Sitio Específico De La Acetilación De Lisina De Histonas Para La Reconstitución De Nucleosomas Utilizando La Expansión Del Código Genético En Escherichia coli

Resumen

Aquí presentamos un método para expresar proteínas de histonas acetiladas utilizando la expansión del código genético y ensamblar nucleosomas reconstituidos in vitro.

Resumen

Las proteínas de histonas acetiladas se pueden expresar fácilmente en Escherichia coli codificando un mutante, N^ε-acetil-lisina (AcK)-específica methanosarcina mazi pirrolysine tRNA-sintetasa (MmAcKRS1) y su ARNt cognado (tRNA^Pyl)para ensamblar mononucleosomas reconstituidos con histonas acetiladas específicas del sitio. MmAcKRS1 y tRNA^Pyl entregan AcK en un sitio de mutación ámbar en el ARNm de elección durante la traducción en Escherichia coli. Esta técnica se ha utilizado extensivamente para incorporar AcK en los sitios de la lisina H3. La pirrolysyl-tRNA sintetasa (PylRS) se puede también evolucionar fácilmente para incorporar otros aminoácidos noncanonical (ncAAs) para la modificación o la funcionalización específica de la proteína del sitio. Aquí detallamos un método para incorporar AcK utilizando el sistema MmAcKRS1 en la histona H3 e integrar proteínas H3 acetiladas en mononucleosomas reconstituidos. Los mononucleosomas reconstitudos acetilados se pueden utilizar en análisis bioquímicos y obligatorios, determinación de la estructura, y más. La obtención de mononucleosomas modificados es crucial para diseñar experimentos relacionados con el descubrimiento de nuevas interacciones y la comprensión de la epigenética.

Introducción

Hemos utilizado PylRS y tRNA^Pyl para sintetizar y ensamblar mononucleosomas reconstituidos con histonas acetiladas específicas del sitio. PylRS ha demostrado ser invaluable como una herramienta de expansión de código genético para producir proteínas con modificaciones postraduccionales (PTMs) y ha sido genéticamente evolucionado para incorporar alrededor de 200 ncAAs diferentes. PylRS incorpora en un codón de parada ámbar, eliminando la competencia de otros aminoácidos durante la traducción. PylRS fue descubierto por primera vez en arqueas metanógenas, y desde entonces se ha utilizado en biología química para incorporar nuevos grupos químicos reactivos en l....

Protocolo

1. Construcción del plásmido

1. Comience por decidir qué proteína histona será acetilada y en qué sitio de lisina. Mutar el sitio al codón de parada ámbar (TAG) usando mutagénesis dirigida por el sitio.
   NOTA: Hay cuatro plásmidos previamente diseñados utilizados para la expresión de proteínas histonas. Las cuatro proteínas de histonas se clonaron en el vector pETDuet-1 con una etiqueta de histidina N-terminal. La histona H4 también incluye una etiqueta SUMO, el origen de la replicación colE1 con un número de copia de aproximadamente 40, resistente a la ampicilina, y un promotor T7.
   1. Diseñe cebadores delanteros e inversos que contengan una mut....

Resultados

Los dímeros, tetrámeros y octómeros se pueden evaluar ejecutando un gel 12% SDS PAGE (Figura 1 y Figura 2). Aquí se puede ver que algunos de los tetrámeros acetilados tienen un rendimiento menor que otros (Figura 1). De hecho, cuanto más cerca de la región central, menor es el rendimiento observado. Esto es más probable debido a la acetilación que interfiere con el montaje del tetrámero cuanto más se.......

Discusión

Es esencial seguir este protocolo en cada detalle durante un experimento. Los nucleosomas no son muy estables y se ha dedicado mucho ensayo y error a la determinación de este protocolo. Es clave eliminar los precipitados en cada paso (o siempre que se observen) porque las partículas pueden interferir fácilmente con los procesos de ensamblaje. Mantenga siempre muestras de histonas en hielo. Si los nucleosomas se almacenan a 4 °C durante demasiado tiempo, pueden desmontar espontáneamente. Asegúrese de verificar cualquier m.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,5 m Tampón TE	NA	NA	0,5 m NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8
1 m Tampón TE	NA		NA 1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8
100x Tampón TE	NA	NA
2 M Tampón TE	NA		NA 2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8
20 mM Tampón TE	NA	NA	20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8
6 M GuHCl			6M Cloruro de guanidinio, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8,0
Acetillisina
Tampón de lavado en columna	NA	NA 6	M de urea, 500 mM de NaCl, 20 mM de Tris, 20 mM de imidazol pH 7,8
Tampón de elución	NA
Fisherbrand  Bomba de transferencia química de caudal variable	Fischer Scientific	15-077-67
His-TEV proteasa
Tampón de lisis de histonas	NA	NA	60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0,5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8,0
Resina			6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM imidazol, pH 7,8
PCR Clean-Up Kit Epoch	Life Sicences	2360050
tampón de lavado de pellets	NA	NA 60	mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0
petDUET-His-SUMO-TEV-H4
petDUET-His-TEV-H2A
petDUET-His-TEV-H2B
petDUET-His-TEV-H3
pEVOL-AckRS	Addgene	137976
pGEM-3z/601	Addgene	26656
Tampón de almacenamiento	NA	NA 20	mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% glicerol, pH 7.8
Termociclador

NA Ni-NTA