Aislamiento e imágenes de lapso de tiempo de células mesenquimas palatinas embrionarias primarias de ratón para analizar los atributos del movimiento colectivo

Summary

Presentamos un protocolo para el aislamiento y cultivo de células mesenquimales palatales embrionarias primarias de ratón para imágenes de lapso de tiempo de crecimiento bidimensional (2D) y ensayos de reparación de heridas. También proporcionamos la metodología para el análisis de los datos de imágenes de lapso de tiempo para determinar la formación de flujo celular y la motilidad direccional.

Abstract

El desarrollo del paladar es un proceso dinámico, que implica el crecimiento vertical de estantes palatales bilaterales junto a la lengua seguido de elevación y fusión por encima de la lengua. Los defectos en este proceso conducen al paladar hendido, un defecto congénito común. Estudios recientes han demostrado que la elevación de la plataforma palatal implica un proceso de remodelación que transforma la orientación de la plataforma de una vertical a una horizontal. El papel de las células mesenquimales de la plataforma palatal en esta remodelación dinámica ha sido difícil de estudiar. El análisis cuantitativo basado en imágenes de lapso de tiempo se ha utilizado recientemente para mostrar que las células mesenquimales palatales embrionarias primarias de ratón (MEPM) pueden autoorganizarse en un movimiento colectivo. Los análisis cuantitativos pudieron identificar diferencias en las células MEPM mutantes a partir de un modelo de ratón con defectos de elevación del paladar. Este artículo describe métodos para aislar y cultivar células MEPM de embriones E13.5, específicamente para imágenes de lapso de tiempo, y para determinar varios atributos celulares del movimiento colectivo, incluidas las medidas para la formación de corrientes, la alineación de la forma y la persistencia de la dirección. Postula que las células MEPM pueden servir como un modelo proxy para estudiar el papel del mesénquima de la plataforma palatina durante el proceso dinámico de elevación. Estos métodos cuantitativos permitirán a los investigadores en el campo craneofacial evaluar y comparar los atributos de movimiento colectivo en células de control y mutantes, lo que aumentará la comprensión de la remodelación mesenquimal durante la elevación de la plataforma palatina. Además, las células MEPM proporcionan un modelo de célula mesenquimal raro para la investigación del movimiento celular colectivo en general.

Introduction

El desarrollo del paladar se ha estudiado ampliamente ya que los defectos en la palatogénesis conducen al paladar hendido, un defecto congénito común que ocurre en casos aislados o como parte de cientos de síndromes^1,2. El desarrollo del paladar embrionario es un proceso dinámico que implica el movimiento y la fusión del tejido embrionario. Este proceso se puede dividir en cuatro pasos principales: 1) inducción de estantes palatales, 2) crecimiento vertical de los estantes palatales junto a la lengua, 3) elevación de los estantes palatales por encima de la lengua, y 4) fusión de los estantes palatales en la lí....

Protocol

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo con un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de KUMC, de acuerdo con sus directrices y regulaciones (Número de protocolo: 2018-2447).

1. Cosecha embriones E13.5

1. Sacrificar ratones hembra preñados utilizando una cámara de inhalación de CO₂ o mediante un procedimiento aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales. Proceda inmediatamente a la disección.
2. Exponga la mitad inferior de la cavidad abdominal eliminando la piel y el peritoneo. Extirpar ambos cuernos del útero, que contienen los embriones E13.....

Results

La disección de los estantes palatales se ilustra en la Figura 1. La secuencia de incisiones está diseñada para minimizar el deslizamiento del tejido. Después de la extracción de la cabeza (Figura 1A,B), se retira la mandíbula inferior ( Figura1B, C). La incisión de la parte superior de la cabeza (Figura 1C,D) se realiza para estabilizar el tejido cuand.......

Discussion

La elevación de la plataforma palatal constituye un evento de remodelación vertical a horizontal^1,3,4,9,11. Se postula que este proceso de remodelación requiere que las células mesenquimales de la plataforma palatal se comporten coordinadamente. Los análisis con células MEPM de tipo salvaje muestran que este comportamiento celular es intrínseco y puede ser cua.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
precipitados, 250 mL (x2)	Fisher Scientific	FB-100-250
CO2	Matheson Gas	UN1013
Tubos cónicos, 15 mL (x1)	Midwest Scientific	C15B
Sistema operativo			Análisis computacional de imágenes de lapso de tiempo
Águilas modificadas de Dulbecco Glucosa media/alta con 4 mM L-glutamina y piruvato de sodio	Cytiva Life Sciences	SH30243.01
EtOH, 100%	Decon Laboratories	2701
EVOS FL	Auto ThermoFisher Scientific	AMAFD1000
EVOS Incubadora de escenario	ThermoFisher Scientific	AMC1000
EVOS Soporte de recipiente de etapa, placas de pocillos múltiples	ThermoFisher Scientific	AMEPVH028
Suero fetal bovino	Corning	35-010-CV
Pinza de acero inoxidable de punta fina #5 (x2)	Fine Science Tools	11295-10 Baño de
perlas esterilizador de instrumentos	Fine Science Tools	18000-45
Tubos de microcetrífugo, 1,5 ml	Tijeras	2925
rectas	Roboz	RS-5910	Disección
NucBlue (Hoechst) Sondas Live Ready	ThermoFisher Scientific	R37605
Solución de estreptomicina de penicilina, 100x	Corning	30-002-CI
Inserto de silicona, 2 pocillos	Ibidi	80209
Pequeña cuchara perforada de acero inoxidable	Herramientas de ciencia fina	MC17C
Tijeras, 4 mm	Fine Science Tools	15018-10
Estéril de 10 cm dishe(s)	Corning	430293
Placa(s) estéril(es) de 12 pocillosPR1MA		667512
Placa(s) estéril(es) de 6 pocillosThermo	Fisher Scientific	140675
PBS estéril	Corning	21-031-CV
Pipeta	de transferencia de pera de plástico estérilThermoFisher Scientific	202-1S
Tripsina, 0,25 %	ThermoFisher Scientific	25200056