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Artículo de método

Sitio Específico De La Acetilación De Lisina De Histonas Para La Reconstitución De Nucleosomas Utilizando La Expansión Del Código Genético En Escherichia coli

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DOI:

10.3791/62113

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26 de diciembre de 2020

 , 
1Department of Chemistry, Texas A&M University

En este artículo

Resumen

Aquí presentamos un método para expresar proteínas de histonas acetiladas utilizando la expansión del código genético y ensamblar nucleosomas reconstituidos in vitro.

Resumen

Las proteínas de histonas acetiladas se pueden expresar fácilmente en Escherichia coli codificando un mutante, Nε-acetil-lisina (AcK)-específica methanosarcina mazi pirrolysine tRNA-sintetasa (MmAcKRS1) y su ARNt cognado (tRNAPyl)para ensamblar mononucleosomas reconstituidos con histonas acetiladas específicas del sitio. MmAcKRS1 y tRNAPyl entregan AcK en un sitio de mutación ámbar en el ARNm de elección durante la traducción en Escherichia coli. Esta técnica se ha utilizado extensivamente para incorporar AcK en los sitios de la lisina H3. La pirrolysyl-tRNA sintetasa (PylRS) se puede también evolucionar fácilmente para incorporar otros aminoácidos noncanonical (ncAAs) para la modificación o la funcionalización específica de la proteína del sitio. Aquí detallamos un método para incorporar AcK utilizando el sistema MmAcKRS1 en la histona H3 e integrar proteínas H3 acetiladas en mononucleosomas reconstituidos. Los mononucleosomas reconstitudos acetilados se pueden utilizar en análisis bioquímicos y obligatorios, determinación de la estructura, y más. La obtención de mononucleosomas modificados es crucial para diseñar experimentos relacionados con el descubrimiento de nuevas interacciones y la comprensión de la epigenética.

Introducción

Hemos utilizado PylRS y tRNAPyl para sintetizar y ensamblar mononucleosomas reconstituidos con histonas acetiladas específicas del sitio. PylRS ha demostrado ser invaluable como una herramienta de expansión de código genético para producir proteínas con modificaciones postraduccionales (PTMs) y ha sido genéticamente evolucionado para incorporar alrededor de 200 ncAAs diferentes. PylRS incorpora en un codón de parada ámbar, eliminando la competencia de otros aminoácidos durante la traducción. PylRS fue descubierto por primera vez en arqueas metanógenas, y desde entonces se ha utilizado en biología química para incorporar nuevos grupos químicos reactivos en las proteínas1,2.

MmAcKRS1 fue evolucionado a partir de Methanosarcina mazei PylRS y frecuentemente utilizado en nuestro laboratorio para la síntesis de proteínas acetiladas3,4,5,6. MmAcKRS1 suministra AcK en un sitio de mutación ámbar en el ARNm de elección durante la traducción en Escherichia coli. Esta técnica se ha utilizado previamente para incorporar AcK en los sitios de lisina K4, K9, K14, K18, K23, K27, K36, K56, K64 y K79 histona H3 para estudiar la actividad de sirtuina 1, 2, 6 y 7 en mononucleosomas acetilados4,5,6. Aquí detallamos este método para expresar histonas acetiladas y reconstituir nucleosomas acetilados.

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Protocolo

1. Construcción del plásmido

  1. Comience por decidir qué proteína histona será acetilada y en qué sitio de lisina. Mutar el sitio al codón de parada ámbar (TAG) usando mutagénesis dirigida por el sitio.
    NOTA: Hay cuatro plásmidos previamente diseñados utilizados para la expresión de proteínas histonas. Las cuatro proteínas de histonas se clonaron en el vector pETDuet-1 con una etiqueta de histidina N-terminal. La histona H4 también incluye una etiqueta SUMO, el origen de la replicación colE1 con un número de copia de aproximadamente 40, resistente a la ampicilina, y un promotor T7.
    1. Diseñe cebadores delanteros e inversos que contengan una mutación TAG en el sitio deseado (reemplazando un codón de lisina existente con el codón de parada ámbar) en uno de los cuatro plásmidos de proteína histona.
    2. Utilice la PCR del plásmido entero para amplificar el PLÁSMIDO QUE CONTIENE. Determinar una temperatura de recocido adecuada para los cebadores. En general, la temperatura de fusión (Tm)de los cebadores menos 5 °C será suficiente. Si se experimenta dificultad para obtener un producto de PCR, se puede utilizar un gradiente de temperatura alrededor de Tm - 5 °C para optimizar la temperatura de recocido para la amplificación.
      NOTA: En este experimento se utilizó una PFU polimerasa expresada internamente durante 30 ciclos con las siguientes condiciones: 94 °C para 30 s (desnaturalización), temperatura de recocido para 30 s y 72 °C durante 6 min (o 1 min por kilobase-pares). Para obtener más detalles sobre este tipo de método de PCR, consulte Liu y Naismith7.
    3. Limpie el producto de PCR con un kit de limpieza de PCR siguiendo el protocolo del fabricante. Analizar el producto de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa y posterior tinción de bromuro de etidio.
    4. Ligar el plásmido incubando con T4 ligasa durante la noche a 16 °C.
  2. Primero transforme el PLÁSMIDO QUE CONTIENE TAG (AmpR)en Escherichia coliquímicamente competente. Recoger un mínimo de 4 colonias de la transformación y purificar el plásmido. Haga las existencias de la célula de cada uno con glicerol usando métodos estándar y almacene en -80 °C. Enviar para la secuenciación para confirmar la mutación tag deseada.
  3. Una vez confirmada la secuencia, co-transformar el plásmido que contiene TAG (AmpR)con pEVOL-AckRS (ChlR)en CobB químicamente competente (la única histona lisina desacetilasa conocida en E. coli.)deleción bl21 células utilizando el método de choque térmico. pEVOL es un plásmido con un origen p15A de número de copia medio a número de copia bajo.
    NOTA: La serie pEVOL de plásmidos se construyó en base a estudios previos que mostraron que un aumento de la expresión del par ortogonal aaRS/ARNtTyr fue eficaz en la disminución del truncamiento de proteínas y en el aumento de los rendimientos generales de proteínas mutantes8. Si las células de deleción CobB no son accesibles, proceda con células BL21 químicamente competentes. CobB es una sirtuina-como la histona lisina deacetilasa y nicotinamida se puede añadir en una concentración final de 5 mM durante la expresión de la proteína histona para inhibir CobB como un enfoque alternativo9.
  4. Haga un stock de celda y guárdelo a -80 °C.

2. Expresión de proteínas histonas acetiladas

  1. Preparar 1 L de medios 2YT en autoclave (o volumen de elección) en un matraz de cultivo.
  2. Inocular 20 mL de medios 2YT que contengan los antibióticos apropiados con el stock celular co-transformado que tiene el plásmido que contiene TAG (AmpR)y pEVOL-AckRS (ChlR)y crecer a 37 °C a OD = 0,6 (4-6 h).
  3. Añadir los antibióticos apropiados a la 1 L de medio autoclave 2YT e inocular con el cultivo de arranque de 20 mL. Crecer a 37 °C a OD = 0.6-0.8 (2-3 h).
  4. Añadir agentes inductores y acetilsilesina (AcK) a las concentraciones finales de IPTG 1 mM, arabinosa al 0,2% y AcK 5 mM.
  5. Cultivar el cultivo a 37 °C durante 6-8 h.
  6. Células pellet a 2.700 x g durante 15 min.
  7. Guarde el pellet celular a -80 °C durante la noche.
  8. A partir de este paso, mantenga la muestra en hielo todo el tiempo. Disuelva el pellet celular en 50 mL de tampón de lisis de histonas por 1 L de cultivo.
  9. Sonicar de acuerdo con el siguiente ciclo: 1 s encendido, 1 s apagado, total a tiempo: 3 min al 60% de amplitud.
  10. Cuerpos de inclusión de pellets a 41.600 x g durante 45 min.
  11. Deseche los cuerpos de inclusión sobrenadante y resuspend en 30 mL de tampón de lisis de histonas. La inclusión de pellets augura 41.600 x g durante 30 min.
  12. Deseche los cuerpos de inclusión sobrenadante y resuspend en 30 mL de tampón de lavado de pellets. Cuerpos de inclusión de pellets a 41.600 x g durante 30 min.
  13. Deseche el sobrenadante y disuelva los cuerpos de inclusión en 25 mL de tampón de clorhidrato de guanidina (GuHCl) de 6 M. Incubar con agitación a 37 °C durante 1 h.
    NOTA: Si es necesario, los cuerpos de inclusión se pueden incubar con agitación durante la noche a 4 °C.
  14. La inclusión de pellets augura 41.600 x g durante 45 min. Incubar el sobrenadante con 1 mL de resina de Ni-NTA equilibrada con tampón GuHCl de 6 M durante 2 h.
  15. Proceder con la purificación de Ni-NTA en condiciones desnaturalizado. Lave la columna con 3 volúmenes de columna de tampón de lavado de columna. Proteína de histona acetilada eluto con 10 mL de tampón de elución.
    NOTA: Intentar concentrar la proteína aquí es una opción, pero las histonas acetiladas son muy impredecibles y pueden precipitarse fácilmente. No se recomienda concentrar más allá de 2 mL en volumen total.
  16. Dializar extensamente la proteína acetilada de la histona contra el almacenador intermediario del ácido acético del 5% para quitar las sales. Dializar durante 3 h a la vez a 4 °C, intercambiando por tampón fresco un mínimo de 6 veces.
    NOTA: Para mejorar la pureza de las proteínas, existe la opción de dializar contra el agua pura. Sin embargo, esto causa precipitaciones significativas y reducción en el rendimiento que puede ser indeseable para las proteínas de histonas acetiladas de bajo rendimiento.
  17. Alícuota y liofilizar la proteína, y almacenar indefinidamente a -80 °C. Las proteínas de histonas de tipo salvaje generalmente producen 10-50 mg/L, mientras que las proteínas de histonas acetiladas producen menos de 10 mg/L dependiendo del sitio específico de lisina. Por ejemplo, H3K79Ac promedia 5 mg/L.

3. Expresión de proteínas histonas de tipo salvaje

  1. Para ensamblar nucleosomas completos, exprese las 4 proteínas de histonas. Al expresar y purificar histonas de tipo salvaje el protocolo es el mismo que el de las histonas acetiladas excepto las siguientes:
    1. No realice la cotransformación. No utilice pEVOL-AcKRS para la expresión de histonas de tipo salvaje. Ajuste los antibióticos en consecuencia.
    2. No use una línea celular de deleción cobb ni agregue nicotinamida, AcK o arabinosa durante la inducción de la expresión celular.

4. Preparación de ADN 601

NOTA: Una secuencia de ADN optimizada previamente diseñada para dirigir el posicionamiento del nucleosoma se ensambla con octómeros de histonas para producir mononucleosoma con alta eficiencia. Esta secuencia se conoce como ADN 601 o la secuencia de Widom. Esta secuencia se ha convertido en la secuencia de ADN estándar para estudios in vitro de nucleosomas desde ensayos de remodelación de cromatina hasta mediciones de molécula única10.

  1. Para preparar cantidades significativas de ADN 601 para el ensamblaje de nucleosomas, transforme pGEM-3z/601 en células Top 10 y cultive 10 mL de cultivo para amplificación y extracción de plásmidos. Use un kit de extracción de plásmidos y siga las recomendaciones del fabricante.
  2. Utilice una polimerasa PFU expresada internamente (más eficiente) para este protocolo de amplificación. Configurar una reacción de PCR: Para una reacción de 250 μL, utilice 207.5 μL en autoclave MQ H2O, 25 μL 10x PFU Buffer, 5 μL Forward Primer: ctggagaatcccggtgccg, 5 μL Reverse Primer: acaggatgtatatatctgacacg, 5 μL dNTP mix, 2.5 μL PFU enzyme. Por lo general, ejecutamos 60 reacciones a la vez para obtener suficiente ADN para ensamblar.
  3. Utilice una temperatura de recocido de 52 °C durante 30 s y un tiempo de extensión de 30 s si utiliza PFU polimerasa. De lo contrario, siga las condiciones recomendadas por los fabricantes.
  4. Una vez que se realiza la PCR, utilice un kit de limpieza de PCR de elección para purificar el producto de PCR.

5. Ensamblaje del octómero de histonas

  1. Disolver las alícuotas de pellets de proteína histona H2A, H2B, H3 y H4 para que haya un stock separado de cada proteína histona en GuHCl Buffer con un volumen total de 100 μL.
  2. Calcule la concentración de cada proteína histona midiendo la absorbancia A280.
  3. Si la absorbancia es mayor que 1 para cualquier proteína, diluir con tampón GuHCl para obtener una concentración más precisa.
  4. Combine las proteínas H2A y H2B en una proporción molar de 1:1 y diluya a una concentración total de proteínas de 4 μg/μL. Repita para H3 y H4.
  5. Dializar secuencialmente a 4 °C contra 2 M TE tampón durante la noche, 1 M TE tampón 2 h y 0,5 M TE tampón 5 h.
    NOTA: El segundo y tercer paso de la diálisis hace que las conformaciones inestables de la proteína se precipiten. Se espera ver fuertes precipitaciones en estos pasos.
  6. Eliminar los precipitados por centrifugación a 16.800 x g a 4 °C.
  7. De nuevo, calcule la concentración de dímeros de histonas (mezcla H2A/H2B) y tetrámeros (mezcla H3/H4) que miden la absorbancia A280.
  8. Mezcle dímeros y tetrámeros en una relación molar de 1:1 y ajuste el NaCl a 2 M mediante la adición de NaCl sólido.
  9. El octómero de histonas se puede almacenar a 4 °C y es más estable que los dímeros y tetrámeros. Nunca congele el octómero de histonas, ya que esto puede causar desmontaje.
  10. Si se ensambla con histonas acetiladas, simplemente reemplace la proteína de tipo salvaje con la proteína acetilada en el procedimiento.

6. Ensamblaje de nucleosomas

  1. Utilice un tampón 100x TE y NaCl sólido para ajustar el ADN 601 al tampón TE 2M. Agregue el ADN 601 en el tampón 2M TE al octómero de histonas en una relación molar de 0.85:1 a 0.90:1. Se puede agregar una proporción más baja de ADN si el ADN libre está presente en el análisis de cambio de gel.
  2. Transfiera la mezcla ADN-histona una bolsa de diálisis y colótela en aproximadamente 200 mL de tampón de 2M TE (o más si se ensamblan múltiples muestras) y revuelva muy suavemente a 4 °C.
  3. Configure una bomba peristáltica para purgar para que gotee lentamente sin tampón de TE de sal. Cuando el volumen se haya duplicado aproximadamente, vierta la mitad del volumen. Haga esto al menos 4 veces en total. Con una bomba esto puede tomar 4-8 h dependiendo del volumen de partida. Los nucleosomas se forman cuando la concentración de sal se reduce a 150 mM (medida por el medidor de salinidad).
  4. Después de que la concentración de sal se reduce a 150 mM, dializar contra un tampón de TE de 20 mM durante la noche.
  5. Eliminar los precipitados por centrifugación y medir la concentración de los nucleosomas mediante la lectura A260 utilizando un lector de placas.
  6. Añadir la proteasa His-TEV (TEV: nucleosoma 1:30, w:w ) e incubar durante la noche a 4 °C para eliminar todas las etiquetas de histidina. Retire las impurezas de la etiqueta de histidina de la solución de nucleosoma por la resina de Ni-NTA tire hacia abajo.
  7. Para posicionar el nucleosoma y homogeneizar la muestra, incubar a 60 °C durante 1 h.
    NOTA: Para los sitios acetilados que son particularmente inestables, este paso puede no ser aconsejable.
  8. Almacenar nucleosomas a corto plazo (unas semanas) a 4 °C.
  9. Para el almacenamiento a largo plazo, dializar nucleosomas contra tampón de almacenamiento y almacenarlos a -80 °C.

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Resultados

Los dímeros, tetrámeros y octómeros se pueden evaluar ejecutando un gel 12% SDS PAGE (Figura 1 y Figura 2). Aquí se puede ver que algunos de los tetrámeros acetilados tienen un rendimiento menor que otros (Figura 1). De hecho, cuanto más cerca de la región central, menor es el rendimiento observado. Esto es más probable debido a la acetilación que interfiere con el montaje del tetrámero cuanto más se...

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Discusión

Es esencial seguir este protocolo en cada detalle durante un experimento. Los nucleosomas no son muy estables y se ha dedicado mucho ensayo y error a la determinación de este protocolo. Es clave eliminar los precipitados en cada paso (o siempre que se observen) porque las partículas pueden interferir fácilmente con los procesos de ensamblaje. Mantenga siempre muestras de histonas en hielo. Si los nucleosomas se almacenan a 4 °C durante demasiado tiempo, pueden desmontar espontáneamente. Asegúrese de verificar cualquier m...

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Divulgaciones

No hay intereses financieros contrapuestos que declarar por ninguno de los autores.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer al Dr. Wesley Wang por sentar las bases para este protocolo y su valiosa tutoría. Este trabajo fue parcialmente apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (Subvenciones R01GM127575 y R01GM121584) y la Fundación Welch (Subvención A-1715).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,5 m Tampón TENANA0,5 m NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8
1 m Tampón TENANA 1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8
100x Tampón TENANA
2 M Tampón TENANA 2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8
20 mM Tampón TENANA20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8
6 M GuHCl6M Cloruro de guanidinio, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8,0
Acetillisina
Tampón de lavado en columnaNANA 6M de urea, 500 mM de NaCl, 20 mM de Tris, 20 mM de imidazol pH 7,8
Tampón de eluciónNA
Fisherbrand  Bomba de transferencia química de caudal variableFischer Scientific15-077-67
His-TEV proteasa
Tampón de lisis de histonasNANA60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0,5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8,0
Resina6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM imidazol, pH 7,8
PCR Clean-Up Kit EpochLife Sicences2360050
tampón de lavado de pelletsNANA 60mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0
petDUET-His-SUMO-TEV-H4
petDUET-His-TEV-H2A
petDUET-His-TEV-H2B
petDUET-His-TEV-H3
pEVOL-AckRSAddgene137976
pGEM-3z/601Addgene26656
Tampón de almacenamientoNANA 20mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% glicerol, pH 7.8
Termociclador
NA Ni-NTA

Referencias

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