Evaluación de la dispersión de biopelículas en heridas murinas

Resumen

Aquí, se describen métodos ex vivo e in vivo para evaluar la dispersión bacteriana de una infección de la herida en ratones. Este protocolo se puede utilizar para probar la eficacia de las terapias antimicrobianas y anti-biofilm tópicas, o para evaluar la capacidad de dispersión de diferentes cepas o especies bacterianas.

Resumen

Las infecciones relacionadas con el biofilm están implicadas en una amplia gama de condiciones crónicas como úlceras del pie diabético no curativas, sinusitis crónica, otitis media recurrente y muchas más. Las células microbianas dentro de estas infecciones están protegidas por una sustancia polimérica extracelular (EPS), que puede evitar que los antibióticos y las células inmunes del huésped despejen la infección. Para superar este obstáculo, los investigadores han comenzado a desarrollar agentes de dispersión como terapia potencial. Estos agentes se dirigen a varios componentes dentro de la EPS de biopelícula, debilitando la estructura e iniciando la dispersión de las bacterias, lo que teóricamente puede mejorar la potencia de los antibióticos y el aclaramiento inmunológico. Para determinar la eficacia de los agentes de dispersión para las infecciones de heridas, hemos desarrollado protocolos que miden la dispersión de biopelículas tanto ex vivo como in vivo. Utilizamos un modelo quirúrgico de la supresión del ratón que se ha descrito bien para crear infecciones crónicas biofilm-asociadas de la herida. Para monitorizar la dispersión in vivo,infectamos las heridas con cepas bacterianas que expresan luciferasa. Una vez establecidas las infecciones maduras, regamos las heridas con una solución que contiene enzimas que degradan los componentes del biofilm EPS. A continuación, supervisamos la ubicación y la intensidad de la señal luminiscente en los órganos de la herida y filtrado para proporcionar información sobre el nivel de dispersión alcanzado. Para el análisis ex vivo de la dispersión de biopelículas, el tejido de la herida infectada se sumerge en una solución enzimática que degrada la biopelícula, después de lo cual se evalúa la carga bacteriana restante en el tejido, frente a la carga bacteriana en solución. Ambos protocolos tienen fortalezas y debilidades y se pueden optimizar para ayudar a determinar con precisión la eficacia de los tratamientos de dispersión.

Introducción

El aumento de la resistencia a los antibióticos en todo el mundo está llevando a la falta de opciones de antibióticos para tratar una variedad de infecciones bacterianas¹. Además de la resistencia a los antibióticos, las bacterias pueden ganar tolerancia a los antibióticos mediante la adopción de un estilo de vida asociado a la^{biopelícula 2}. Una biopelícula es una comunidad de microorganismos que están protegidos por una matriz de polisacáridos, ADN extracelular, lípidos y proteínas^3,denominada colectivamente sustancia polimérica extracelular (EPS). A medida que continúa la crisis de resistencia a....

Protocolo

Este protocolo animal fue revisado y aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad Texas Tech (número de protocolo 07044). Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud.

1. Preparación de bacterias para infecciones de ratón

NOTA: Aquí describimos la infección de ratones sólo con Pseudomonas aeruginosa. Sin embargo, otras especies bacterianas se pueden utilizar para causar la infección. Las cepas y materiales....

Resultados

En este experimento, 8-10 ratones suizos suizos hembra de la semana de edad Webster fueron infectados con^{10 4} UFC de PAO1 que lleva el plásmido de luminiscencia pQF50-lux. Según lo descrito arriba, una infección fue permitida establecer para 48 h antes de administrar 3 x 30 tratamientos mínimos de PBS (control del vehículo) o del 10% GH (tratamiento) para digerir el biofilm EPS. Los ratones fueron fototratado pretratamiento, directamente después del tratamiento (0 h) y en 10 h y 20 h post-tratamiento.

Discusión

Aquí se describen los protocolos que se pueden utilizar para estudiar la eficacia de los agentes de dispersión de biopelículas. Estos protocolos se pueden adaptar fácilmente para su uso con diferentes tipos de agentes de dispersión, especies bacterianas o muestras ex vivo, incluidas las muestras de desbridamiento clínico. Este protocolo también proporciona un modelo clínicamente relevante para recolectar y estudiar células bacterianas dispersas. Se ha demostrado que los fenotipos de las células bacterianas dispe.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL	Fisher	14823434	Úselo para completar diluciones en serie de muestras
25G 58 en aguja	Fisher		14823434 Se conecta a una jeringa de 1 mL
Ampicilina Sal de sodio	Fisher	BP1760-5	Haga una solución madre de 50 mg / mL y agregue 100 µ L a 10 mL de caldo LB para tanto durante la noche como en el subcultivo
Amylase	MP Biomedicals 2100447		Prepare una solución al 5% p/v, vórtice- se pueden usar otros agentes de dispersión
Buprenorfina SR-LAB 5 mL (1 mg/mL)	ZooPharm	RX216118	Uso como analgésico- puede usar otras opciones
Cellulase	MP Biomedicals	2150583	Agregue 5% p/v a la solución de amilasa al 5% p/v, vórtice, active a 37 & deg; C durante 30 min- se pueden usar otros agentes de dispersión
Crema depilatoria	Walmart	287746	Use una pequeña cantidad para masajear los folículos pilosos en la espalda del animal y asigne 10 minutos para eliminar el vello
Pinzas de vendaje, puntas dentadas	Fisher	12-460-536	Puede usar otras formas de fórceps
Matraces Erlenmeyer deflectores 125	mL Fisher	101406	Úselo para cultivar durante las noches y subcultivos de bacterias
FastPrep-24 Homogeneizador de sobremesa	MP Biomedicals	6VFV9	Utilice 5 m/s durante 60 s dos veces para homogeneizar el tejido
Fatal Plus	Vortech Pharmaceuticals	0298-9373-68	Inyecte 0,2 mL intraperitaneal por cada ratón
Tubos homogeneizadores (Bead Tube, 2 mL, 2,4 mm Metal)	Fisher	15340151	Se utiliza para homogeneizar muestras para el recubrimiento
Isoflurano	Diamond Back Drugs
Solución de clorhidrato de ketamina/clorhidrato de xilacina C-IIIN	Sigma Aldrich	K4138	Uso como anasetia: también se pueden utilizar otras opciones para obtener un campo quirúrgico de caldo LB de anasetia
, Miller	Fisher	BP1426-2	Agregar 25 g / L y autoclave
Lidocaína 2%	Inyectable Diamond Back Drugs	2468	Inyecte 0,05 mL a través del costado del área del lecho de la herida marcada para que se deposite en el centro de la marca. Asignar 10 min antes del corte
Meropenem	Sigma Aldrich	PHR1772-500MG	Preparar 5 mg/mL para añadir a la solución de GH para aplicar tópicamente y una solución de 15 mg/mL para inyectar intraperitaneal 4 h antes y 6 h después del tratamiento
Esponjas de gasa de algodón no estériles	Fisher	13-761-52	Usar para retirar la crema depilatoria
PAO1 pQF50-lux cepa bacteriana	Ref [13]	N/A	Se utilizó PAO1 pgF50-lux como la cepa de P. aeruginosa de interés en los resultados representativos de este trabajo
Placas de Petri	Fisher	PHR1772-500MG
Tampón de fosfato solución salina 10x	Fisher	BP3991	Diluir de 10 a 1 veces antes de usar
Apósito de poliuretano	Mckesson	66024007	Corta el borde redondeado y corta el cuadrado restante en 4 secciones iguales
Pseudomonas agar aislante	VWR	90004-394	Añada 20 mL/L de glicerol y 45 g/mL al agua, autoclave, y vierta 20 mL en placas de Petri
Refresh P.M.			Úselo en los ojos para reducir la sequedad durante el procedimiento.
Almohadillas estériles de preparación con alcohol	Fisher	22-363-750	Úselo para limpiar la piel inmediatamente antes de herir para desinfectar el área
Tijeras rectas delicadas	Fisher	89515	También puede usar tijeras curvas
Ratones Swiss Webster	Charles River	551NCISWWEB	Se pueden usar otras cepas de ratones
Punta deslizante de jeringa 1	mL Fisher	14823434	Se utiliza para administrar medicamentos y Tratamiento enzimático

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