Uso del sistema GAL4-UAS para genética funcional en Anopheles gambiae

Resumen

El sistema bipartito GAL4-UAS es una herramienta versátil para la modificación de la expresión génica de forma espaciotemporal controlada que permite el análisis genético funcional en Anopheles gambiae. Los procedimientos descritos para el uso de este sistema son una estrategia de clonación semi-estandarizada, sexado y cribado de pupas para marcadores de proteínas fluorescentes y fijación embrionaria.

Resumen

El sistema bipartito GAL4-UAS es una herramienta versátil y potente para el análisis genético funcional. La esencia del sistema es cruzar líneas transgénicas "conductoras" que expresan el factor de transcripción de levadura GAL4 de una manera específica del tejido, con líneas transgénicas "respondedoras" que llevan una construcción candidata de interferencia de gen / ARN cuya expresión está controlada por secuencias de activación ascendentes (UAS) que se unen a GAL4. En la progenie subsiguiente, el gen o la construcción silenciadora se expresa de una manera espaciotemporal prescrita, lo que permite ensayar los fenotipos resultantes e inferir la función génica. El sistema binario permite flexibilidad en los enfoques experimentales para detectar fenotipos generados por la expresión transgénica en múltiples patrones específicos de tejidos, incluso si se inducen costos severos de aptitud física. Hemos adaptado este sistema para Anopheles gambiae, el principal vector de malaria en África.

En este artículo, proporcionamos algunos de los procedimientos comunes utilizados durante el análisis GAL4-UAS. Describimos las líneas GAL4-UAS de An. gambiae ya generadas, así como la clonación de nuevas construcciones de respuesta para la regulación ascendente y el derribo de ARNi. Especificamos una guía paso a paso para el sexado de pupas de mosquitos para establecer cruces genéticos, que también incluye la detección de la progenie para seguir la herencia de marcadores genéticos fluorescentes que etiquetan las inserciones del conductor y del respondedor. También presentamos un protocolo para la limpieza de embriones de An. gambiae para estudiar el desarrollo embrionario. Finalmente, introducimos posibles adaptaciones del método para generar líneas conductoras a través de la inserción CRISPR/Cas9 de GAL4 aguas abajo de los genes diana.

Introducción

El sistema bipartito GAL4-UAS es el caballo de batalla de la caracterización funcional de genes en el organismo modelo de insectos Drosophila melanogaster1,2,3. Para utilizar el sistema GAL4-UAS, las líneas conductoras transgénicas, que expresan el factor de transcripción de levadura GAL4 bajo control de una secuencia reguladora, se cruzan con líneas de respuesta que llevan un gen de interés o construcción de interferencia de ARN (RNAi) controlada por una secuencia de activación ascendente (UAS) reconocida por GAL4. La progenie de este cruce expresa el transgén de in....

Protocolo

1. Diseño y construcción de construcciones de UAS

1. Diseño y montaje de vectores para la expresión génica candidata
   1. Determinar la secuencia que se utilizará para la regulación ascendente de genes candidatos.
      1. Secuenciar el ADNc/ADNc a partir de la cepa de interés y compararlo con la secuencia publicada para verificar su identidad e identificar posibles SNP y sitios de restricción para la digestión diagnóstica.
      2. Asegúrese de que el cebador delantero utilizado para la amplificación de genes cubra la secuencia nativa de Kozak y el codón de inicio, cuando corresponda. Una imprimación con ~ 10 pb de unió....

Resultados

La expresión 3xP3 de eYFP, dsRed y eCFP proporciona una identificación confiable y fácilmente distinguible de individuos que poseen los genes marcadores que producen expresión en los ojos y los ganglios ventrales de las pupas de An. gambiae (Figura 3). La morfología diferencial observada en los genitales externos masculinos y femeninos utilizados para el sexado y un ejemplo de pupas no identificables se destacan en la Figura 4. La eliminación d.......

Discusión

Comprender la función genética de los mosquitos es vital para desarrollar nuevos enfoques para controlar Anopheles e impactar la transmisión de la malaria. El sistema GAL4-UAS descrito es un sistema versátil y potente para el análisis funcional de genes candidatos y hasta la fecha hemos utilizado el sistema para examinar las bases genéticas de la resistencia a ^{insecticidas17} y la producción de hidrocarburos ^{cuticulares15,23}, así c.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placa de Petri de plástico de 100 x 15 mm	SLS	2175546	Paquete de 10
1000 y micro; L Pipeta Gilson	Gilson	F144059P
20/25 mL Tubos Universales	Starlab	E1412-3020	Pack de 400
Pipetas Pasteur de 3 mL	SLS	G612398	Greiner Pipeta Pasteur 3 mL estéril envuelta individualmente
50 mL Tubos Falcon	Fisher Scientific	11512303
Etanol absoluto	Fisher Scientific	BP2818-500	500 mL
Ácido Acético	SLS	45726-1L-F	Jaulas de 1 L
	SLS	E6099	30x30x30 con puerto de pantalla
Pinceles finos	Amazon	UKDPB66	KOLAMOON Juego de pinceles de pintura de detalle de 9 piezas Pinceles de minitura para acuarela, pintura acrílica, pintura al óleo (rojo vino)
Comida para peces	Amazon		Tetra Min Fish Food, alimento completo para todos los peces tropicales para la salud, el color y la vitalidad, 10 l
Solución de formaldehído	Sigma Aldrich	F8775
Aspirador bucal	John Hock	612
Sal de estanque	Amazon		Blagdon Guardian Pond Tonic Salt, para la salud de los peces, calidad del agua, tónico general, tampón de pH, 9,08 kg, trata 9.092 L
Macetas de pupas	Cater4you	SP8OZ	250 macetas con tapa Cubos
de plástico pequeños Amazon			2.5 L Cubo de plástico blanco completo con tapa blanca (paquete de 10)
Hipoclorito de sodio	Fisher Scientific	S25552