Citometría de flujo y análisis de imagen confocal de baja expresión de Wnt en timocitos reporteros Axin2-mTurquoise2

Resumen

Se sabe que los niveles de señalización regulan el destino celular, lo que indica que la regulación de la señalización de Wnt constituye un objetivo terapéutico interesante. Aquí, describimos los métodos de análisis de citometría de flujo y microscopía confocal para un modelo murino robusto de indicador de señalización de Wnt canónico que mide distintos niveles de señalización de Wnt.

Resumen

La medición de los niveles de expresión de Wnt es esencial cuando se trata de identificar o probar nuevas dianas terapéuticas de Wnt. Estudios previos han demostrado que la señalización canónica de Wnt opera a través de un mecanismo impulsado por la dosis, lo que motiva la necesidad de estudiar y medir la señalización de Wnt en varios tipos de células. Aunque se han propuesto varios modelos reporteros para representar la expresión fisiológica de Wnt, el contexto genético o la proteína reportera influyeron en gran medida en la validez, precisión y flexibilidad de estas herramientas. En este artículo se describen los métodos para adquirir y analizar los datos obtenidos con el modelo reportero Wnt de ratón Axin2-mTurquoise2, que contiene un alelo Axin2^em1Fstl mutado. Este modelo facilita el estudio de la señalización canónica endógena de Wnt en células individuales en un amplio rango de actividad de Wnt.

Este protocolo describe cómo apreciar completamente la actividad reportera de Axin2-mTurquoise2 utilizando el análisis de la población celular del sistema hematopoyético, combinado con marcadores de superficie celular o tinción intracelular de β-catenina . Estos procedimientos sirven como base para la implementación y reproducción en otros tejidos o células de interés. Al combinar la clasificación de células activadas por fluorescencia y las imágenes confocales, se pueden visualizar distintos niveles de expresión canónicos de Wnt. Las estrategias de medición y análisis recomendadas proporcionan datos cuantitativos sobre los niveles de expresión fluorescente para una evaluación precisa de la señalización canónica de Wnt. Estos métodos serán útiles para los investigadores que deseen utilizar el modelo Axin2-mTurquise2 para los patrones de expresión canónicos de Wnt.

Introducción

La señalización canónica de Wnt es una vía de señalización conservada implicada en la homeostasis de los tejidos sanos, así como en la enfermedad. Se ha demostrado que la regulación precisa de los niveles de señalización de Wnt es importante en el desarrollo embrionario, pero también es de gran importancia en los tejidos adultos. Se ha descubierto que la señalización canónica de Wnt desempeña un papel importante en la regeneración de tejidos de varios órganos, como el intestino, la piel y el sistema hematopoyético. De ahí que cuando se desregule la señalización de Wnt, surjan patologías graves. El cáncer colorrectal, hepático y de piel, las enfermedades neurológicas, así como ciertas neoplasias hematológicas malignas son patologías ejemplares en las que la señalización desregulada de Wnt es el factor causal o contribuyente¹. Por lo tanto, actualmente se están probando en ensayos clínicos varios inhibidores para diferentes dianas de Wnt como terapias contra el cáncer asociadas a Wnt².

Además, se están produciendo avances interesantes en el potencial terapéutico de Wnt para la recuperación neurológica, los trastornos neurológicos relacionados con la edad y los trastornos del espectro autista congénito ^3,4,5. Se han explorado las señales Wnt para la expansión ex vivo de células madre para su posterior trasplante⁶. Sin embargo, la focalización terapéutica de la señalización canónica de Wnt es una tarea difícil debido a su importancia en muchas funciones celulares básicas y a la comunicación cruzada con otras vías ^7,8,9, lo que resulta en la necesidad de medir con precisión los efectos de estos agentes terapéuticos Wnt en un modelo fácil de interpretar. La señalización canónica de Wnt es impulsada por ligandos Wnt solubles de corto alcance, que son secretados por las células vecinas o como excreción autocrina, como se ha informado en varios tipos de células madre que responden a Wnt.

Los correceptores Wnt Frizzled y lipoprotein receiver-related protein (LRP) responden a estos ligandos, lo que desencadena una cascada de señalización intracelular. Cuando la señalización de Wnt está desactivada, un complejo de destrucción compuesto por un inhibidor del eje (Axin), un producto génico supresor de tumores, poliposis adenomatosa coli (APC), caseína quinasa1 (CK1α) y glucógeno sintasa quinasa (GSK-3β), evita la acumulación de β-catenina (CTNNB1) por degradación proteasómica. Tras la unión del ligando-receptor Wnt, el complejo de destrucción se inactiva, lo que conduce a la acumulación y estabilización de β-catenina en el citoplasma. La β-catenina activa puede migrar al núcleo, donde se une a los factores de transcripción del factor de transcripción/factor de unión al potenciador linfoide (TCF/LEF) para iniciar la transcripción de los genes diana Wnt. Axin2 se considera un gen diana, ya que es una diana directa de la vía Wnt¹⁰. Además, Axin2 sirve como regulador negativo, así como un gen reportero para la señalización canónica activa de Wnt^11,12.

En la literatura se han descrito varios reporteros canónicos de señalización de Wnt y han sido de gran utilidad para comprender el papel de la señalización de Wnt en el desarrollo embrionario. La mayoría de estos reporteros hacen uso de sitios de unión TCF/LEF insertados sintéticamente, que no utilizan un gen diana endógeno 13,14,15,16,17,18,19. Además, se han utilizado estrategias de knock-in de Axin2 que respetan la localización natural del gen 11,20,21,22,23, del cual Axin2-LacZ es generalmente aceptado como el reportero canónico más robusto de Wnt ¹¹. Sin embargo, la proteína reportera LacZ, aunque fácil de usar en la mayoría de los tejidos, requiere un sustrato de β-galactosidasa, que se reconoce como duro para las células vivas²⁴. Especialmente en el caso de las células madre y los timocitos, las duras condiciones de detección de LacZ aumentan la muerte celular (datos propios no informados) cuando se manipulan suspensiones celulares.

Aunque la amplificación de la señal causada por la tinción de LacZ es conveniente para detectar señales bajas, hace que la cuantificación sea menos directa y, por lo tanto, posiblemente menos confiable. Por lo tanto, se diseñó un modelo reportero murino para imitar la estrategia genética Axin2-LacZ , pero con una proteína reportera mTurquoise2²¹, para proporcionar una lectura más directa y más cercana a los niveles de expresión fisiológicos. La proteína fluorescente mTurquoise2 es un excelente sustituto de LacZ debido a su alto brillo (rendimiento cuántico (QY)= 0,93), flexibilidad en combinación con otras proteínas fluorescentes para una caracterización extensa de la superficie celular y su falta de necesidad de un sustrato exógeno. Además, su estrecha relación genética con la proteína verde fluorescente (GFP) ofrece la posibilidad de utilizar la mayoría de los anticuerpos fluorescentes que reconocen GFP para una detección de señal más fuerte, si es necesario, en células extremadamente sensibles al Wnt²⁵.

El modelo Axin2-mTurquoise2 no solo es un indicador Wnt canónico, sino que también ofrece la posibilidad de estudiar los fenotipos heterocigotos y homocigotos (Axin2 knock-out). La inserción dirigida de mTurquoise2 en el sitio de inicio de Axin2 da como resultado una interrupción de la proteína Axin2²¹. Dado que Axin2, también conocida como Conductina, forma parte del complejo de destrucción Wnt, y el complejo de destrucción regula estrechamente la transcripción mediada por β-catenina, su ausencia parcial o completa podría ser de interés para estudiar diversas patologías. Por ejemplo, en el cáncer colorrectal, los niveles de Axin2 son relativamente altos debido a la hiperactivación de Wnt¹¹; Sin embargo, su papel en otras patologías sigue siendo muy desconocido. A pesar de que se considera que Axin2 desempeña un papel limitado en la degradación de la β-catenina, su papel en la regulación de Wnt puede mejorarse mediante la adición de un pequeño péptido, que bloquea el crecimiento del cáncer colorrectal mediado por Wnt²⁶.

En conjunto, la regulación cuidadosa de Wnt a través de dianas terapéuticas de Wnt puede abrir oportunidades para cambiar la aparición o el desarrollo de patologías graves y debe investigarse más a fondo en modelos con capacidad de informar. En este informe, explicamos nuestro método de análisis de mejores prácticas del modelo murino Axin2-mTurquoise2 para citometría de flujo e imágenes confocal. En el contexto de los niveles de dosificación de Wnt, los niveles de señalización de Wnt canónicos muy bajos son difíciles de detectar, por lo que las capacidades avanzadas de detección y análisis proporcionan una ventaja para obtener plenamente los beneficios de este modelo. Los timocitos se utilizan como sistema modelo debido a su frágil viabilidad celular, baja expresión de señalización de Wnt canónica y área de citoplasma condensada para representar la sensibilidad de detección del modelo Axin2-mTurquoise2. Además, se explica un procedimiento histológico de tinción de β-catenina total para suspensiones de células de timocitos para medir los niveles citoplasmáticos de β-catenina y verificar la señalización de Wnt canónica activa nuclear en combinación con el reportero.

Protocolo

NOTA: Todos los procedimientos con ratones se realizaron con la aprobación del Comité de Ética sobre Experimentos con Animales del Centro Médico de la Universidad de Leiden (LUMC). Macho y hembra, de 6 a 12 semanas de edad, de tipo salvaje (wt), que no tienen inserción del constructo reportero Axin2-mTurquoise2, heterocigotos (Tg/0) con una inserción del constructo reportero Axin2-murquoise2 y, por lo tanto, un gen Axin2 interrumpido, y homocigotos (Tg/Tg) con la inserción del constructo reportero Axin2-mTurquoise2 en ambos alelos y, por lo tanto, dos genes Axin2 interrumpidos; Ratones Axin2-mTurquesa2 (B6; En los experimentos se utilizaron ratones CBA-Axin2^em1Fstl/J). Los animales fueron sacrificados mediante eutanasia con CO₂ antes del aislamiento de los órganos. Durante todo el procedimiento, minimice la exposición de las muestras a la luz y manténgalas en hielo o a 4 °C en todo momento, a menos que se indique lo contrario. Cubra las muestras con papel de aluminio. Todos los pasos deben realizarse en un laboratorio estándar con una cabina de bioseguridad.

1. Preparación de la suspensión de células de timocitos

1. Recoja el timo de los ratones con cuidado sin contaminación de la sangre cortando el abdomen de los ratones y extrayendo el timo con fórceps. Almacene/transporte temporalmente en el medio helado de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM) que contiene un 2,5% de suero fetal de ternera (FCS).
   NOTA: Para evitar derrames de sangre y posibles daños en el timo, no sacrifique a los ratones por luxación cervical.
2. Prepare un tubo de 50 mL con un filtro de celdas de 70 μm y humedezca el filtro con 1 mL de medio IMDM/FCS al 2,5% frío.
3. Triturar el órgano con la punta posterior de un émbolo de jeringa de 1 mL mientras se lava dos veces con medio IMDM/FCS frío al 2,5% (Figura 1A). Si lo desea, añada una concentración final de 50 U/mL de ADNasa I al medio IMDM/FCS al 2,5% para evitar la aglomeración de células muertas. Enjuague el filtro 2 veces con medio IMDM/2.5% FCS frío y vuelva a suspender suavemente en el tubo de 50 ml.
   NOTA: No exceda un volumen final total de 10 mL. Mantenga las celdas en hielo y en la oscuridad para los pasos posteriores y cuando no se manipulen.
4. Centrifugar a 330 × g durante 5 min a 4 °C y aspirar suavemente el sobrenadante del pellet de la célula. Vuelva a suspender el pellet celular suavemente en medio IMDM/FCS frío e incompleto al 2,5% y prepárese para el recuento celular.
   NOTA: Si es necesario, congele y almacene los timocitos en nitrógeno líquido en FCS-10% dimetilsulfóxido para su posterior experimentación. La congelación y descongelación celular adecuada reducirá la muerte celular excesiva. En promedio, la mitad de los timocitos pueden ser apoptóticos después de la descongelación debido a la selección natural de células T en el timo, lo que debe tenerse en cuenta al decidir cuántos timocitos congelar por criovial. No menos de 2,5 × 10⁶ timocitos deben congelarse por vial.

2. Preparación de la citometría de flujo de timocitos

1. Prepare los timocitos para el procedimiento de tinción de la superficie celular preparando 2,5 × 10⁶ timocitos por muestra de tinción en solución salina tamponada con fosfato helada (PBS, pH 7,4) (Figura 1B). Recuento del número de células vivas después de la descongelación, si los timocitos se han congelado previamente. Si es necesario, añadir una concentración final de 50 U/mL de ADNasa I para evitar la aglomeración de células muertas.
2. Utilice los paneles de tinción de anticuerpos para la caracterización de la superficie celular de un subconjunto completo de timocitos.
   NOTA: Se pueden seleccionar otras combinaciones de fluorocromos. Seleccione marcadores de población raros para fluorocromos fluorescentes brillantes y, si es posible, agregue un marcador de muertos vivos. Ni los fluorocromos V450 ni V500 deben utilizarse en combinación con el reportero fluorescente mTurquoise2 debido a la superposición espectral. Compruebe siempre los espectros de fluorescencia de mTurquoise2 en combinación con fluorocromos azules y verdes (Figura complementaria 1A).
   1. Mezclar los anticuerpos en proporciones previamente definidas de los paneles de linaje negativo (Lin-) por separado en tampón PBS/0,2% albúmina sérica bovina (BSA)/0,1% NaN₃ (azida sódica).
      NOTA: Todas las células no deseadas (no timocitos presentes en el timo) se tiñen en un proceso de 2 pasos con un anticuerpo secundario de estreptavidina (en este ejemplo, ficoeritrina (Pe)-Cy7 y aloficocianina (APC)-Cy7) y se pueden excluir mediante el uso de una "puerta de descarga" en el análisis de citometría de flujo.
   2. Mezclar los anticuerpos en proporciones previamente definidas del panel de tinción doble negativo (DN) con el anticuerpo secundario de estreptavidina Pe-Cy7 en tampón PBS/0,2% BSA/0,1% NaN₃ . Excluya el panel Lin- de esta mezcla (Tabla 1).
   3. Mezcle los anticuerpos en proporciones previamente definidas del panel de tinción inmaduro único positivo (ISP), doble positivo (DP) y único positivo (SP) con el anticuerpo secundario de estreptavidina APC-Cy7 en tampón PBS/0,2% BSA/0,1% NaN₃ . Excluya el panel Lin- de esta mezcla (Tabla 1).
   4. En primer lugar, tiñe los timocitos con las poblaciones no deseadas de células no T utilizando las mezclas de anticuerpos primarios de biotina de los paneles Lin- durante 30 minutos en hielo en la oscuridad.
      NOTA: Cada panel de Lin- es un conjunto diferente de células y, por lo tanto, no debe teñirse juntas en una muestra.
   5. Centrifugar a 300 × g, 4 °C durante 5 min y retirar el sobrenadante. Lavar los timocitos con 150 μL de tampón PBS/0,2% BSA/0,1% NaN₃ frío y centrifugar a 300 × g, 4 °C durante 5 min.
   6. Teñir con el panel DN y el panel ISP/DP/SP del Lin- tinción correspondiente durante 30 min sobre hielo en la oscuridad. Centrifugar a 300 × g, 4 °C durante 5 min, y retirar el sobrenadante. Lavar los timocitos con 150 μL de tampón PBS/0,2% BSA/0,1% NaN₃ helado y centrifugar a 300 × g, 4 °C durante 5 min.
3. Prepare las células para la medición de la citometría de flujo mediante la homogeneización con un tubo de filtro de células de 35 μm y la toma de las células en tampón PBS/0,2% BSA/0,1% NaN₃ . Proteja las células de la luz y manténgalas en hielo hasta y durante la medición del citómetro de flujo.
   NOTA: El NaN₃ (azida de sodio) es altamente tóxico y mortal. Se debe tener especial cuidado al trabajar con esta sustancia. Lávese bien las manos después de la manipulación y llame inmediatamente a un centro de control de envenenamiento o a un médico/médico si ingiere NaN₃ .

3. Medición de citómetro de flujo

NOTA: Los usuarios inexpertos deben tomar primero la capacitación en citómetros de flujo, ya que la medición de la señal mTurquoise2 en combinación con varios otros fluorocromos requiere experiencia y una planificación informada del experimento. Consulte la Tabla de materiales para obtener información sobre el citómetro de flujo.

1. Ponga en marcha el citómetro de flujo de acuerdo con el manual del usuario u otro protocolo establecido. Verifique y, si es necesario, ajuste el filtro de paso de banda en el citómetro de flujo para una estrategia óptima de detección de fluorescencia.
   NOTA: Un filtro recomendado para mTurquoise2 es 470/20 nm en la línea láser ultravioleta de 405 nm, 407 nm o la menos común de 440 nm.
2. Calibre el citómetro de flujo estableciendo configuraciones de compensación con perlas de compensación disponibles en el mercado y celdas 293T transfectadas de manera estable que expresan mTurquoise2.
   NOTA: Se pueden usar timocitos wt de una sola tinción en lugar de perlas de compensación. En este caso, la compensación con cuentas fue igualmente eficiente y más conveniente que el uso de celdas.
   1. Etiquete las perlas con cada fluorocromo individual utilizado en el experimento e incluya perlas sin teñir. Mida las cuentas para configurar un panel de configuración de compensación y mida las células 293T que expresan mTurquoise2, ya que no hay un fluorocromo que coincida con mTurquoise2, que se pueda usar en las cuentas. Guarde la configuración de compensación para usarla en el experimento real.
      NOTA: Las células que expresan mTurquoise2 utilizadas para el ajuste de compensación deben ser tan brillantes o más brillantes que los timocitos que expresan mTurquoise2 del experimento real. Asegúrese de que también haya células 293T mTurquoise2 negativas.
   2. Para el experimento, incluya timocitos teñidos con Tg/Tg con fluorescencia menos uno (FMO), incluyendo una muestra de wt para el FMO mTurquoise2 y una muestra sin teñir de timocitos de cada genotipo de ratón como controles positivos para la parte de análisis.
      NOTA: Estos controles son importantes para configurar correctamente las puertas para las celdas positivas. El resto de las muestras experimentales se tiñen con el panel de tinción completo (Tabla 1).
      1. Cree un experimento, agregue y asigne un nombre al número de tubos en el software del citómetro de flujo y cree diagramas de dispersión para visualizar las células teñidas para el conjunto completo de fluorocromos.
      2. Aplique la configuración de compensación previamente establecida al experimento. Ajuste la dispersión directa (FSC) y la dispersión lateral (SSC) con timocitos wt sin teñir hasta que la población completa de células sea visible en el diagrama de dispersión. Mida primero los timocitos que expresan Tg/Tg mTurquoise2 sin teñir para asegurarse de que la población positiva sea visible.
      3. Mida una muestra de timocito Tg/Tg completamente teñida y verifique todas las combinaciones de fluorocromo. Si es necesario, ajuste los valores de compensación previamente establecidos para los fluorocromos que muestren una compensación incorrecta. Mida el resto de las muestras experimentales y no ajuste ninguna configuración durante la medición de las muestras.
         NOTA: El ajuste de compensación posterior también se puede realizar en el paquete de software de análisis. Aunque el número de celdas disponibles podría ser un factor limitante, es aconsejable realizar este paso durante la medición. Mantenga los ajustes iguales entre todas las muestras para comparar los valores de intensidad de mTurquoise2.

4. Análisis de citometría de flujo

NOTA: El análisis de citometría de flujo se realizó utilizando el software específico mencionado en la Tabla de Materiales; Sin embargo, también están disponibles otros programas de análisis de citometría de flujo.

1. Cierre las células vivas y los subconjuntos de timocitos según los valores de FSC y SSC.
2. Compruebe los ajustes de compensación en el cuadro de diálogo de la matriz de compensación que se encuentra a la izquierda de la muestra para asegurarse de que no haya interferencias con el fluorocromo y de que se haya realizado la compensación adecuada para evitar el desbordamiento o el sangrado.
   1. Si se debe ajustar la matriz definida por la adquisición, cambie los valores de la matriz de compensación simplemente aumentando o disminuyendo el valor de compensación de cada combinación de fluorocromo para que la población no muestre una línea horizontal o vertical casi perfecta (Figura complementaria 1B).
3. Para distribuir visualmente la intensidad de mTurquoise2 para una activación positiva adecuada, cambie la visualización del eje X de mTurquoise2 a lineal (Figura complementaria 2).
   1. Utilice el control FMO mTurquoise2 como control negativo para la activación de señal positiva mTurquoise2. Revise el umbral correcto de compuerta por población de celdas (Figura 2).
      NOTA: Las celdas de control (wt) mTurquoise2 FMO no tienen el marcador mTurquoise2 y, por lo tanto, se pueden utilizar como umbral de fondo para la actividad del reportero Axin2.
4. Puerta de las células mTurquoise2 positivas con el canal de detección adecuado para definir cuántas células son Wnt positivas.
5. Calcule la media geométrica y la mediana para definir la cantidad de intensidad fluorescente en las celdas de interés.
   1. Haga clic en Estadísticas | Agregue una estadística dentro del panel que muestra las celdas mTurquoise2 positivas.
   2. Defina el método estadístico, la población de interés y el canal de detección de mTurquoise2 y haga clic en Agregar. Represente la media geométrica y la mediana de la intensidad fluorescente en unidades arbitrarias (UA) para trazar gráficos.
      NOTA: La mediana representa el valor medio de la intensidad fluorescente y, por lo tanto, proporciona información sobre el cambio de población en la intensidad fluorescente. Si es necesario, una corrección de fondo puede ayudar a obtener una visualización más clara del rango dinámico de la actividad del reportero mTurquoise2. Esto se puede hacer restando las frecuencias de tinción de fondo wt de la frecuencia total de células mTurquoise2 positivas del tipo de célula específico que está controlada.

5. Preparación de citospins de timocitos para la obtención de imágenes confocales

NOTA: Se recomiendan los citospins de los timocitos cuando se trabaja con suspensiones celulares de células no adheridas. Dado que la expresión de Axin2-mTurquoise2 en los timocitos es menor que en las células epiteliales del timo, se utilizaron suspensiones de células de timocitos filtradas para la obtención de imágenes.

1. Comience con una suspensión celular de timocitos recién cosechados o congelados. Suspender ~ 20,000 timocitos en 100 μL de PBS frío / 0.5% BSA / 10% FCS por genotipo de timocito.
   NOTA: Si es necesario, descongele las células suavemente para preservar la máxima viabilidad celular cuando trabaje con timocitos previamente congelados. Esto ayudará a reducir la autofluorescencia al obtener imágenes de las células. Comprobar la viabilidad de la célula para garantizar la calidad de la muestra. El procedimiento de citospin emplea una fuerza mecánica que se ha adaptado al frágil timocito; No obstante, requiere una población inicial altamente viable. Para garantizar una mayor viabilidad, es aconsejable comenzar con timocitos recién cosechados en lugar de congelados.
2. Humedezca previamente el área alrededor de la abertura de las tarjetas de filtro con PBS. Ensamble el soporte de la cámara de muestras cytospin de acuerdo con el manual (Figura 1C).
   1. Coloque la tarjeta de filtro en el portaobjetos de escarcha (lado liso contra el portaobjetos de vidrio). Coloque ambos elementos en el soporte de la cámara de muestras. Tenga cuidado al colocar la tarjeta de filtro exactamente en el orificio del soporte de la cámara de muestras y coloque el soporte completo de la cámara de muestras en el rotor.
3. Vuelva a suspender cuidadosamente los timocitos y agregue 100 μL de la suspensión celular en las cámaras de muestra. Gire la suspensión de timocitos durante 4 minutos a ~ 350 × g sobre los portaobjetos de escarcha. Retire la tarjeta de filtro con cuidado del portaobjetos antiescarcha sin tocar las celdas. Seque al aire los citospins durante un período que oscila entre 1 h y toda la noche a temperatura ambiente.
   NOTA: Cuando trabaje con otros tipos de celdas, pruebe diferentes densidades de celdas para obtener resultados óptimos. Los citospins se pueden congelar a -20 °C en una caja sellada para su posterior experimentación. Descongele los citospins para su posterior manipulación durante 1 h a temperatura ambiente.

6. Inmunotinción de citospin con β-catenina total

1. Fije los citospins durante 15 min a temperatura ambiente en metanol al 100%. Seque los portaobjetos al aire durante 10 minutos a temperatura ambiente. Dibuja un círculo alrededor de la población de timocitos en el portaobjetos de vidrio con un bolígrafo hidrofóbico.
   NOTA: Este paso de fijación está optimizado específicamente para la tinción de β-catenina.
2. Coloque los portaobjetos en PBS/0.05% Tween-20 durante 10 minutos a temperatura ambiente y luego transfiéralos a una caja oscura y húmeda durante los pasos de bloqueo e incubación. Añadir 100 μL de PBS/10% de suero normal de ratón (NMS) por portaobjetos, y dejar en la caja húmeda durante 10 min a temperatura ambiente. Golpee el portaobjetos para eliminar el 10% de NMS, agregue 100 μL de PBS / 10% de suero de cabra normal (NGS) por portaobjetos y déjelo en la caja húmeda durante 30 minutos a temperatura ambiente.
   NOTA: La incubación con PBS/NMS al 10% bloquea la unión de anticuerpos primarios no específicos (Figura 1D), mientras que PBS/NGS al 10% bloquea la unión de anticuerpos secundarios inespecíficos.
3. Preparar anticuerpos adicionales para la tinción celular. Mezcle 0,5 μg del anticuerpo total de β-catenina con los fragmentos marcados con AF568.
   NOTA: En este entorno, se utilizó un kit de etiquetado disponible en el mercado para el preetiquetado de la β-catenina total primaria contra el ratón con fragmentos secundarios de IgG1 Fab contra el ratón de cabra con la etiqueta de fluorocromo Alexa Fluor 568 (AF568) antes de agregarla a los timocitos. Realice el etiquetado de acuerdo con el protocolo del fabricante, ya que es posible que sea necesario analizar varias concentraciones. Use el anticuerpo total marcado con β-catenina-AF568 dentro de los 30 minutos.
4. Agregue 50 μL (0,5 μg) del total del anticuerpo marcado con β-catenina-AF568 por portaobjetos de citocentrifugado durante la noche a 4 °C en una caja húmeda. Incluir un control de tinción negativo según el protocolo del fabricante o un control de isotipo en caso de un protocolo de etiquetado directo.
5. Lavar durante 20 min con PBS/0.05% Tween-20 a temperatura ambiente. Luego, lavar durante 20 min con PBS a temperatura ambiente en un frasco con revuelto. Realizar una segunda etapa de fijación para asegurar la unión del anticuerpo al antígeno: 10 min a temperatura ambiente con 100 μL de paraformaldehído (PFA) al 4% en PBS en una caja húmeda.
   NOTA: Mantenga las diapositivas en la oscuridad. Ni el metanol ni la fijación de PFA afectarán significativamente a la expresión de mTurquoise2²⁷.
6. Sumerge las diapositivas en PBS. Realice la tinción nuclear con 50 μL de TO-PRO-3 (1:1500) durante 10 min a temperatura ambiente en la caja húmeda. Lave los portaobjetos durante 20 minutos con PBS a temperatura ambiente en un frasco con revuelto.
   NOTA: La concentración de TO-PRO3 se puede valorar en función del uso de otros fluorocromos con espectros fluorescentes cercanos.
7. Incruste las muestras con un reactivo antidecoloración de acuerdo con el protocolo del fabricante y cúbralas con un cubreobjetos. Secar al aire durante 24 h a temperatura ambiente. Visualice los portaobjetos directamente bajo un microscopio fluorescente o confocal, o guárdelos a -20 °C para obtener imágenes posteriores.

7. Medición microscópica confocal

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener información sobre el microscopio confocal.

1. Encienda el microscopio confocal de acuerdo con el manual o el protocolo establecido. Utilice controles de línea celular mTurquoise2 293T negativos y positivos transfectados de manera estable para el ajuste primario de la configuración confocal. Posteriormente, utilice los timocitos wt Axin2-mTurquoise2 y Tg/Tg (knock-out) Axin2-mTurquoise2 como controles negativos y positivos, respectivamente, para garantizar que no haya subexposición de la señal mTurquoise2.
2. Prepare el software para el escaneo secuencial programando los láseres y los anchos de filtro. Comience primero con la línea láser de longitud de onda más alta y trabaje hacia la longitud de onda más baja. Cuando todos los pasos de escaneo secuencial estén instalados, cargue la muestra en la platina del microscopio, enfoque la muestra y presione Live para optimizar la potencia del láser y la ganancia inteligente usando los botones respectivos en el software confocal o el panel manual opcional.
   NOTA: No se deben obtener imágenes de la sección de la muestra del portaobjetos para la cuantificación de la señal, ya que podría producirse un posible fotoblanqueo. Sin embargo, mTurquoise2 tiene una alta fotoestabilidad²⁵.
3. En caso de una expresión muy baja de mTurquoise2, aumente la potencia del láser y la ganancia inteligente hasta que se observe una señal fluorescente, y verifique con la muestra de control negativa para garantizar una señal positiva verdadera. Visualice los timocitos con una lente de aceite de 40x 1.4, una lente de aceite de 63x 1.4 o una lente de aceite de 100x 1.4.
   NOTA: Para este estudio se utilizó un microscopio Leica SP5.
4. Utilice estos ajustes de imagen confocal en el microscopio antes de medir la muestra.
   1. Ajuste el rango de valores de intensidad a una imagen de 12 bits haciendo clic en Configuración | Ajustes | cambie a 12 bits en la opción Profundidad de bits para crear una escala más amplia de intensidad y, por lo tanto, una mayor distinción entre señales fluorescentes bajas y altas.
   2. Ajuste la resolución de la imagen haciendo clic en XY y aumente el formato a 1024 x 1024, lo que también duplicará el tiempo de escaneo. Ajuste la velocidad de escaneo a 400-600 Hz haciendo clic en Velocidad | Más para cambiar manualmente la configuración. Además, active la opción de escaneo bidireccional .
   3. Ajuste el control deslizante de sensibilidad para reducir la señal de fondo. Optimiza la potencia correcta del láser y la ganancia inteligente con la opción Quick LUT (Look-Up Table).
      NOTA: En la imagen de 12 bits, el control deslizante tiene un valor de intensidad de escala de grises de 0 a 4095. Esto también se puede hacer después con el software gratuito fuera de línea Las X. El color verde mostrará el fondo negro y el color azul muestra los píxeles saturados de la muestra.
5. Cuando todos los ajustes de imagen estén optimizados, mida la muestra haciendo clic en Iniciar, lo que iniciará la imagen secuencial de los tres canales.
   1. Mida la señal fluorescente nuclear TO-PRO-3. Detecte TO-PRO-3 con el láser de 633 nm y HyD de 640-750 nm.
      NOTA: En esta configuración, se utilizó un 6% de potencia láser con un 15% de ganancia inteligente. Este ajuste puede cambiar en función de la intensidad de la tinción con TO-PRO-3. Si es muy brillante, podría influir en los fluorocromos de menor intensidad cuando se sobreexcita. En tal caso, reduzca la concentración de tinción.
   2. Mida las señales fluorescentes nucleares y citoplasmáticas de β-catenina. Detecte β-catenina con el láser de 561 nm y HyD 580-605 nm. Acumule hasta 2 escaneos para una imagen ajustando la configuración en la caja XY en el software con promedio de línea 2 en el caso de una señal AF568 baja.
      NOTA: En esta configuración, se utilizó un 85% de potencia láser con un 87% de ganancia inteligente.
   3. Mida la señal fluorescente citoplasmática mTurquoise2. Detecte mTurquoise2 con el láser de 458 nm y HyD de 490-600 nm. Acumule hasta 4 escaneos para una imagen ajustando la configuración en el cuadro XY en el software con promedio de línea 4 en el caso de una señal mTurquoise2 baja.
      NOTA: Debido a los láseres antiguos en el microscopio confocal utilizados para este protocolo y la baja señal mTurquoise2, se utilizaron 405 nm al 90% de potencia láser, junto con los láseres de 458 nm y 476 nm al 100% de potencia láser con HyD 490-550 nm al 100% de ganancia inteligente. Un láser de 440 nm es el más óptimo, aunque menos frecuentemente presente en un microscopio confocal. La alta potencia del láser debe manejarse con cuidado y solo se debe realizar con imágenes secuenciales. Asegúrese de que los ajustes de emergencia estén en su lugar para evitar la sobreexposición del detector. La potencia del láser en otros microscopios confocales podría ser inferior a los propuestos en este protocolo debido a láseres más potentes o más nuevos. Se podría realizar una prueba de blanqueamiento para asegurarse de que no se pierda ninguna señal fluorescente antes de la toma de imágenes. En la configuración propuesta, el fotoblanqueo de mTurquoise2 era aceptable.
   4. Realice imágenes de campo claro para la visualización total de la célula. Detecte timocitos con el láser de 488 nm y PMT Scan-DIC. Exporte los archivos Lif para el análisis de imágenes.
      NOTA: En esta configuración, se utilizó el 59% de la potencia del láser con una ganancia de 212 V y un desplazamiento de datos de -4,3%. Los archivos Lif se pueden leer en el software LAS x fuera de línea para la corrección de imágenes.

8. Análisis de microscopía confocal

1. Analice las imágenes utilizando un software de procesamiento de imágenes²⁸ (Figura complementaria 3). Cargue las imágenes en el software.
   NOTA: Se aceptan varios formatos, pero se recomiendan archivos TIFF con LUT o la importación directa de archivos Lif al software de procesamiento de imágenes.
2. Mida la señal activa de β-catenina en los núcleos de los timocitos.
   1. Seleccione los núcleos de los timocitos teñidos con TO-PRO-3 en la imagen de valor gris rojo para el análisis de la β-catenina activa. Hágalo manualmente o utilice la selección automática de celdas en el software.
      NOTA: Es posible que la selección automatizada de celdas necesite procesamiento de imágenes para un umbral y un análisis de partículas adecuados. La selección manual de células puede ser laboriosa, pero generalmente no requiere ningún procesamiento de imagen y se recomienda en este protocolo.
   2. Active la selección manual con cualquiera de las herramientas de selección de la barra de trabajo.
      1. Seleccione el contorno del núcleo y agréguelo al administrador de regiones de interés (ROI). Activa el gestor de ROI haciendo clic en Analizar | Herramientas | Administrador de ROI, y cuando se abra una nueva ventana de administrador de ROI, haga clic en la primera opción Agregar (t), o use el atajo de teclado t. Repita el paso anterior hasta que todos los núcleos estén definidos y agregados al administrador de ROI. Utilice la opción Mostrar todo en el administrador de ROI para visualizar las celdas seleccionadas.
   3. Seleccione >3 áreas de fondo en las que no haya celdas y agréguelas al administrador de ROI.
      NOTA: El tamaño y la forma no son importantes en este caso. Estas regiones servirán como mediciones de ruido de fondo para el cálculo final.
      1. Defina la medida en la imagen haciendo clic en Analizar | Establecer medidas. En la nueva ventana que se abre con diferentes opciones de medición, active Área, Densidad integrada y Valor medio de gris | haga clic en Aceptar.
      2. Active la imagen de valor de gris de β-catenina haciendo clic en ella, y visualice los núcleos seleccionados y las áreas de fondo haciendo clic en Mostrar todo en el administrador de ROI. Observe todas las áreas seleccionadas que ahora son visibles en la imagen de β-catenina.
      3. Haga clic en Medir en el Administrador de ROI o haga clic en Analizar | Medir. Observe la nueva ventana de Resultados que se abre, que muestra los resultados de la señal de β-catenina dentro de los ROI.
      4. Transfiera los resultados a un programa de cálculo de hoja de cálculo haciendo clic en Editar | Seleccione todo; y copie/pegue la lista en la hoja de cálculo para su posterior cálculo. Guarde el administrador de ROI para referencia futura sin tener que repetir la selección de núcleos haciendo clic en Más | Salvar....
   4. Para la selección automática de celdas, realice duplicados (teclado Ctrl D) de la imagen que se va a procesar, ya que muchos ajustes de procesamiento de imágenes no se pueden deshacer.
      NOTA: El etiquetado nuclear automatizado requiere procesamiento de imágenes, en la mayoría de los casos, para definir los núcleos de forma automática y precisa. El procesamiento de imágenes solo debe realizarse con fines de selección de área. Las imágenes procesadas no son útiles para la medición de la intensidad fluorescente porque los valores de los píxeles están alterados.
      1. Realice un filtro gaussiano haciendo clic en Proceso | Filtros | Desenfoque gaussiano para suavizar la imagen. Pruebe varios valores Sigma (Radio) y active la opción Vista previa para visualizar el efecto antes de hacer clic en Aceptar.
      2. Invierte la imagen haciendo clic en Editar | Invertir. Verifique el brillo y el contraste haciendo clic en Imagen | Ajustar | Brillo/Contraste. Utilice la opción Auto o, preferiblemente, cambie manualmente los valores.
         NOTA: No aplique los cambios, ya que esto alteraría las propiedades de la imagen. Basta con cerrar la ventana de B&C cuando se haya obtenido la imagen deseada.
      3. Cree un umbral haciendo clic en Imagen | Ajustar | Umbral y defina la mejor configuración de Umbral en la que todas las celdas sean visibles en su mayoría. Haga clic en Aplicar para aplicar la configuración del umbral.
         NOTA: Si no se ha aplicado un umbral a las celdas, que muestran agujeros, haga clic en Procesar | Binario | Rellena agujeros para rellenar los huecos dentro de las celdas. Si las celdas están fusionadas con la configuración del umbral, haga clic en Procesar | Binario | Cuenca hidrográfica para separar estas células. Una línea fina de 1 píxel separará cualquier celda que el programa interprete como fusionada.
      4. Defina el núcleo más pequeño y el más grande de la imagen seleccionando manualmente un núcleo de su elección con la herramienta de selección a mano alzada , agréguelo al administrador de ROI y mida el área.
      5. Analice las partículas (núcleos) haciendo clic en Analizar | Analice las partículas e inserte el área más pequeña y el área más grande en el cuadro Tamaño (^2) con un guión (-) en medio. Active las casillas Mostrar resultados, Agregar al administrador y Excluir en bordes antes de hacer clic en Aceptar. Continúe con el paso 8.2.3 para completar el protocolo.
3. Mida las señales citoplasmáticas de mTurquoise2 y β-catenina en los timocitos.
   1. Seleccione el contorno de los timocitos enteros en la imagen de campo claro siguiendo los mismos pasos que los anteriores.
   2. Seleccione >3 áreas de fondo en las que no haya celdas y agréguelas al administrador de ROI.
      NOTA: El tamaño y la forma no son esenciales en este caso. Estas regiones servirán como mediciones de ruido de fondo para el cálculo final.
      1. Active la imagen de valor de gris mTurquoise2 haciendo clic en ella y visualice el ROI total de la celda seleccionado y las áreas de fondo haciendo clic en Mostrar todo en el administrador de ROI. Observe todas las áreas seleccionadas que son visibles en la imagen mTurquoise2.
      2. Haga clic en Medir en el Administrador de ROI, o haga clic en Analizar | Medir. Observe la nueva ventana de resultados que se abre con los resultados de medición de la señal mTurquoise2.
      3. Transfiera los resultados a un programa de cálculo de hoja de cálculo haciendo clic en Editar | Seleccione todo y copie/pegue la lista en la hoja de cálculo para su posterior cálculo.
      4. Active la imagen de valor de gris de β-catenina haciendo clic en ella y visualice el ROI total de la celda seleccionado y las áreas de fondo haciendo clic en Mostrar todo en el administrador de ROI. Observe todas las áreas seleccionadas que son visibles en la imagen de β-catenina.
      5. Haga clic en Medir en el Administrador de ROI, o haga clic en Analizar | Medir. Observe la nueva ventana de resultados que se abre con los resultados de la medición de la señal total de β-catenina celular.
      6. Transfiera los resultados a un programa de cálculo de hoja de cálculo haciendo clic en Editar | Seleccione todo y copie/pegue la lista en la hoja de cálculo para su posterior cálculo. Guarde el administrador de ROI para referencia futura sin tener que repetir la selección de celdas haciendo clic en Más | Salvar....
4. Calcule la fluorescencia nuclear total corregida (CTNF) para la β-catenina activa utilizando la ecuación 1.
   CTNF = Densidad integrada - (Área × promedio de las áreas de fondo medias) (1)
5. Calcule la fluorescencia celular total corregida (CTCF) para mTurquoise2 usando la ecuación 2.
   CTCF = Densidad integrada - (Promedio de × área de las áreas de fondo medias) (2)
6. Diferenciar entre la β-catenina nuclear activa y la β-catenina citoplasmática restando los valores de β-catenina nuclear obtenidos en el paso 8.2.3.3. A partir de los valores de β-catenina total de la célula obtenidos en el paso 8.3.2.5 para obtener la β-catenina inactiva citoplasmática.
   NOTA: Asegúrese de que las mediciones se realicen dentro de la misma celda.
   1. Calcule el promedio de la intensidad media de las áreas de fondo. Calcule CTNF y CTCF utilizando las ecuaciones 1 y 2. Considere IntDen (la suma de todos los píxeles dentro del área seleccionada) como la densidad integrada y no RawIntDen.
   2. Si es necesario, calcule la desviación estándar de los valores de IntDen para trazar gráficos. Considere hasta 200 celdas separadas para el análisis estadístico utilizando la prueba U de Mann-Whitney.
7. Represente los resultados en un gráfico de puntos de datos individual y etiquete el eje Y con los valores CTNF o CTCF como unidades fluorescentes relativas (RFU).

Resultados

Para investigar el papel de la señalización canónica de Wnt, se ha probado un modelo reportero de Wnt canónico Axin2-mTurquoise2 en combinación con la expresión de la proteína β-catenina. Se sabe que los timocitos son frágiles, muestran una baja señalización canónica de Wnt en varias etapas del proceso de maduración de los timocitos y tienen una baja proporción citoplasmática a nuclear; todos estos factores dificultan la detección de mTurquoise2 citoplasmática o β-catenina. Siguiendo el protocolo, se recolectaron timocit...

Discusión

Hay disponibles varios reporteros Wnt canónicos con diferentes sensibilidades de reporteros y proteínas reporteras reales. Los modelos reporteros que utilizan sitios de unión TCF/LEF multimerizados introducidos sintéticamente están disponibles con proteínas reporteras fluorescentes; sin embargo, tales repeticiones de transgenes pueden perderse durante la reproducción o experimentos in vivo prolongados y pueden ser sensibles a señales no Wnt de secuencias genómicas circundantes q...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
BD FACScitómetro de flujo BD	Biosciences	no aplicable	Número de serie V96300710. La configuración del citómetro de flujo en este protocolo contiene una línea láser de 405 nm con filtro de paso largo 505 y filtro de paso de banda de 530/30 nm, y filtro de paso de banda de 470/20 nm; un láser de 488 nm con filtro de paso largo de 735 nm y filtro de paso de banda de 780/60 nm, filtro de paso largo de 670 nm y filtro de paso largo de 655 nm, filtro de paso largo de 610 nm, filtro de paso largo de 550 nm y filtro de paso de banda de 575/26 nm, filtro de paso largo de 505 nm y filtro de paso de banda de 530/30 nm, y filtro de paso de banda de 488/10 nm; y una línea láser de 633 nm con filtro de paso largo de 735 nm y filtro de paso de banda de 780/60 nm, filtro de paso largo de 685 nm y filtro de paso de banda de 660/20 nm.
BSA	Sigma	A9647
Corning 70 μ Filtro de células M	Halcón/Corning	352350
Cytospin 4 Tipo A78300101	Thermo Scientific	no aplicable
DMSO	Sigma Aldrich	D5879-1L
DNAse I	Sigma	A9647
Falcon 50 mL Tubos de centrífuga cónicos	Greiner bio-one	227261
Falcon de fondo redondo Tubos de ensayo con tapón a presión de filtro de células	Fisher Scientific
Suero para terneros fetales (FCS)	Greiner Bio-One B.V.	no aplicable	Depende del origen
Software de Fiji	ImageJ	no aplicable	Versión 1.53
Tarjeta de filtro blanca (para cytospin)	VWR	SHAN5991022
FlowJo 10 software	Treestar	not aplicable	Versión 10.5.3
Toboganes de escarcha	Klinipath
Gibco IMDM medio	Fisher Scientific
HCX PL APLO 40x 1.4 OIL	Leica microsystems	no aplicable
Bolígrafo hidrofóbico: Bolígrafo Omm Edge	Vector	no aplicable
Leica TCS SP5 DMI6000	Leica microsystems	no aplicable	La configuración del microscopio en este protocolo consistió en un objetivo de inmersión en aceite HCX PL APO 40x/1.2 con resolución de 8 bits, 1024 píxeles x 1024 píxeles, velocidad de 400 Hz, estenopeico 68 y micro; m y factor de zoom de 1,5 a temperatura ambiente. Este sistema contiene un láser de diodo 405, un láser de argón, un láser DPSS 561, un láser HeNe 594 y un láser HeNe 633 con 4 detectores híbridos (HyDs) y 5 tubos fotomultiplicadores (PMT).
Metanol	VWR	1060091000
NaN3/azida sódica		no aplicable
Suero de ratón normal	Ratones propios	no aplicable
PBS	Lonza	BE17-517Q
ProLong Diamond Antidecoloración Montador	Fisher Scientific	P36965
Ratón purificado anti-β-catenina (CTNNB1)	BD Biosciences	610154
TO-PRO-3	Yoduro Thermofisher	T3605
Esmalte de uñas transparente	en cualquier farmacia	no aplicable
Tween-20	Sigma Aldrich	P1379-500ml
Kit de etiquetado Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1	Thermofisher	Z25006