Citometría de flujo y análisis de imagen confocal de baja expresión de Wnt en timocitos reporteros Axin2-mTurquoise2

Resumen

Se sabe que los niveles de señalización regulan el destino celular, lo que indica que la regulación de la señalización de Wnt constituye un objetivo terapéutico interesante. Aquí, describimos los métodos de análisis de citometría de flujo y microscopía confocal para un modelo murino robusto de indicador de señalización de Wnt canónico que mide distintos niveles de señalización de Wnt.

Resumen

La medición de los niveles de expresión de Wnt es esencial cuando se trata de identificar o probar nuevas dianas terapéuticas de Wnt. Estudios previos han demostrado que la señalización canónica de Wnt opera a través de un mecanismo impulsado por la dosis, lo que motiva la necesidad de estudiar y medir la señalización de Wnt en varios tipos de células. Aunque se han propuesto varios modelos reporteros para representar la expresión fisiológica de Wnt, el contexto genético o la proteína reportera influyeron en gran medida en la validez, precisión y flexibilidad de estas herramientas. En este artículo se describen los métodos para adquirir y analizar los datos obtenidos con el modelo reportero Wnt de ratón Axin2-mTurquoise2, que contiene un alelo Axin2^em1Fstl mutado. Este modelo facilita el estudio de la señalización canónica endógena de Wnt en células individuales en un amplio rango de actividad de Wnt.

Este protocolo describe cómo apreciar completamente la actividad reportera de Axin2-mTurquoise2 utilizando el análisis de la población celular del sistema hematopoyético, combinado con marcadores de superficie celular o tinción intracelular de β-catenina . Estos procedimientos sirven como base para la implementación y reproducción en otros tejidos o células de interés. Al combinar la clasificación de células activadas por fluorescencia y las imágenes confocales, se pueden visualizar distintos niveles de expresión canónicos de Wnt. Las estrategias de medición y análisis recomendadas proporcionan datos cuantitativos sobre los niveles de expresión fluorescente para una evaluación precisa de la señalización canónica de Wnt. Estos métodos serán útiles para los investigadores que deseen utilizar el modelo Axin2-mTurquise2 para los patrones de expresión canónicos de Wnt.

Introducción

La señalización canónica de Wnt es una vía de señalización conservada implicada en la homeostasis de los tejidos sanos, así como en la enfermedad. Se ha demostrado que la regulación precisa de los niveles de señalización de Wnt es importante en el desarrollo embrionario, pero también es de gran importancia en los tejidos adultos. Se ha descubierto que la señalización canónica de Wnt desempeña un papel importante en la regeneración de tejidos de varios órganos, como el intestino, la piel y el sistema hematopoyético. De ahí que cuando se desregule la señalización de Wnt, surjan patologías graves. El cáncer colorrectal, hepático y de pie....

Protocolo

NOTA: Todos los procedimientos con ratones se realizaron con la aprobación del Comité de Ética sobre Experimentos con Animales del Centro Médico de la Universidad de Leiden (LUMC). Macho y hembra, de 6 a 12 semanas de edad, de tipo salvaje (wt), que no tienen inserción del constructo reportero Axin2-mTurquoise2, heterocigotos (Tg/0) con una inserción del constructo reportero Axin2-murquoise2 y, por lo tanto, un gen Axin2 interrumpido, y homocigotos (Tg/Tg) con la inserción del constructo reportero Axin2-mTurquoise2 en ambos alelos y, por lo tanto, dos genes Axin2 interrumpidos; Ratones Axin2-mTurque....

Resultados

Para investigar el papel de la señalización canónica de Wnt, se ha probado un modelo reportero de Wnt canónico Axin2-mTurquoise2 en combinación con la expresión de la proteína β-catenina. Se sabe que los timocitos son frágiles, muestran una baja señalización canónica de Wnt en varias etapas del proceso de maduración de los timocitos y tienen una baja proporción citoplasmática a nuclear; todos estos factores dificultan la detección de mTurquoise2 citoplasmática o β-catenina. Siguiendo el protocolo, se recolectaron timocit.......

Discusión

Hay disponibles varios reporteros Wnt canónicos con diferentes sensibilidades de reporteros y proteínas reporteras reales. Los modelos reporteros que utilizan sitios de unión TCF/LEF multimerizados introducidos sintéticamente están disponibles con proteínas reporteras fluorescentes; sin embargo, tales repeticiones de transgenes pueden perderse durante la reproducción o experimentos in vivo prolongados y pueden ser sensibles a señales no Wnt de secuencias genómicas circundantes q.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
BD FACScitómetro de flujo BD	Biosciences	no aplicable	Número de serie V96300710. La configuración del citómetro de flujo en este protocolo contiene una línea láser de 405 nm con filtro de paso largo 505 y filtro de paso de banda de 530/30 nm, y filtro de paso de banda de 470/20 nm; un láser de 488 nm con filtro de paso largo de 735 nm y filtro de paso de banda de 780/60 nm, filtro de paso largo de 670 nm y filtro de paso largo de 655 nm, filtro de paso largo de 610 nm, filtro de paso largo de 550 nm y filtro de paso de banda de 575/26 nm, filtro de paso largo de 505 nm y filtro de paso de banda de 530/30 nm, y filtro de paso de banda de 488/10 nm; y una línea láser de 633 nm con filtro de paso largo de 735 nm y filtro de paso de banda de 780/60 nm, filtro de paso largo de 685 nm y filtro de paso de banda de 660/20 nm.
BSA	Sigma	A9647
Corning 70 μ Filtro de células M	Halcón/Corning	352350
Cytospin 4 Tipo A78300101	Thermo Scientific	no aplicable
DMSO	Sigma Aldrich	D5879-1L
DNAse I	Sigma	A9647
Falcon 50 mL Tubos de centrífuga cónicos	Greiner bio-one	227261
Falcon de fondo redondo Tubos de ensayo con tapón a presión de filtro de células	Fisher Scientific
Suero para terneros fetales (FCS)	Greiner Bio-One B.V.	no aplicable	Depende del origen
Software de Fiji	ImageJ	no aplicable	Versión 1.53
Tarjeta de filtro blanca (para cytospin)	VWR	SHAN5991022
FlowJo 10 software	Treestar	not aplicable	Versión 10.5.3
Toboganes de escarcha	Klinipath
Gibco IMDM medio	Fisher Scientific
HCX PL APLO 40x 1.4 OIL	Leica microsystems	no aplicable
Bolígrafo hidrofóbico: Bolígrafo Omm Edge	Vector	no aplicable
Leica TCS SP5 DMI6000	Leica microsystems	no aplicable	La configuración del microscopio en este protocolo consistió en un objetivo de inmersión en aceite HCX PL APO 40x/1.2 con resolución de 8 bits, 1024 píxeles x 1024 píxeles, velocidad de 400 Hz, estenopeico 68 y micro; m y factor de zoom de 1,5 a temperatura ambiente. Este sistema contiene un láser de diodo 405, un láser de argón, un láser DPSS 561, un láser HeNe 594 y un láser HeNe 633 con 4 detectores híbridos (HyDs) y 5 tubos fotomultiplicadores (PMT).
Metanol	VWR	1060091000
NaN3/azida sódica		no aplicable
Suero de ratón normal	Ratones propios	no aplicable
PBS	Lonza	BE17-517Q
ProLong Diamond Antidecoloración Montador	Fisher Scientific	P36965
Ratón purificado anti-β-catenina (CTNNB1)	BD Biosciences	610154
TO-PRO-3	Yoduro Thermofisher	T3605
Esmalte de uñas transparente	en cualquier farmacia	no aplicable
Tween-20	Sigma Aldrich	P1379-500ml
Kit de etiquetado Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1	Thermofisher	Z25006

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