingeniería genética como CRISPR / Cas9.
  2. Cultivar células en 5% de CO2 en aire humidificado a 37 °C. Ajuste las condiciones de crecimiento según sea necesario para el tipo de célula.
  3. Transfectar los circuitos genéticos diseñados anteriormente en las células deseadas obtenidas de los pasos anteriores para comenzar un proceso estable de generación de líneas celulares. Para lograr esto, utilice una mezcla de liposomas45 del ADN del circuito génico con la recombinasa adecuada (por ejemplo, Flp-recombinasa para la recombinación Flp-FRT) o a través de otros métodos como la electroporación.
  4. Dos días después de la transfección, divida las células al 25% de confluencia.
  5. Seis horas después de dividir las células, comience la selección de antibióticos intercambiando los medios a un medio fresco que contenga 50 μg / ml de antibiótico de higromicina (u otro agente antibiótico correspondiente al gen de resistencia a los antibióticos de mamíferos elegido durante la construcción del plásmido).
    NOTA: Hay una variedad de genes de resistencia a los antibióticos de mamíferos utilizados en la construcción de circuitos genéticos, cada uno de los cuales tiene una curva de muerte diferente. Por lo tanto, cualquiera que sea el gen de resistencia a los antibióticos de mamíferos que se elija para la construcción de circuitos, se debe estudiar una curva de muerte adecuada en las células de interés. Este paso garantiza que las células que contienen la carga útil del circuito genético se enriquezcan, mientras que las que no tienen el sistema se eliminan.
  6. Permita que las células crezcan en el medio de selección de antibióticos, cambie a medios frescos cada 2-3 días hasta que la placa o matraz tenga unas pocas docenas de focos. Pasaje de cultivos adherentes cuando se encuentran en la fase logarítmica antes de que alcancen la confluencia.
  7. Una vez que haya suficientes focos, tripsinizar las células con 1 ml de tripsina al 0,25%, EDTA al 0,1% en la solución salina equilibrada de Hank (HBSS) sin bicarbonato de calcio, magnesio y sodio durante varios minutos. Neutralice la tripsina con medios frescos y pase todas las células a un recipiente fresco.
  8. Una vez que las células en el recipiente fresco sean 80% -100% confluentes, congélelas en una mezcla de 45% de medios viejos, 45% de medios frescos y 10% de DMSO. Transfiera las células restantes a un tubo estéril y realice una clasificación de una sola célula para aislar las células monoclonales en una placa de 96 pocillos.
  9. Aproximadamente 2-3 semanas después de la clasificación monoclonal, los pozos dentro de la placa de 96 pocillos deben tener focos. Cuando aproximadamente el 50% -60% confluente, divida las células en una placa de 12 pocillos.
  10. Una vez que la placa de 12 pocillos es 80% -100% confluente, divida en un matraz T-25 tratado con cultivo de tejido. Una vez que las células en el matraz T-25 son 80% -100% confluentes, congele las células y mantenga un pasaje para la caracterización y prueba de líneas celulares monoclonales.
    1. Caracterizar las líneas celulares monoclonales mediante microscopía y ensayos de citometría de flujo para reportar perfiles de expresión génica basados en la producción inducida de reportero fluorescentes. Verificar la producción de proteínas funcionales a través del etiquetado de anticuerpos fluorescentes y el ensayo de inmunofluorescencia. Probar la inducción de la expresión génica a nivel transcripcional mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). Validar la secuencia genética y la precisión de la integración a través de la secuenciación local y del genoma completo de los clones.

3. Ensayos de inducción de aparatos de placas ligeras

  1. Construir un dispositivo LPA31,46 para ser utilizado para la inducción de luz de células modificadas. Brevemente, varios pasos amplios son cruciales para la creación de LPA para usar para controlar la expresión génica. Estos incluyen componentes de marco LPA de impresión 3D, construcción de placa de circuito, programación del circuito a través del programador de microcontroladores, ensamblaje de los componentes en un LPA final, programación de la tarjeta de memoria a través del software IRIS y calibración del dispositivo terminado. Para una explicación más completa, consulte las referencias anteriores.
    1. Imprima las partes 3D como se describe en Gerhardt et al. (2016 y 2019)31,46.
    2. Ensamble la placa de circuito como se describe en Gerhardt et al. (2016 y 2019)31,46.
    3. Agregue el firmware al circuito LPA ensamblado utilizando el programador de microcontroladores como se describe en Gerhardt et al. (2016 y 2019)31,46.
    4. Combine las piezas impresas en 3D y la placa de circuito ensamblada como se describe en Gerhardt et al. (2016 y 2019)31,46. Esto incluye tomar la placa de montaje, la placa de circuito, el espaciador LED (diodos emisores de luz), el adaptador de placa, una placa de 24 pocillos, una tapa de placa, pernos de montaje y tuercas de ala y componentes de apilamiento como se muestra en el video filmado y la Figura 2.
    5. Para la programación y calibración de la tarjeta de memoria del dispositivo, siga los pasos que se describen a continuación.
  2. Utilice el software IRIS disponible en el sitio web de Tabor Lab47 para programar una tarjeta SD para el Light Plate Apparatus (LPA)31 y explorar las condiciones de luz apropiadas necesarias para comenzar un experimento optogenético.
    NOTA: El software IRIS es una aplicación basada en la web para programar el hardware electrónico optogenético, conocido como LPA, desarrollado por el Tabor Lab. El software permite la programación de valores relativos de IRIS que controlan los diodos emisores de luz (LED) individuales en cada pozo del hardware LPA.
  3. Elija la opción desplegable LPA (4 x 6), seguida de hacer clic en el enfoque de iluminación apropiado (estado estacionario, dinámico, avanzado).
    NOTA: Para este manuscrito, todos los ensayos se centrarán en los ejemplos de estado estacionario. Sin embargo, los ejemplos de configuración avanzada se pueden utilizar para la duración del pulso y los regímenes del ciclo de trabajo.
  4. Elija si los LED superiores o inferiores se iluminarán introduciendo valores en las celdas correspondientes a los pocillos de la placa. Para los LPA utilizados en este trabajo, se utilizaron LED azules colocados en la posición superior en todos los experimentos. Cada LED, una vez programado, puede proporcionar una exposición continua a la luz con una intensidad de luz constante. El software IRIS permite 4096 niveles de intensidad que se pueden programar.
  5. Una vez que se elijan las ubicaciones de los LED, ingrese los valores de intensidad para el esquema experimental deseado. Por ejemplo, introduzca 8 intensidades de luz diferentes (o duraciones de pulso o ciclos de trabajo) con tres réplicas técnicas por placa (Tabla 2). G.s. se refiere a las unidades de escala de grises: los valores de medición del nivel de intensidad de luz utilizados para la programación LPA en el software IRIS.
    1. Al diseñar archivos experimentales IRIS, tenga en cuenta los efectos de borde de los pozos adyacentes en el dispositivo LPA, la toxicidad de la luz por el aumento de las intensidades de exposición a la luz azul y la determinación del tipo de dosis-respuesta deseada (por ejemplo, monótona vs. no monótona).
    2. Si los usuarios programan células en el LPA en orden ascendente / descendente de un parámetro de luz particular (por ejemplo, intensidad), los pozos pueden producir efectos de borde de diafonía ligera o incluso calor que pueden influir en los pozos adyacentes. Esto puede influir inadvertidamente en el resultado de los resultados medidos cuando se completan los experimentos. Para aliviar esto, los usuarios pueden implementar una matriz de aleatorización en el software IRIS para codificar las ubicaciones de los pozos, minimizando los efectos de borde. Un ejemplo se describe en los resultados representativos a continuación (Figura 4A-B).
    3. Además, se ha encontrado que las intensidades más altas de luz azul interfieren con el crecimiento celular y la viabilidad48. Por lo tanto, para mitigar la toxicidad de la luz, es importante producir una curva de respuesta de intensidad de luz, duración del pulso o ciclo de trabajo dependiendo de la modalidad que se esté investigando.
      1. Por ejemplo, programe 8 valores de intensidad de luz con tres réplicas por placa de 24 pocillos, con un rango de sin luz a una intensidad máxima del LPA. Luego, ejecute estas muestras en un citómetro de flujo con una puerta SSC-FSC o una tinción viva como el yoduro de propidio para cuantificar la supervivencia de las células de la población (células vivas en comparación con los eventos totales, incluidas las células muertas / desechos celulares) en cada valor de luz.
      2. Luego, determine la cantidad ideal de supervivencia de la población para la configuración experimental, ya que cualquier estímulo puede afectar negativamente la proliferación, la expresión génica o la supervivencia (por ejemplo, establecer una supervivencia celular del 80% como una compensación adecuada). Por ejemplo, en este trabajo, una vez calibrado, la intensidad no superó los 3000 g.s. unidades (~3/4 de la intensidad máxima del dispositivo LPA). Un ejemplo de esto se describe en los resultados representativos a continuación.
    4. Además de restringir los valores de luz debido a la toxicidad, los usuarios pueden desear restringir los valores de luz para caracterizar una parte particular de la dosis-respuesta, como el rango de la respuesta monótona.
      1. Para lograr esto, inicialmente escanee una amplia gama de intensidades de luz, duraciones de pulsos o ciclos de trabajo dependiendo de la modalidad que se analice al determinar la dosis-respuesta deseada (Tabla 2) para reducir el régimen de luz de interés, por ejemplo, donde la expresión génica se correlaciona positivamente con el aumento de los valores de luz para una dosis-respuesta monotónica.
      2. Para determinar el rango de luz de interés, programe un solo LPA con hasta 24 pocillos de diferente intensidad / duración del pulso / ciclo de trabajo / etc. o más pozos (por ejemplo, 48, 72, 96, etc.) dependiendo de si se calibran múltiples LPA para entregar cantidades de luz equivalentes y continuar con el trabajo de cultivo celular o los ensayos que se describen a continuación. Por lo tanto, iniciar la caracterización de un sistema optogenético con un amplio rango de dosis de estímulos de luz para determinar el intervalo de rango que da la expresión génica deseada y posteriormente realizar experimentos en ese rango de dosis refinado.
      3. Por ejemplo, en este trabajo, una vez que se determinaron 3000 g.s. unidades como umbral para la intensidad de la luz tóxica; este umbral se utilizó como límite superior de la luz para los ensayos descritos a continuación (por ejemplo, inmunofluorescencia).
        NOTA: Los pasos anteriores son independientes de la calibración óptica del LPA y se refieren a una calibración a nivel molecular para cada sistema optogenético.
  6. Una vez que se programan los valores de intensidad de luz adecuados en IRIS, inserte una tarjeta de memoria con la toma USB 3.0 en el LPA para descargar y transferir los archivos.
  7. Si la calibración del LPA es completa31, proceda al trabajo de cultivo celular para el inicio del ensayo de inducción de luz. Si no se ha realizado la calibración, calibre el LPA utilizando un método de análisis de imagen (pasos 3.7.1-3.7.3) una vez que el LPA esté programado con el programador del microcontrolador.
    1. Programe brevemente el LPA para que tenga el mismo nivel de IRIS descrito por Gerhardt et al. (2016)31.
      NOTA: Para la calibración, el LPA fue programado para tener un valor de 2000 g.s.
    2. Una vez que el dispositivo está programado con la tarjeta de memoria y se presiona el botón de reinicio (botón físico en el LPA), adquiera una imagen de todo el dispositivo (por ejemplo, el generador de imágenes de la estación de gel, el dispositivo del escáner, etc.). Para la calibración, adquiera dos imágenes con el dispositivo girado 180°.
    3. Luego, use un software de código abierto diseñado por Gerhardt et al. (2016)31 para mostrar la variabilidad en la intensidad del LED en la placa LPA y calcular los valores de compensación del LED para que la intensidad sea igual en todos los pozos. Un ejemplo de esto se describe en los resultados representados a continuación (Figura 3). Una vez completada esta calibración, proceda al trabajo de cultivo celular para iniciar el ensayo de inducción de luz.
  8. Obtener matraces de células monoclonales modificadas de la sección anterior para investigar los efectos de la inducción de luz en la expresión génica.
  9. Retire los medios viejos del matraz.
  10. Agregue 1 ml de tripsina a las células e incube durante 5 min.
  11. Después de 5 min, neutralice la tripsina agregando 4 ml de medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM u otro medio deseado) complementado con los productos químicos necesarios (este trabajo utilizó 50 μg / ml de higromicina, solución de penicilina / estreptomicina al 1%, suero bovino fetal al 10%, FBS).
  12. Agregue ~ 75,000 células por pozo en una placa negra de 24 pocillos en un volumen total de 500 μL. El número de células sembradas puede variar dependiendo de la duración del experimento deseado y del tipo de célula utilizada.
    NOTA: Además, tenga en cuenta que la densidad de siembra celular afecta el mantenimiento del cultivo y potencialmente la duración del experimento. Comenzar con un número menor de células por pozo asegura una mayor duración del tiempo antes de que el cultivo alcance la confluencia. Además, el tipo de componentes optogenéticos integrados en los circuitos genéticos de interés influirá en cuándo la expresión génica alcanza un estado estacionario y, por lo tanto, afectará la duración de los experimentos. Otros factores que se pueden considerar son las tasas de crecimiento específicas de la línea celular, la composición de los medios y los efectos de crecimiento condicional (es decir, la luz).
  13. Después del emplatado, coloque las células en una incubadora humidificada con 5% de CO2 para que se asienten durante 2-6 h.
  14. Después de la incubación, transfiera las células a una campana de cultivo de tejidos, retire la tapa de plástico y agregue una tira de lámina adhesiva a la parte superior de la placa (Figura 2D). Este paso permite una transferencia de luz mínima entre pozos, ya que la parte superior y los lados de los pozos están recubiertos, y la luz ahora solo puede ingresar desde la parte inferior del pozo donde se coloca el LED.
  15. Coloque la placa en las partes 3D instaladas del LPA. Luego, cubra la placa con la tapa LPA impresa en 3D, que se ajusta sobre los tornillos del dispositivo en cada esquina.
  16. Conecte el dispositivo a la fuente de alimentación y presione el botón de reinicio en el dispositivo LPA para asegurarse de que se aplica la configuración actualizada del experimento LPA.
  17. Incubar las células dentro del sistema experimental durante un período de tiempo adecuado, dependiendo de la densidad de siembra original, la velocidad de crecimiento específica de la línea celular y las condiciones de crecimiento. En este ejemplo, las líneas celulares fueron inducidas durante 3 días de forma continua para que la expresión génica alcanzara un estado estacionario. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que muchos sistemas optogenéticos (por ejemplo, VVD) pueden alcanzar la expresión génica en estado estacionario mucho antes (por ejemplo, 24 h) y, por lo tanto, los tiempos de inducción experimental pueden reducirse o prolongarse según sea necesario.
  18. Al final del experimento de inducción de luz, utilice las muestras para cualquiera de los siguientes cuatro ensayos para caracterizar las líneas celulares diseñadas (secciones 4-7).

4. Microscopía de fluorescencia de células modificadas por la luz

  1. 24-72 h después de la inducción, retire las células en el LPA de la incubadora y colóquelas en una campana de cultivo de tejidos.
  2. Retire la tira de papel de aluminio y deje que la placa repose durante 1-2 minutos. Esto evita que se forme condensación en la tapa de plástico, si se coloca inmediatamente en la placa.
  3. Después de 1-2 minutos de estar sentado, vuelva a colocar la tapa de plástico original en el plato.
  4. Tome imágenes de las células con el microscopio de contraste de fase o fluorescencia apropiado.
  5. Dependiendo del instrumento, ajuste el tiempo de exposición, la intensidad de la fuente de luz y la ganancia para mostrar las celdas de ingeniería. En este experimento, se aplicaron los siguientes parámetros: 50 ms para el tiempo de exposición de la fuente de luz FITC / GFP (proteína fluorescente verde) y 1-5 ms para el tiempo de exposición al contraste de fase al 100% de intensidad para cada uno.
    NOTA: Cabe señalar que los tiempos óptimos de exposición, los niveles de ganancia y las intensidades de la fuente de luz a menudo se derivan empíricamente de la experiencia de este trabajo para minimizar la sobresaturación en el informador de fluorescencia, minimizar el daño celular y capturar imágenes adecuadas para el análisis cualitativo y cuantitativo. Al determinar los niveles de cada uno de estos parámetros, los aspectos a tener en cuenta incluyen maximizar las relaciones señal-ruido, minimizar la fototoxicidad, minimizar la sobresaturación de las señales de fluorescencia y aumentar la capacidad de amplificar las señales de fluorescencia débiles.
    1. Optimizar estos parámetros de forma groseramente ad-hoc; sin embargo, los valores experimentales previos (por ejemplo, la intensidad de la fuente de luz que causa la sobresaturación del informador de fluorescencia) pueden guiar futuros entornos experimentales cuando corresponda. Por ejemplo, los ajustes de ganancia, los tiempos de exposición y los valores iniciales de intensidad de luz de un circuito (LITer1.0) o configuración experimental (por ejemplo, intensidad de luz) se pueden usar como punto de partida cuando se mueve a un circuito genético similar pero diferente (LITer2.0)11 o una modalidad de luz diferente (por ejemplo, ciclo de trabajo ligero).
  6. Optimice las imágenes de placas mediante una plantilla de coordenadas programada en el software de microscopía que permite que todo el tamaño de la placa (por ejemplo, 24 pozos) tenga una adquisición de imágenes automatizada desde múltiples ubicaciones de imágenes por pozo.

5. Citometría de flujo de células modificadas inducidas por la luz

  1. 24-72 h después de la inducción, retire las células del LPA en la incubadora o del microscopio después de la toma de imágenes y colóquelas en la campana de cultivo de tejidos.
  2. Si se retira directamente del LPA, retire la tira de papel de aluminio y deje que la placa repose durante uno o dos minutos.
  3. Aspire los medios de cada pozo (de toda la placa de 24 pocillos si se utilizan todos los pozos).
  4. Agregue 100 μL de tripsina al 0.25% a cada pozo, cubra la placa con una tapa de plástico y colóquela nuevamente en la incubadora.
  5. Deje las células sin molestar en la incubadora durante 5 minutos.
  6. Después de 5 minutos, retire la placa y devuélvala a la campana de cultivo de tejidos.
  7. Neutralizar cada pozo tripsinizado con 400 μL de DMEM.
  8. Etiquete un tubo de fondo redondo de poliestireno de 5 ml con colador celular (o un tubo de citometría de flujo apropiado que se pueda filtrar para eliminar grandes grupos de células no completamente tripsinizadas) con un nombre correspondiente a cada pozo.
  9. Utilice una pipeta P1000 para pipetear el contenido de cada pozo hacia arriba y hacia abajo 6-8 veces para romper los grupos celulares y crear muestras unicelulares para la citometría de flujo49.
  10. Transfiera todo el contenido de cada pocillo (~500 μL) a los tubos etiquetados con el colador.
  11. Lleve las células al instrumento de citometría de flujo apropiado con láseres de las longitudes de onda correctas (puede traer tubos con células dentro o fuera del hielo).
    NOTA: El citómetro de flujo utilizado en este trabajo era parte de una instalación central ubicada en el hospital universitario.
  12. Cree una compuerta de dispersión hacia adelante y hacia el lado (FSC y SSC, respectivamente) para capturar las células individuales del tamaño y la granularidad apropiados para excluir desechos y grupos celulares en el software de citometría de flujo.
  13. Una vez que se establece la puerta, capture aproximadamente 10,000 celdas con la puerta apropiada. Ajuste este número dependiendo de la cantidad de datos celulares que los usuarios estén buscando. Repita para cada tubo que contenga las células del experimento.
  14. Una vez que se complete el experimento, importe los datos al software de datos de citometría de flujo disponible para su análisis.
  15. Cree una puerta FSC-SSC (como antes durante la adquisición) y aplíquela a cada lote de datos experimentales. Un pozo de referencia de la población celular no inducida se utiliza para crear esta puerta en este manuscrito, pero existen otras métricas para la creación de puertas, como las puertas basadas en la densidad.
  16. Con las condiciones experimentales cerradas con una puerta FSC-SSC, grafique los datos de citometría de flujo como histogramas o represente de otras maneras para ilustrar los patrones de expresión obtenidos. En este experimento, la fluorescencia fue capturada por los canales GFP/FITC o PE/TexasRed.

6. Extracción de ARN y PCR cuantitativa de los componentes del circuito génico

  1. 24-72 h después de la inducción, retire las células del LPA en la incubadora o del microscopio después de la toma de imágenes y colóquelas en la campana de cultivo de tejidos.
  2. Si se retira directamente del LPA, retire la tira de papel de aluminio y deje que la placa repose durante uno o dos minutos.
  3. Aspire los medios de cada pozo (de toda la placa de 24 pocillos si se utilizan todos los pozos).
  4. Proceda a extraer el ARN de las células utilizando el kit de extracción de ARN apropiado.
  5. Una vez completada la extracción de ARN, realizar una reacción de transcripción inversa de cada muestra (Tabla 3).
  6. Además, realizar PCR cuantitativa de cada muestra (Tabla 4). Utilice una ADN polimerasa y un protocolo asociado para configurar reacciones de PCR. Para este paso, configure una reacción multiplexada con un gen de limpieza y un gen de interés, o cree reacciones separadas. En este ejemplo, se sondearon los niveles de GFP, KRAS y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH). Después de completar el experimento qRT-PCR, proceda con el análisis a través del software disponible para ilustrar el cambio de pliegue del circuito génico a nivel de ARN.

7. Inmunofluorescencia de los componentes del circuito genético

  1. Use un baño de hielo o congelador para enfriar el metanol.
  2. 24-72 h después de la inducción, retire las células del LPA en la incubadora o del microscopio después de la toma de imágenes y colóquelas en la campana de cultivo de tejidos.
  3. Si se retira directamente del LPA, retire la tira de lámina y deje que la placa repose durante 1-2 minutos.
  4. Aspire los medios de cada pozo (de toda la placa de 24 pocillos si se utilizan todos los pozos).
  5. Agregue 100 μL de tripsina al 0.25% a cada pozo, cubra la placa con una tapa de plástico y colóquela nuevamente en la incubadora.
  6. Deje las células sin molestar en la incubadora durante 5 minutos.
  7. Después de 5 minutos, retire la placa y devuélvala a la campana de cultivo de tejidos.
  8. Neutralizar cada pozo tripsinizado con 400 μL de DMEM.
  9. Etiquete los tubos de minicentrífuga con los nombres correspondientes a cada pozo.
  10. Use una pipeta P1000 y pipetee el contenido de cada pozo hacia arriba y hacia abajo 6-8 veces para romper los grupos de celdas.
  11. Transfiera todo el contenido de cada pocillo (~500 μL) a los tubos etiquetados.
  12. Centrifugar las células durante 5 min a 400 x g.
  13. Cuando esté completo, deseche el sobrenadante y mueva las muestras a una campana de humos químicos.
  14. Resuspender las células (use una pipeta P1000 y una pipeta hacia arriba y hacia abajo 6-8 veces en cada tubo para romper los grupos celulares) en 750-1000 μL de paraformaldehído al 4% (diluido en solución salina tamponada con fosfato, PBS).
  15. Deje que las celdas permanezcan durante 15 minutos a temperatura ambiente.
  16. Después de la incubación, agregue 750-1000 μL de PBS. Pipeta hacia arriba y hacia abajo varias veces.
  17. Centrifugar las células durante 5 min a 400 x g.
  18. Cuando esté completo, deseche el sobrenadante y mueva las muestras a una campana de humos químicos.
  19. Resuspender las células (use una pipeta P1000 y una pipeta hacia arriba y hacia abajo 6-8 veces en cada tubo para romper los grupos de celdas) en 750-1000 μL de metanol helado.
  20. Deje que las celdas permanezcan durante 30 minutos en hielo o en un congelador de -20 °C.
  21. Después de la incubación, agregue 750-1000 μL de PBS. Pipeta hacia arriba y hacia abajo varias veces.
  22. Centrifugar las células durante 5 min a 400 x g.
  23. Cuando esté completo, deseche el sobrenadante y mueva las muestras a una campana de humos químicos.
  24. Dependiendo del tipo de anticuerpos utilizados, modifique el protocolo a partir de este momento. Siga los pasos 7.24.1-7.24.14 o 7.24.15-7.24.22.
    1. Si usa un anticuerpo primario y secundario, resuspenda las células usando una pipeta P1000 / P200 y una pipeta hacia arriba y hacia abajo 6-8 veces en cada tubo para romper los grupos celulares en 100 μL de anticuerpo primario. En este caso, se realizó una dilución de 1:800 para los anticuerpos de stock, incluido el anticuerpo KRAS o el anticuerpo ERK, y se dejó reposar durante 1 h a temperatura ambiente. Los anticuerpos se diluyeron en un tampón de incubación hecho de 1x PBS con 0,5 g de BSA.
      NOTA: Determinar empíricamente la dilución exacta del anticuerpo mediante la creación de una curva estándar de diluciones de anticuerpos frente al antígeno de interés.
    2. Después de agregar anticuerpos, cubra los tubos con una lámina para evitar efectos de luz en los anticuerpos marcados.
    3. Después de la incubación, agregue 750-1000 μL del tampón de incubación. Pipeta hacia arriba y hacia abajo varias veces.
    4. Centrifugar las células durante 5 min a 400 x g.
    5. Cuando esté completo, deseche el sobrenadante y mueva las muestras a una campana de humos químicos.
    6. Resuspender las células usando una pipeta P1000/P200 y una pipeta hacia arriba y hacia abajo 6-8 veces en cada tubo para romper los grupos celulares en 100 μL de anticuerpo secundario. En este caso, las células se resuspendieron en un anticuerpo secundario de 100 μL a una dilución de 1:800 para el anticuerpo KRAS o 1:2000 para el anticuerpo ERK y se dejaron reposar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Similar a los anticuerpos primarios, diluya los anticuerpos secundarios en el tampón de incubación como se describió anteriormente. Determinar las diluciones de los anticuerpos secundarios basándose en los hallazgos empíricos de una curva estándar.
    7. Después de agregar anticuerpos, cubra los tubos con una lámina para evitar efectos de luz en los anticuerpos marcados.
    8. Después de la incubación, agregue 750-1000 μL del tampón de incubación. Pipeta hacia arriba y hacia abajo varias veces.
    9. Centrifugar las células durante 5 min a 400 x g.
    10. Cuando esté completo, deseche el sobrenadante y mueva las muestras a una campana de humos químicos.
    11. Resuspender las células usando una pipeta P1000 y una pipeta hacia arriba y hacia abajo 6-8 veces en cada tubo para romper los grupos de células en 500 μL de PBS.
    12. Transfiera todo el contenido de cada tubo (~500 μL) a los tubos etiquetados con coladores.
    13. Llevar las células a instrumentos de citometría de flujo apropiados con láseres de las longitudes de onda correctas (puede traer tubos con células dentro o fuera del hielo).
      NOTA: Cabe señalar que tener varios controles es importante para progresar con la medición de la citometría de flujo y el análisis de la expresión génica celular modificada. Por ejemplo, tener células completamente no teñidas, células teñidas con anticuerpo primario solo y células teñidas con anticuerpo secundario solo puede ser útil para comparar los resultados con las señales de fondo de los anticuerpos.
    14. A continuación, continúe con el análisis como se describe en la sección 5.
    15. Si usa solo un anticuerpo primario, resuspenda las células usando una pipeta P1000 / P200 y una pipeta hacia arriba y hacia abajo 6-8 veces en cada tubo para romper los grupos celulares en 100 μL de anticuerpo primario marcado. Determinar la dilución adecuada de anticuerpos e incubar durante 1 h a temperatura ambiente. Determinar empíricamente la dilución de anticuerpos a partir de la curva estándar.
    16. Después de agregar anticuerpos, cubra los tubos con una lámina para evitar efectos de luz en los anticuerpos marcados.
    17. Después de la incubación, agregue 750-1000 μL del tampón de incubación. Pipeta hacia arriba y hacia abajo varias veces.
    18. Centrifugar las células durante 5 min a 400 x g.
    19. Resuspender las células usando una pipeta P1000 y una pipeta hacia arriba y hacia abajo 6-8 veces en cada tubo para romper los grupos de células en 500 μL de PBS.
    20. Transfiera todo el contenido de cada tubo (~500 μL) a tubos etiquetados con coladores.
    21. Llevar las células a instrumentos de citometría de flujo apropiados con láseres de las longitudes de onda correctas (puede traer tubos con células dentro o fuera del hielo).
      NOTA: Cabe señalar que tener varios controles es importante para progresar con la medición de la citometría de flujo y el análisis de la expresión génica celular modificada. Tener células completamente no teñidas y células teñidas con anticuerpos primarios solos es útil para comparar los resultados con las señales de fondo de los anticuerpos.
    22. A partir de este punto, proceda con el análisis descrito en la sección 5.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El ensamblaje de circuitos genéticos y la generación de líneas celulares estables dentro de este artículo se basaron en células HEK-293 comerciales modificadas que contienen un sitio FRT estable único y transcripcionalmente activo (Figura 1). Los circuitos genéticos se construyeron en vectores que tenían sitios FRT dentro del plásmido, lo que permitió la integración Flp-FRT en el genoma celular HEK-293. Este enfoque no se limita a las células Flp-In, ya que los sitios FRT se pueden agregar a...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los lectores de este artículo pueden obtener información sobre los pasos vitales para caracterizar los circuitos genéticos optogenéticos (así como otros sistemas de expresión génica), incluidos 1) el diseño, la construcción y la validación de circuitos genéticos; 2) ingeniería celular para introducir circuitos genéticos en líneas celulares estables (por ejemplo, recombinación Flp-FRT); 3) inducción de las células diseñadas con una plataforma basada en la luz como el LPA; 4) caracterización inicial de ensayos de inducción...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no declaran intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nos gustaría agradecer al laboratorio Balázsi por sus comentarios y sugerencias, al Dr. Karl P. Gerhardt y al Dr. Jeffrey J. Tabor por ayudarnos a construir el primer LPA, y al Dr. Wilfried Weber por compartir los plásmidos LOV2-degron. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud [R35 GM122561 y T32 GM008444]; El Centro Laufer de Biología Física y Cuantitativa; y una beca de Posgrado en Ciencias e Ingeniería de Defensa Nacional (NDSEG). Financiamiento para el cargo de acceso abierto: NIH [R35 GM122561].

Contribuciones de los autores: M.T.G. y G.B. concibieron el proyecto. M.T.G., D.C. y L.G., realizaron los experimentos. M.T.G., D.C., L.G. y G.B. analizaron los datos y prepararon el manuscrito. G.B. y M.T.G. supervisaron el proyecto.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubos de PCR de 0,2 mL951010006Eppendorfpara realizar PCR
0,25% Tripsina EDTA 1XThermo Fisher Scientificde MT25053CIpara dividir y recolectar células
de mamíferos 0,5-10 μ L Pipeta de volumen ajustableEppendorf3123000020herramienta utilizada para reacciones de pipeteo
100-1000 μ L Pipeta de volumen ajustableEppendorf3123000039herramienta utilizada para pipetear reacciones
20-200 μ L Pipeta de volumen ajustableEppendorf3123000055herramienta utilizada para pipetear reacciones
2-20 μ L Pipeta de volumen ajustable3123000039Eppendorfutilizada para pipetear reacciones
Tubo de fondo redondo de poliestireno de 5 mL con tapa de filtro de célulasReactivo de 352235 Corningpara citometría de flujo
Centrífuga 5702R, con rotor de 4 x 100, adaptadores de 15 y 50 mL,de 22628113Eppendorfpara el trabajo de cultivo de mamíferos
AgarosaDenville ScientificGR140-500reactivo para electroforesis en gel
Láminas de aluminio para placas de 96 pocillosVWR®60941-126Herramienta utilizada para cubrir placas en experimentos de inducción de luz
AmpicilinaSigma AldrichA9518-5GReactivo para la selección de bacterias con plásmido correcto
Mezclador de vórtice analógico ThermoFisher Scientific02215365PRherramienta para llevar reacciones de PCR, transformación o extracción en gel
Agar deshidratado BactoDF0140010Fisher Scientificpara bacterias en crecimiento
BD LSRAriaBD656700herramienta para clasificar líneas celulares modificadas en poblaciones monoclonales
BD LSRFortessaBD649225herramienta para caracterizar líneas celulares modificadas
BSA, albúmina de suero bovinocientífica gubernamentalSIGA4919-1Gpara tampón
de incubación de FIPlaca de cultivo celular de 12 pocillos, transparente, de fondo plano con tapa, poliestireno, no pirogénico, TC estándar353043Corningutilizada para el cultivo de células monoclonales
CentrífugaVWR22628113instrumento para el cultivo de células de mamíferos
Campana de gases químicosN/A/Apara llevar a cabo reacciones de FI
Placa de cultivo celular transparente de 24 pocillos de fondo plano con tapaBD353047placa utilizada para el cultivo de células monoclonales
CytoOne T25 tapón de filtro TC matrazScientificCC7682-4825contenedor para el cultivo de células de mamíferos
Dimetilsulfóxido (DMSO)Fischer ScientificReactivo BP231-100utilizado para congelar células de mamíferos modificadas
Bromuro de etidioReactivo Thermo Fisher Scientific15-585-011para electroforesis
en gelMicroplaca de cultivo con tratamiento TC de fondo plano transparente de pozo Falcon 96, con tapaContenedor353072Corning para el cultivo de células monoclonales clasificadas
Software FCS ExpressDe Novo:N/Asoftware para caracterizar datos de citometría
de flujo Suero fetal bovino, regular, USDA 500 mLReactivo Corning35-010-CVpara el cultivo de células
de mamíferosPlacas de Petri Fisherbrand con tapa transparente - Cresta elevada; Equipo de FB0875712 Fisher Scientific de 100 x 15 mmpara el cultivo de bacterias
Gibco  DMEM, termo de alta glucosaFisher Scientific11-965-092para el cultivo de células de mamífero
Hs00932330_m1 KRAS isoforma a Ensayo de expresión génica de TaqmanSonda de 4331182 de qPCRTechnologies
Higromicina B (50 mg/mL), 20 mLReactivo Life Technologies10687-010para seleccionar células con la integración adecuada de circuitos
genéticos iScript Transcripción inversa SupermixBio-Rad Laboratories1708890reactivo para la conversión de ARN en ADNc
Congelador de laboratorio -20 ° CVWR76210-392equipo para el almacenamiento de reactivos experimentales
Congelador de laboratorio -80 ° CPanasonicMDF-U74VCequipo para el almacenamiento de reactivos experimentales
Refrigerador de laboratorio +4 ° CVWR76359-220equipo para el almacenamiento de reactivos experimentales
LB Broth (Lennox) , 1 kgSigma-AldrichL3022-250Greactivo para el cultivo de bacterias
LIPOFECTAMINE 3000Life TechnologiesL3000008para la transfección de circuitos genéticos en células de mamíferos
MATLAB 2019MathWorks/Asoftware para el análisis de datos
experimentalesMetanolAcros Organics413775000 reactivo para reacción de inmunofluorescencia
Tubos de microcentrífuga, polipropileno 1,7 mLContenedor de plásticoVWR20170-333
Mr04097229_mr EGFP/YFP Ensayo de expresión génica TaqmanSonda4331182qPCR
MultiTherm ShakerBenchmark Scientific H5000-HCEquipo para bacterias
Espectrofotómetro NanoDrop LiteThermo Fisher ScientificEquipo ND-NDL-US-CANpara la medición de la concentración de ADN/ARN
NEB Q5 ADN polimerasa de alta fidelidad 2x Master MixReactivo NEBM0492Spara PCR de fragmentos de circuitos génicos
NEB10-beta E. coli competente (alta eficiencia)New England Biolabs (NEB)C3019Hcélulas bacterianas para amplificar el circuito génico de interés
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNew England Biolabs (NEB)E2621Lreactivo para combinar fragmentos de circuitos genéticos
Microscopio invertido Nikon Eclipse Ti-E con una cámara DS-Qi2Nikon Instruments Inc.N/A: instrumentopara cuantificar la expresión génica
NIS-Elements,Nikon Instruments, Inc.N/Asoftware para la caracterización de datos de microscopía de fluorescencia
oligonucleótidosIDTReactivo N/Autilizado para la PCR de componentes de circuitos génicos
Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Incubadora con UV y H2O2 ControlPanasonicMCO-170AICUVHL-PAInstrumento para el cultivo de células
de mamíferosParaformaldehído, 16% Microscopía Electrónica de gradoMicroscopía Electrónica Sciences15710-Sreactivo
PBS, solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (D-PBS) (1x)Reactivo de 14190144 de Invitrogenpara cultivo de células de mamíferos,reactivo para tampón de incubación de FI
Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL), 100xReactivo Fisher Scientific15140-122para el cultivo de células
de mamíferosanticuerpo primario ERKTecnología de señalización celular4370SAnticuerpo primario ERK para inmunifluorescencia
Anticuerpo primario KRASSigma-Aldrich WH0003845M1anticuerpo primario KRAS para inmunifluorescencia
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)Qiagen27106kit de reactivos para purificar plásmidos de circuitos genéticos
QIAquick Kit de extracción de gel (50)Qiagen28704kit de reactivos para la purificación de fragmentos de circuitos génicos
Sistema de PCR en tiempo real QuantStudio 3Equipo EppendorfA28137qRT-PCR
Software Thermo Fisher ScientificN/Apara cuantificar la amplificación de ARN/ADNc
RNeasy Plus Mini KitQiagen74134para la extracción de ARN de células de mamíferos modificadas
genéticamente AnticuerpoERK secundarioTecnología de señalización celular8889Santicuerpo ERK secundario para inmunifluorescencia
anticuerpo KRAS secundarioInvitrogenA11005anticuerpo KRAS secundario para inmunofluorescencia
Pipetas serológicas 5,0 mLReactivos Olympus Plastics12-102utilizados para configurar una variedad de reacciones químicas
Sistema de imágenes SmartView Pro MajorScienceUVCI-1200herramienta para obtener imágenes de las bandas de PCR correctas
SnapGene Viewer (gratis) o SnapGeneSoftware SnapGeneN/ADiseño y análisis de secuencias de ADN
Incubadora superior de etapaTokai HitINU-TIZherramienta para llevar a cabo reacciones de PCR, transformación o extracción en gel
TaqMan Fast Advanced Master MixReactivo de 4444557 Thermo Fisher Scientificpara PCR de fragmentos de circuitos génicos
Control endógeno TaqMan Human GAPD (GAPDH) (sonda VIC/MGB), cebador limitado, 2500 rxnLife Technologies4326317Esonda qPCR
Bio-Rad1851148para llevar reacciones de PCR, transformación o extracción en gel
VisiPlate-24 Negro, Microplaca negra de 24 pocillos con fondo transparente, estéril y tratamiento con cultivo de tejidosPerkinElmer1450-605utilizada para la inducción de luz experimentos
VWR Pipetas Pasteur desechables, vidrio, pipeta de vidrio de borosilicato, punta corta, capacidad=2 mL, longitud total=14,6 cmVWR14673-010para el cultivo de células de mamíferos
VWR Mini sistemas de electroforesis horizontal, sistema de gel Mini10VWR89032-290para electroforesis en gel de ADN
Flp-In 293Thermo Fisher ScientificR75007Línea celular de ingeniería con FRT sitio
Reactivo de reactivo Herramienta equipo de 120 V Reactivo de Reactivo de fuente Placa de Instrumento N USA genéticamente de Reactivo Life N de Life Technologies para la aplicación de cuantificación relativa Termociclador de Herramienta Placa Reactivo Equipo

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sedlmayer, F., Hell, D., Muller, M., Auslander, D., Fussenegger, M. Designer cells programming quorum-sensing interference with microbes. Nature Communications. 9 (1), 1822(2018).
  2. Cho, J. H., Collins, J. J., Wong, W. W. Universal chimeric antigen receptors for multiplexed and logical control of T cell responses. Cell. 173 (6), 1426-1438 (2018).
  3. Saxena, P., et al. A programmable synthetic lineage-control network that differentiates human IPSCs into glucose-sensitive insulin-secreting beta-like cells. Nature Communications. 7, 11247(2016).
  4. Nevozhay, D., Zal, T., Balazsi, G. Transferring a synthetic gene circuit from yeast to mammalian cells. Nature Communications. 4, 1451(2013).
  5. Chang, H. H., Hemberg, M., Barahona, M., Ingber, D. E., Huang, S. Transcriptome-wide noise controls lineage choice in mammalian progenitor cells. Nature. 453 (7194), 544-547 (2008).
  6. Balazsi, G., van Oudenaarden, A., Collins, J. J. Cellular decision making and biological noise: from microbes to mammals. Cell. 144 (6), 910-925 (2011).
  7. Lee, J., et al. Network of mutually repressive metastasis regulators can promote cell heterogeneity and metastatic transitions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 364-373 (2014).
  8. Dar, R. D., Hosmane, N. N., Arkin, M. R., Siliciano, R. F., Weinberger, L. S. Screening for noise in gene expression identifies drug synergies. Science. 344 (6190), 1392-1396 (2014).
  9. Becskei, A., Seraphin, B., Serrano, L. Positive feedback in eukaryotic gene networks: cell differentiation by graded to binary response conversion. EMBO Journal. 20 (10), 2528-2535 (2001).
  10. Nevozhay, D., Adams, R. M., Murphy, K. F., Josic, K., Balazsi, G. Negative autoregulation linearizes the dose-response and suppresses the heterogeneity of gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (13), 5123-5128 (2009).
  11. Guinn, M. T., Balazsi, G. Noise-reducing optogenetic negative-feedback gene circuits in human cells. Nucleic Acids Research. 47 (14), 7703-7714 (2019).
  12. Shimoga, V., White, J. T., Li, Y., Sontag, E., Bleris, L. Synthetic mammalian transgene negative autoregulation. Molecular Systems Biology. 9, 670(2013).
  13. Ye, H., Daoud-El Baba, M., Peng, R. W., Fussenegger, M. A synthetic optogenetic transcription device enhances blood-glucose homeostasis in mice. Science. 332 (6037), New York, N.Y. 1565-1568 (2011).
  14. Pudasaini, A., El-Arab, K. K., Zoltowski, B. D. LOV-based optogenetic devices: light-driven modules to impart photoregulated control of cellular signaling. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, 18(2015).
  15. Liu, Y., et al. Robust and intensity-dependent synaptic inhibition underlies the generation of non-monotonic neurons in the mouse inferior colliculus. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 131(2019).
  16. Benzinger, D., Khammash, M. Pulsatile inputs achieve tunable attenuation of gene expression variability and graded multi-gene regulation. Nature Communications. 9 (1), 3521(2018).
  17. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  18. Duan, L., et al. Understanding CRY2 interactions for optical control of intracellular signaling. Nature Communications. 8 (1), 547(2017).
  19. Kim, N., et al. Spatiotemporal control of fibroblast growth factor receptor signals by blue light. Chemistry & Biology. 21 (7), 903-912 (2014).
  20. Jung, H., et al. Noninvasive optical activation of Flp recombinase for genetic manipulation in deep mouse brain regions. Nature Communications. 10 (1), 314(2019).
  21. Polstein, L. R., Gersbach, C. A. Light-inducible gene regulation with engineered zinc finger proteins. Methods in Molecular Biology. 1148, 89-107 (2014).
  22. Hallett, R. A., Zimmerman, S. P., Yumerefendi, H., Bear, J. E., Kuhlman, B. Correlating in vitro and in vivo activities of light-inducible dimers: A cellular optogenetics guide. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 53-64 (2016).
  23. Lee, D., Hyun, J. H., Jung, K., Hannan, P., Kwon, H. B. A calcium- and light-gated switch to induce gene expression in activated neurons. Nature Biotechnology. 35 (9), 858-863 (2017).
  24. Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).
  25. Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7, 12546(2016).
  26. Chen, R., et al. Rhythmic PER abundance defines a critical nodal point for negative feedback within the circadian clock mechanism. Molecular Cell. 36 (3), 417-430 (2009).
  27. Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418 (6901), 935-941 (2002).
  28. Sato, T. K., et al. Feedback repression is required for mammalian circadian clock function. Nature Genetics. 38 (3), 312-319 (2006).
  29. Kramer, B. P., Fischer, C., Fussenegger, M. BioLogic gates enable logical transcription control in mammalian cells. Biotechnology and Bioengineering. 87 (4), 478-484 (2004).
  30. Madar, D., Dekel, E., Bren, A., Alon, U. Negative auto-regulation increases the input dynamic-range of the arabinose system of Escherichia coli. BMC Systems Biology. 5, 111(2011).
  31. Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6, 35363(2016).
  32. Szczesny, R. J., et al. Versatile approach for functional analysis of human proteins and efficient stable cell line generation using FLP-mediated recombination system. PLoS One. 13 (3), 0194887(2018).
  33. Taxis, C. Development of a synthetic switch to control protein stability in eukaryotic cells with light. Methods in Molecular Biology. 1596, 241-255 (2017).
  34. Grav, L. M., et al. Minimizing clonal variation during mammalian cell line engineering for improved systems biology data generation. ACS Synthetic Biology. 7 (9), 2148-2159 (2018).
  35. Brophy, J. A., Voigt, C. A. Principles of genetic circuit design. Nature Methods. 11 (5), 508-520 (2014).
  36. Yeoh, J. W., et al. An automated biomodel selection system (BMSS) for gene circuit designs. ACS Synthetic Biology. 8 (7), 1484-1497 (2019).
  37. Usherenko, S., et al. Photo-sensitive degron variants for tuning protein stability by light. BMC Systems Biology. 8, 128(2014).
  38. Muller, K., Zurbriggen, M. D., Weber, W. An optogenetic upgrade for the Tet-OFF system. Biotechnology and Bioengineering. 112 (7), 1483-1487 (2015).
  39. Klotzsche, M., Berens, C., Hillen, W. A peptide triggers allostery in tet repressor by binding to a unique site. Journal of Biological Chemistry. 280 (26), 24591(2005).
  40. Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
  41. Herrou, J., Crosson, S. Function, structure and mechanism of bacterial photosensory LOV proteins. Nature Reviews Microbiology. 9 (10), 713-723 (2011).
  42. Yao, F., et al. Tetracycline repressor, tetR, rather than the tetR-mammalian cell transcription factor fusion derivatives, regulates inducible gene expression in mammalian cells. Human Gene Therapy. 9 (13), 1939-1950 (1998).
  43. Erlich, H. A. PCR technology : Principles and Applications for DNA Amplification. , Stockton Press. New York. (1989).
  44. Sambrook, J., Russell, D. W., Sambrook, J. The condensed protocols from Molecular cloning : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2006).
  45. Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (21), 7413-7417 (1987).
  46. Gerhardt, K. P., Castillo-Hair, S. M., Tabor, J. J. DIY optogenetics: Building, programming, and using the Light Plate Apparatus. Methods in Enzymology. 6224, 197-226 (2019).
  47. TaborLab IRIS. TaborLab IRIS Software. , Available from: http://taborlab.github.io/Iris/index.html (2021).
  48. Stockley, J. H., et al. Surpassing light-induced cell damage in vitro with novel cell culture media. Scientific Reports. 7 (1), 849(2017).
  49. Gordon, A., et al. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nature Methods. 4 (2), 175-181 (2007).
  50. Ordovas, L., et al. Efficient recombinase-mediated cassette exchange in hPSCs to study the hepatocyte lineage reveals AAVS1 locus-mediated transgene inhibition. Stem Cell Reports. 5 (5), 918-931 (2015).
  51. Gomez Tejeeda Zanudo, J., et al. Towards control of cellular decision-making networks in the epithelial-to-mesenchymal transition. Physical Biology. 16 (3), 031002(2019).
  52. Sweeney, K., Moreno Morales, N., Burmeister, Z., Nimunkar, A. J., McClean, M. N. Easy calibration of the Light Plate Apparatus for optogenetic experiments. MethodsX. 6, 1480-1488 (2019).
  53. Ravindran, P. T., Wilson, M. Z., Jena, S. G., Toettcher, J. E. Engineering combinatorial and dynamic decoders using synthetic immediate-early genes. Communications Biology. 3 (1), 436(2020).
  54. Chen, X., Wang, X., Du, Z., Ma, Z., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression in mammalian cells and in mice using the LightOn system. Current Protocols in Chemical Biology. 5 (2), 111-129 (2013).
  55. Guinn, M. T. Engineering human cells with synthetic gene circuits elucidates how protein levels generate phenotypic landscapes. State University of New York at Stony Brook. , Ann Arbor. Ph.D (2020).
  56. Farquhar, K. S., et al. Role of network-mediated stochasticity in mammalian drug resistance. Nature Communications. 10 (1), 2766(2019).
  57. Polstein, L. R., Gersbach, C. A. A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation. Nature Chemistry & Biology. 11 (3), 198-200 (2015).
  58. Guinn, M. T., et al. Observation and control of gene expression noise: Barrier crossing analogies between drug resistance and metastasis. Frontiers in Genetics. 11, 586726(2020).
  59. Levine, J. H., Lin, Y., Elowitz, M. B. Functional roles of pulsing in genetic circuits. Science. 342 (6163), 1193-1200 (2013).
  60. Rullan, M., Benzinger, D., Schmidt, G. W., Milias-Argeitis, A., Khammash, M. An optogenetic platform for real-time, single-cell interrogation of stochastic transcriptional regulation. Molecular Cell. 70 (4), 745-756 (2018).
  61. Perkins, M. L., Benzinger, D., Arcak, M., Khammash, M. Cell-in-the-loop pattern formation with optogenetically emulated cell-to-cell signaling. Nature Communications. 11 (1), 1355(2020).

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