Hemos desarrollado un protocolo generalizado para disociar una gran cantidad de células individuales de alta calidad del epitelio y el meténquima / tejido conectivo de lenguas de ratón embrionarias y adultas.
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Artículo de método
Disociación Celular Del Epitelio De La Lengua Y El Meténquima / Tejido Conectivo De Los Ratones Embrionarios-Día 12.5 Y 8-Semana-Viejo
En este artículo
Resumen
Resumen
La disociación celular ha sido un procedimiento esencial para los estudios a nivel de células individuales y/o a nivel de población celular (por ejemplo, secuenciación de ARN unicelular y cultivo celular primario). Producir células viables y sanas en grandes cantidades es crítico, y las condiciones óptimas para hacerlo dependen del tejido. Las poblaciones celulares en el epitelio de la lengua y el tejido conectivo/meténquima subyacente son heterogéneos y las estructuras tisulares varían en diferentes regiones y en diferentes etapas de desarrollo. Hemos probado protocolos para aislar las células del epitelio de la lengua del ratón y del tejido del mesenchyme/conectivo en las etapas tempranas del desarrollo [día embrionario 12.5 (E12.5)] y del adulto joven (8 semanas). Una separación limpia entre el epitelio y el mesenchyme/el tejido conectivo subyacente era fácil de lograr. Sin embargo, para procesar y aislar aún más las células, el rendimiento de células sanas viables en grandes cantidades, y la selección cuidadosa de tampón de digestión enzimática, tiempo de incubación, y la velocidad y el tiempo de centrifugación son críticos. La incubación del epitelio separado o del tejido conectivo/del mesenchyme subyacente en el 0,25% Tripsina-EDTA durante 30 minutos en el °C 37, seguido por la centrifugación en 200 x g por 8 minutos dio lugar a un alto rendimiento de células en una alta tarifa de viabilidad (>90%) independientemente de las etapas del ratón y las regiones de la lengua. Por otra parte, encontramos que las células epiteliales y mesenquimales/conectivas disociadas del tejido de lengüetas embrionarias y adultas podrían sobrevivir en el medio cultivo-basado celular por lo menos 3 h sin una disminución significativa de la viabilidad de la célula. Los protocolos serán útiles para los estudios que requieren la preparación de células aisladas de lenguas de ratón en etapas de desarrollo temprano (E12.5) y adultos jóvenes (8 semanas) que requieren disociación celular de diferentes compartimentos tisulares.
Introducción
La lengua de los mamíferos es un órgano complejo crítico para el gusto, el habla y el procesamiento de alimentos. Se compone de múltiples tipos de tejidos altamente organizados compartimentados por el meténquima / tejido conectivo y cubiertos por una hoja epitelial estratificada que contiene papilas gustativas y papilas gustativas. Las poblaciones celulares tanto en el epitelio de la lengua como en el meténquima/tejido conectivo son heterogéneas. Para comprender mejor las funciones y la distribución de un tipo particular de células en la lengua, son necesarios estudios con células disociadas. Por ejemplo, la secuenciación de ARN unicelular es un método potente y de al....
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Protocolo
El uso de animales (ratones C57BL/6 a lo largo del estudio) fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Georgia y estuvo de acuerdo con las Directrices de los Institutos Nacionales de Salud para el cuidado y uso de animales para la investigación.
1. Uso animal
NOTA: Los ratones fueron criados y mantenidos en las instalaciones de animales del departamento de Ciencia Animal y Lechera de la Universidad de Georgia a 22 °C bajo ciclos día/noche de 12 h.
- Designar el mediodía del día de detección del tapón vaginal en ratones como embrionario (E) día 0,5. Utilice e....
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Resultados
Separación del epitelio de la lengua del mesenquima/tejido conectivo subyacente
En la lengua embrionaria del ratón, un boquete en el espacio subepitelial es visible después de la digestión apropiada de la enzima. Las hojas epiteliales de algunas lenguas se separan sin fuerza mecánica durante la incubación.
En la lengua adulta del ratón, una inyección enzimática exitosa se indica por la hinchazón en las áreas inyectadas (Figura 1B2<.......
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Discusión
Hasta la fecha, no ha habido un protocolo detallado disponible para la disociación de la célula del epitelio de la lengüeta y del tejido conectivo/del mesenchyme/del tejido conectivo subyacentes. Este protocolo de disociación celular actual proporciona un procedimiento reproducible para generar una suspensión unicelular con una alta viabilidad celular (>90%) de los tejidos de la lengua del ratón, incluyendo las hojas epiteliales y los tejidos del mesenchyme/connective en las etapas embrionarias y postnatales aunque las c.......
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Divulgaciones
No se declaran conflictos de intereses.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud, número de subvención R01DC012308 y R21DC018089 a HXL. Damos las gracias a Brett Marshall (Universidad de Georgia, Athens, GA) y Egon Ranghini (10X GENOMICS, Pleasanton, CA) por la asistencia técnica y la consulta con respecto a la disociación celular; a Francisca Gibson Burnley (Universidad de Georgia, Athens, GA) para la edición en inglés.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| albúmina sérica bovina (BSA) | Gold Biotechnology | A-420-100 | |
| C57BL/6 ratón (C57BL/6J) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| colagenasa (Colagenasa A) | 10103586001 | Sigma-Aldrich | |
| (35 mm de diámetro) | Genesee Scientific | 32-103G | |
| (100 mm de diámetro) | Genesee Scientific | 32-107G | |
| dispasa (Dispasa II) | Sigma-Aldrich | 04942078001 | |
| (Tijeras finas para estudiantes) | Buscar herramienta | científica 91460-11 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| suero fetal bovino (FBS) | Hyclone | C838U82 | |
| (Pinzas Dumount #3) | Buscar herramienta científica | 11293-00 | |
| hemocitómetro | Hausser Scientific | 3520 | |
| con sistema de imagen (EVOS XL Core Cell Imaging System) | Life Technologies | AMEX1000 | |
| puntas de pipeta de baja retención | METTLER TOLEDO | ||
| (Tijeras Evo Spring) | Fine Science Tool | 15800-01 | |
| urdimbre de plástico | VWR | 46610-056 | |
| espátula (Cuchara Moria) | Pinza quirúrgica Fine Science Tool | 10321-08 | |
| (Pinzas de laminectomía Dumount #2) | Fine Science Tool | 11223-20 | |
| Azul tripano | Gibco | 15250061 | |
| Tyrode' s solución | Sigma-Aldrich | T2145-10L | hecha de sales de Tyrode |
| 0.25% typsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 0.1 M Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Hoefer | 33946 | hecha de 1 M PBS |
| 0.22-μ filtro de jeringa m | Genesee Scientific | 25-243 | |
| 70% etanol | Koptec | 233919 | de etanol 100% |
| jeringa de 1 mL | BD | 8194938 | |
| 5 mL tubo de microcentrífuga de baja unión | Eppendorf | 30122348 | |
| 30-G aguja | BD | 9193532 | |
| 35-μ m filtro de células | Falcon | 64750 | |
| 70-μ filtro de celdas | m Falcon | 64752 |
Referencias
- Grada, A., Weinbrecht, K. Next-generation sequencing: methodology and application. The Journal of investigative dermatology. 133 (8), 11(2013).
- Whitley, S. K., Horne, W. T., Kolls, J. K. Research techniques made simple....
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Reimpresiones y permisos
