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Artículo de método

Un modelo de rata Sprague Dawley de osteosarcoma ortotópico singénico con amputación para controlar la tasa de metástasis

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DOI:

10.3791/62139

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3 de mayo de 2021

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1Department of Molecular and Comparative Pathobiology, The Johns Hopkins University School of Medicine, 2Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, Johns Hopkins University, 3Department of Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Coloproctological Surgery, Juntendo University Faculty of Medicine, 5Program for Comparative Medicine, Gene Therapy Program, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 6Tuskegee College of Veterinary Medicine, 7Department of Human Pathology, Juntendo University Faculty of Medicine, 8Department of Surgery, Juntendo University Shizuoka Hospital, Juntendo University School of Medicine, 9Department of Urology, The Johns Hopkins School of Medicine, 10Department of Gastroenterology and Minimally Invasive Surgery, Juntendo University Faculty of Medicine

En este artículo

Resumen

Aquí, se describe un implante ortotópico singénico seguido de un procedimiento de amputación del osteosarcoma con metástasis pulmonar espontánea que se puede utilizar para la investigación preclínica de la biología de la metástasis y el desarrollo de nuevas terapias.

Resumen

El avance más reciente en el tratamiento del osteosarcoma (SG) ocurrió en la década de 1980, cuando se demostró que la quimioterapia multiagente mejora la supervivencia general en comparación con la cirugía sola. Para abordar este problema, el objetivo del estudio es refinar un modelo menos conocido de SG en ratas con un enfoque quirúrgico histológico, de imágenes, biológico, de implantación y amputación integral que prolongue la supervivencia. Utilizamos un modelo de rata singénica inmunocompetente y desanguínea de Sprague-Dawley (SD) con línea celular de SG UMR106 implantada (originada en una rata SD) con implantes de tumores tibiales ortotópicos en ratas macho y hembra de 3 semanas de edad para modelar la SG pediátrica. Encontramos que las ratas desarrollan tumores pulmonares primarios y metastásicos reproducibles, y que las amputaciones de extremidades a las 3 semanas después de la implantación reducen significativamente la incidencia de metástasis pulmonares y previenen muertes inesperadas. Histológicamente, los SG primarios y metastásicos en ratas fueron muy similares a los OS humanos. Utilizando métodos de inmunohistoquímica, el estudio muestra que los SG de rata están infiltrados con macrófagos y células T. Un estudio de expresión de proteínas de las células de la SG revela que estos tumores expresan quinasas de la familia ErbB. Dado que estas quinasas también están altamente expresadas en la mayoría de los SG humanos, este modelo de rata podría usarse para probar los inhibidores de la vía ErbB para la terapia.

Introducción

El osteosarcoma (SG) es el tumor óseo primario más común en niños, adolescentes y adultos jóvenes. El avance más reciente en el tratamiento de la SG ocurrió en la década de 1980 cuando se demostró que la quimioterapia multiagente mejora la supervivencia general en comparación con la cirugía sola1. La SG se desarrolla durante el crecimiento óseo rápido, que generalmente ocurre en huesos tubulares largos como el fémur, la tibia y el húmero. Se caracterizan por una apariencia osteolítica, osteoblástica o mixta con notable reacción perióstica2. La quimioterapia y la resección quirúrgica pueden mejorar el resultado para los pacientes con una supervivencia a 5 años para el 65% de los pacientes2,3. Desafortunadamente, los pacientes con SG de alto grado con enfermedad metastásica tienen una supervivencia del 20%. La SG invade regionalmente y hace metástasis principalmente a los pulmones u otros huesos y es más frecuente en los hombres. La necesidad más apremiante para estos pacientes jóvenes es una terapia novedosa que prevenga y elimine la viabilidad de las metástasis a distancia.

Se han revisado modelos preclínicos de SG4,5,6,7 y se han desarrollado pocos modelos inmunocompetentes disponibles que utilizan la amputación de SG ortotópica. En el año 2000, se desarrolló un modelo importante utilizando ratones BALB/c con SG singénica ortotópica y amputación8. En comparación con este modelo de ratón, el modelo de rata se basa en animales genéticamente desanguíneos y 10 veces más grandes, lo que lleva a algunas ventajas. El modelo UMR106 de rata se desarrolló a partir de una SG inducida por 32P en una rata Sprague Dawley (SD), que se derivó en una línea celular9. En 2001, la implantación ortotópica de UMR106-01 se describió por primera vez en tibias implantadas de ratones atímicos con desarrollo rápido y consistente de tumores primarios y características radiológicas e histológicas en común con la SG en humanos. Las metástasis pulmonares se desarrollaron y dependieron de la colocación ortotópica de UMR106 en el microambiente óseo10. En 2009, Yu et al.11 establecieron un modelo de rata ortotópica de rata OS ortotópica reproducible utilizando células UMR106 en ratas SD macho más grandes. Los implantes tumorales exitosos y la tasa de metástasis pulmonar en ratas sin amputación fueron similares a los datos presentados aquí. En este estudio, se realizó una amputación adicional al modelo utilizando ratas jóvenes, lo que sugirió que el momento de la extirpación del tumor primario es crucial en el modelado de la SG, especialmente en relación con la progresión metastásica. Con este refinamiento, la amputación y las imágenes in vivo mejoran este modelo para estudios preclínicos para la evaluación de nuevos fármacos para la SG.

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Protocolo

Todos los procedimientos y experimentos con ratas se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de Johns Hopkins.

1. El protocolo de cultivo celular UMR-106 de la línea celular SD rata OS

  1. Células de cultivo en DMEM, suplementadas con 10% (v/v) FBS, penicilina (10 U/mL)-estreptomicina (10 U/mL) a 37 °C en atmósfera humidificada de 5% de CO2. Realizar experimentos utilizando células con pasajes de 2-812.

2. Protocolo de inyección intratibial de células de LA SG

NOTA: Las ratas SD preñadas apareadas en el tiempo dan a luz en el animal y a las 3 semanas de edad, se utilizan camadas (dado que la línea celular UMR 106 es singénica a las ratas SD, no se necesita irradiación).

  1. Inducción
    1. Coloque la rata en una cámara de inducción de tamaño mediano e induzca la anestesia con isoflurano al 2%-3%. Monitoree al animal continuamente para determinar la profundidad de la anestesia por reflejo a pellizco del dedo del pie, frecuencia respiratoria y carácter.
    2. Inserte la nariz en la nosecone. Asegure con cinta adhesiva, si es necesario.
    3. Retire el vello de la pierna derecha hasta el abdomen ventral y dorsal inferior con cortapelos o use agente depilatorio. Coloque la rata en posición supina.
    4. Frote el área quirúrgica asépticamente con etanol al 70% y diluya el acetato de clorhexidina o la betadina diluida. Comience alrededor del área de la rodilla y frote en un movimiento circular tanto proximal como distalmente. Repita este paso tres veces. No se utiliza ninguna cortina para la implantación de tumores.
    5. Aplique lubricante para los ojos en ambos ojos de la rata para evitar la desecación corneal causada por la anestesia. Coloque la rata en una almohadilla térmica de ajuste a fuego lento. Asegúrese de que la rata tenga una temperatura corporal normal (37 °C) y una frecuencia respiratoria normal.
  2. Cirugía
    1. Encienda el isoflurano a ~ 1.5% -2% (para mantenimiento). Asegúrese de que el animal esté en un plano adecuado de anestesia a través de la falta de un reflejo de pellizco en el dedo del pie. De lo contrario, aumente el porcentaje de isoflurano al 2,5%.
    2. Marque una aguja estéril (aproximadamente 22 G) a 10 mm de la punta para guiar la profundidad a insertar.
    3. Inserte la aguja 10 mm hacia abajo en la diáfisis de la tibia entrando en la rodilla doblada en el medio de la meseta tibial, extendiendo la aguja a través de la metáfisis hacia la diáfisis utilizando un movimiento ligero similar a un taladro para hacer una abertura. Retire la aguja.
    4. Cargue la suspensión celular en la jeringa Hamilton directamente antes de la inyección en la tibia. Para hacer esto, mezcle suavemente las células antes de extraerlas en la jeringa, ya que la gravedad hace que las células se asienten en el fondo del tubo.
      NOTA: Las células se pueden almacenar en un tubo de 1,5 a 2 ml (a temperatura ambiente) antes de extraerlas en la jeringa Hamilton (100 μL) después de una mezcla cuidadosa. Las células se pueden mantener a temperatura ambiente durante 2-3 h durante el procedimiento de implantación. Compruebe siempre la viabilidad celular de las células en el tubo antes y después de la sesión de implantación. La exclusión del azul de tripano es el método más fácil para la evaluación de la viabilidad celular.
    5. Una vez que el hueso se atraviesa con la primera aguja, inserte una segunda aguja (aguja de diámetro más pequeño también marcada en 10 mm) unida a la jeringa Hamilton de 100 μL cargada con células. Asegúrese de insertar la aguja hasta la marca de 10 mm en el mismo orificio que se extiende hacia la diáfisis.
    6. Descargue suavemente 20 μL de suspensión de 75,000 células de SG en PBS en la diáfisis y la cavidad de la médula.
      NOTA: La aguja no debe tambalearse en el hueso y debe sentirse segura. Si la aguja se mueve fácilmente, la corteza puede haber sido atravesada en la diáfisis. Repita la inserción nuevamente para obtener una colocación más firme antes de la inyección de células.
    7. Retire la aguja de Hamilton del hueso.
      NOTA: Si se forma una pequeña gota de sangre, aplique una ligera presión. Si se forma una gota de líquido transparente en el sitio de la punción, es posible que la aguja no se haya extendido lo suficiente en el hueso y que la suspensión de células tumorales se haya filtrado a través del orificio. Registre esto en las notas, pero en general, la implantación del tumor será exitosa. Con experiencia, el procedimiento de implantación del tumor debe tomar 5 minutos por rata. Con la experiencia, la implantación tumoral de células en el hueso será más fácil. La inyección accidental de células en el músculo alrededor del hueso, puede no conducir al microambiente tumoral necesario para la metástasis pulmonar.
  3. Recuperación
    1. Asegúrese de que la rata sea normotérmica. Coloque a la rata en una jaula con una almohadilla térmica colocada debajo de la jaula para su recuperación.
    2. Después de estar completamente despierto, móvil y respirar bien, inyecte a las ratas con buprenorfina (1.0-1.2 mg / kg SC).
      NOTA: Para obtener acceso a la buprenorfina, consulte con la institución para ver las opciones de aprobación a través del personal veterinario para realizar el pedido.
    3. Mueva a las ratas de regreso a jaulas limpias y monitoree una vez al día, cada semana.

3. Medición y monitoreo

  1. Mida el tamaño del tumor 9-10 días después de la implantación y luego cada 2 días hasta 3 semanas después de la implantación para establecer una tasa de crecimiento. Mide el diámetro máximo de la tibia con una pinza electrónica o manual. Almacene los datos en una hoja de cálculo con una fórmula para calcular el volumen del tumor. Mida la tibia contralateral (no implantada) como línea de base.
    NOTA: Los diámetros de las extremidades posteriores implantadas se utilizan como sustituto del tamaño del tumor. Las extremidades posteriores se miden perpendicularmente al eje largo de la tibia en el diámetro más grande para dos mediciones, ventral / dorsal y media / lateral en la extremidad. El volumen tumoral estimado se calcula mediante la fórmula11:Volumen tumoral (mm3) = diámetro mayor (mm) x diámetro más pequeño (mm)2/2.
  2. Considere las ratas para la amputación de supervivencia o el tratamiento de quimioterapia cuando los tumores se acercan a 15 mm en la dimensión más grande o 3 semanas después de la implantación del tumor. La extremidad contralateral mide alrededor de 7-9 mm en la mayoría de las ratas a esta edad.

4. Administración intravenosa de doxorrubicina

  1. Anestesiar a las ratas con 2% de isoflurano. Preparar la piel sobre la vena yugular con tres lavados quirúrgicos con betadina y alcohol como se describe13.
  2. Bajo una disección cuidadosa, visualice la vena yugular derecha o izquierda. Inserte la aguja en el músculo suprayacente y luego diríjase hacia la cabeza de la rata en la luz de la vena yugular a medida que se visualiza en la vena yugular anterior al músculo pectoral.
    1. Cuando se inserte la aguja en la vena yugular, extraiga suavemente sangre en la jeringa para garantizar la inserción adecuada. Es posible creer que la aguja está a través de la vena, pero la aguja está debajo de la vena y no en la luz. Si la vena yugular se vuelve demasiado pequeña para las inyecciones cuando se disecciona con romo para exponer la vena yugular, use la otra vena yugular para la inyección.
  3. Inyecte doxorrubicina (2 mg/kg) lentamente durante 1 min en un volumen de 100-150 μL. La solución se puede visualizar por vía intravenosa en la vena yugular durante el parto.
  4. Inyectar volúmenes similares de solución salina normal en ratas de control.
  5. Retire la aguja y aplique una presión suave sobre la vena con una gasa estéril.
  6. Cierre la incisión en la piel con 3-4 clips de herida. Retire los clips a los 7-10 días después de la inyección.
    NOTA: Las ratas generalmente no intentan quitar los clips de metal, pero muerden y eliminan las suturas. El método de inyección yugular es preferible a las inyecciones de la vena de la cola para la doxorrubicina, ya que cualquier medicamento que se filtra fuera del vaso causa necrosis de la cola que puede requerir la amputación de la cola.

5. Protocolo de amputación de extremidades posteriores

  1. Inducción
    1. Coloque la rata en una cámara de inducción de tamaño mediano e induzca anestesia con isoflurano al 2% -4%. Monitoree a la rata continuamente para determinar la profundidad de la anestesia.
      NOTA: La cámara de inducción se recoge en un recipiente de carbón y cualquier otro gas se elimina mediante una mesa de tiro hacia abajo utilizada para la cirugía.
    2. Inserte la nariz en una nosecone. Asegure con cinta adhesiva, si es necesario.
      NOTA: Este procedimiento se realiza en una tabla de borrador descendente para eliminar el exceso de gases volátiles (es decir, isoflurano).
    3. Retire el vello de la pierna derecha hasta el abdomen ventral y dorsal inferior con cortapelos o use agente depilatorio. Coloque la rata en posición supina.
    4. Frote el área quirúrgica asépticamente con etanol al 70% y diluya el acetato de clorhexidina o la betadina diluida. Prepare la piel para la cirugía desde la mitad de la pantorrilla hasta el área de la piel justo por encima de la articulación de la cadera de la parte inferior derecha del abdomen. Frote la pierna proximal y el área distal circunferencialmente. Repita este paso tres veces.
    5. Aplique el lubricante para los ojos en ambos ojos de la rata. Asegúrese de que la rata tenga una temperatura corporal normal (37 ° C) y signos vitales normales. Controle y regule la temperatura corporal utilizando una almohadilla térmica que está conectada a un monitor de sonda de temperatura rectal.
  2. Cirugía
    1. Encienda el isoflurano al 1,5%-3% (mantenimiento). Monitoree la profundidad anestésica, incluida la reacción al pellizco del dedo del pie, la frecuencia respiratoria y el carácter. Ajuste la velocidad de isoflurano según sea necesario para mantener un plano apropiado de anestesia.
      NOTA: La frecuencia respiratoria bajo anestesia debe estar entre 50-100 respiraciones por minuto. Las respiraciones profundas e infrecuentes son una indicación de que la rata está demasiado anestesiada.
    2. Abra los paquetes de instrumentos estériles y las cortinas y póngase guantes estériles. Tenga cuidado de mantener la esterilidad durante la duración del procedimiento. Los instrumentos quirúrgicos estériles básicos necesarios incluyen, soporte de cuchilla de bisturí, fórceps, hemostáticos, soporte de agujas, tijeras y aplicador de clip para heridas.
    3. Tire de la pata de la rata a través del respiradero de la cortina quirúrgica estéril. Asegúrese de que el animal esté en un plano adecuado de anestesia a través del reflejo de pellizco del dedo del pie.
    4. Usando una cuchilla de bisturí o tijeras quirúrgicas, haga una incisión cutánea circunferencial justo proximal a la asfixia (articulación de la rodilla).
    5. Desenganche la extremidad posterior usando una gasa o disección roma para exponer la arteria femoral y la vena en la superficie ventral-medial de la extremidad posterior.
    6. Ligar los vasos usando suturas absorbibles 4-0 a nivel del fémur medio y transecto distalmente.
    7. Sujete la vena distalmente para reducir las fugas durante la disección muscular.
      NOTA: La musculatura circunferencial se transectará distal al nivel de ligadura de los vasos de la arteria femoral y los músculos elevados desde el fémur hasta el nivel de la articulación coxofemoral.
    8. Usando disección contundente, abducir la articulación de la cadera con rotación lateral hacia afuera.
    9. Encuentra la cabeza del fémur y desarticula del acetábulo. Corte cualquier tejido restante manteniendo la pierna unida al cuerpo.
    10. Dé un bloqueo de salpicaduras al acetábulo y al nervio ciático con aproximadamente 6 mg/kg de ropivacaína.
    11. Cierre la musculatura sobre el acetábulo con una sutura simple interrumpida (4-0, sutura absorbible).
      NOTA: Se puede inyectar bupivacaína o lidocaína al 0,5% adicional (0,15-0,2 mg en total) en varios sitios a lo largo de la capa muscular cerrada (infiltración local / bloqueo de salpicaduras).
    12. Oponer y cerrar los bordes de la piel con clips de herida colocados cada 5-10 mm.
  3. Recuperación
    1. Coloque a la rata en una jaula de recuperación limpia con soporte térmico usando una almohadilla térmica colocada debajo de la jaula.
      NOTA: Para prevenir la hipertermia, la almohadilla térmica no debe estar en contacto directo con el animal y no debe exceder los 40 °C.
    2. Monitoree al animal hasta que se recupere completamente y sea normotérmico (37.5-39 ° C).
      NOTA: El animal no debe dejarse desatendido hasta que esté completamente consciente y severamente recostado y moviéndose fácilmente alrededor de la jaula.
    3. Después de estar completamente despierto, móvil y respirar bien, inyecte a las ratas con buprenorfina (1.0-1.2 mg / kg SC).
      NOTA: La administración de buprenorfina en una rata anestesiada puede afectar la recuperación.
    4. Administrar 10 ml de solución de Ringer lactada caliente por vía subcutánea entre los omóplatos.
    5. Mueva a las ratas de regreso a la jaula limpia y reúnase con congéneres.
    6. Monitoree a todos los animales dos veces al día durante el próximo mes para detectar signos de dolor y angustia, incluyendo piloerección, postura encorvada o inapetencia o signos de infección en el sitio de la incisión, incluyendo eritema, secreción purulenta o dehiscencia de la herida.
      NOTA: Hasta la fecha no hemos observado signos clínicos (como infecciones) después de la recuperación postoperatoria en ninguno de los animales. Solo una rata tenía una dehiscencia con suturas, después de lo cual se usaron clips de heridas para cerrar heridas sin más problemas.
    7. Administrar buprenorfina o meloxicam a animales que presenten signos clínicos de dolor a dosis publicadas en consulta con un veterinario de animales de laboratorio.
    8. Administrar antibióticos (es decir, cefalosporina) a animales que presenten signos clínicos de dolor a dosis publicadas en consulta con un veterinario de animales de laboratorio.
      NOTA: Cualquier animal que muestre signos prolongados de dolor o angustia que no mejoren con analgésicos o animales que muestren signos de infección que no respondan a los antibióticos deben ser sacrificados humanamente.

6. Imágenes con rayos X

  1. Después de la implantación del tumor, tome imágenes de las tibias y los pulmones de forma no invasiva para detectar el crecimiento del tumor mediante rayos X con una máquina diseñada para roedores.
  2. Anestesiar a las ratas como se hizo anteriormente.
  3. Tome imágenes a un aumento de 3x durante 6 s a 25 kV.
  4. Procese la película utilizando el procesador de rayos X. Las radiografías también se pueden escanear digitalmente.

7. Procedimiento de necropsia

  1. Sacrificar a las ratas con CO2. Confirme la muerte por falta de latidos cardíacos e inmediatamente extraiga 3 ml de sangre del corazón para muestras de suero o plasma.
  2. Abra el tórax y el abdomen para su examen.
  3. Aislar la tráquea y cannularse con un catéter (18 G). Para asegurar el catéter en la tráquea, ate una sutura de seda alrededor de la tráquea con el catéter.
  4. Conecte el catéter de infusión a una jeringa de 3 o 5 ml. Infundir formalina o solución salina para inflar suavemente los lóbulos pulmonares para obtener mejores muestras de histología. En la infusión, los pulmones se hincharán y permitirán una mejor visualización de las metástasis pulmonares.
  5. Examinar, diseccionar y pesar todos los órganos torácicos y abdominales seleccionados (como el hígado, los riñones).
  6. Fije los órganos en formalina para histopatología o congele en hielo seco, 2-metilbutano o nitrógeno líquido.
  7. Para la evaluación de la expresión de proteínas utilizando western blot, haga lisados de tejidos congelados. Se detallan los anticuerpos que reaccionan con los tejidos derata 13.

8. Inmunohistoquímica

  1. Procese el tejido primario del sistema operativo, intégrelo en parafina y seccionarlo para la tinción inmunohistoquímica.
  2. Recuperar el antígeno después de la desparafinización utilizando tampón de citrato (pH 6.0). Incubar en 0,3% H2O2 en metanol durante 30 min para apagar la peroxidasa endógena.
  3. Bloquee las secciones de parafina de 5 μm de espesor con suero normal.
  4. Incubar con anticuerpos primarios anti-CD68 y CD3 (ver tabla) durante la noche a 4 °C.
  5. Enjuague las secciones en PBS e incube en polímero HRP utilizando un kit de detección.
    NOTA: La inmunotinción se desarrolló con diaminobenzidina como cromógeno.

9. Western blotting

  1. Lisar las células UMR-106 en 200-300 μL de tampón de lisis14 para realizar electroforesis en gel estándar y western blotting.
  2. Use de 4% a 12% de geles Bis-Tris.
  3. Incubar en anticuerpos primarios anti-ErbB2, anti-ErbB4, anti-EGFR, anti-ERK, β-actina o anti-ratón β2-AR (ver tabla) y anticuerpo secundario ligado a la peroxidasa de rábano picante.
  4. Añadir el sustrato quimioluminiscente. Exponga las membranas a una película de rayos X.
    NOTA: los niveles de β-actina se utilizan como controles de carga.

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Resultados

Las ratas inmunocompetentes SD de raza se utilizan para estos estudios de SG, que ofrece un modelo animal con un sistema inmunológico intacto. Hemos utilizado la línea celular UMR106 de ATCC, desarrollada a partir de células que inicialmente se aislaron de un sistema operativo de una rata SD. Implantamos las células en ratas SD, proporcionando así un modelo singénico para la SG. Las células UMR106 se implantan en la tibia de ratas SD macho y hembra de 3 semanas de edad, simulando un modelo de SG pediátrica. Además, la im...

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Discusión

Las ratas con implantes tibiales de SG desarrollan tumores medibles a las 3 semanas posteriores a la implantación. Si las extremidades con tumores se amputan 3 semanas después de la implantación, la incidencia de metástasis pulmonar se reduce significativamente. Los SG son tanto osteolíticos como osteoblásticos. Las ratas sin amputación desarrollan metástasis pulmonares que son múltiples y de tamaño variable, observadas por radiografía o en la necropsia a las 7 semanas después de la implantación. EGFR, ErbB2 y ErbB4 se e...

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Divulgaciones

No hay divulgación para declarar.

Agradecimientos

Financiamiento de los NIH a través del Instituto Nacional del Cáncer, subvención # CA228582. Shun Ishiyama está recibiendo actualmente una subvención de Toray Medical Co., Ltd.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
AKT Cell Signaling TECHNOLOGY4685S
sutura absorbibleEthiconJ214H
β-actinaSANTA CRUZ BIOTECHNOLOGYsc-47778
β Anticuerpo 2-ARSANTA CRUZ BIOTECHNOLOGYsc-569reemplazado por β 2-AR (E-3): sc-271322
Bis– Tris gelesThermo FisherNP0321PK2
Buprenorfina SR LabZooPharmIZ-70000-201908
Anticuerpo CD3Dako#A0452
anticuerpo CD68eBioscience#14-0688-82
Sustrato quimioluminiscentecytivaRPN2232
Película CL-XposureThermo Fisher34089
Sistema de anestesia completoEVETEQUIP922120
diaminobencidinaVECTOR LABORATORIESSK-4100
DoxorrubicinaActavisNDC 45963-733-60
Anticuerpo EGFRSANTA CRUZ BIOTECHNOLOGYsc-03reemplazado por EGFR (A-10): sc-373746
Anticuerpo ERBB2SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGYsc-284sustituido por Neu (3B5): sc-33684
Anticuerpo ERBB4SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGYsc-283sustituido por ErbB4 (C-7): sc-8050
anticuerpo ERKCRUZ BIOTECHNOLOGYsc-514302
lubricante ocularPHARMADERMNDC 0462-0211-38
Jeringa Hamilton (100 µ L)HamiltonModelo 1710 SN SYR
anticuerpo secundario ligado a la peroxidasa de rábano picanteCytivaNA934
HRP kit de detección de polímerosVECTOR LABORATORIESMP-7401
HRP kit de detección de polímerosVECTOR LABORATORIESMP-7402
isofluranoBUTLER SCHEINNDC 11695-6776-2
isoflurano vaporizadorEVETEQUIP911103
UMR-106 celda ATCCCRL-1661
Faxitronde rayos X UltraFocus
Procesador de rayos XHope X-Ray Peoducts IncMicroMax Procesador de rayos XHope Los procesadores Hope ya no están disponibles en Estados Unidos
pinzas para heridasBECTON DICKINSON427631
SANTA

Referencias

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Un modelo de rata Sprague Dawley de osteosarcoma ortotópico singénico con amputación para controlar la tasa de metástasis
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