Aquí presentamos un método para obtener imágenes del cerebro embrionario del pez cebra in vivo hasta etapas larvales y juveniles. Este procedimiento microinvasivo, adaptado de enfoques electrofisiológicos, proporciona acceso a detalles celulares y subcelulares de neuronas maduras y se puede combinar con estudios optogenéticos y neurofarmacológicos para caracterizar la función cerebral y la intervención farmacológica.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Imágenes in vivo de tejido cerebral completamente activo en larvas y juveniles de pez cebra despiertos mediante la extirpación del cráneo y la piel
En este artículo
Resumen
Resumen
Comprender los cambios efímeros que ocurren durante el desarrollo y la maduración del cerebro requiere imágenes detalladas de alta resolución en el espacio y el tiempo a resolución celular y subcelular. Los avances en las tecnologías moleculares y de imágenes nos han permitido obtener numerosos conocimientos detallados sobre los mecanismos celulares y moleculares del desarrollo cerebral en el embrión transparente de pez cebra. Recientemente, los procesos de refinamiento de la conectividad neuronal que ocurren en etapas larvales posteriores varias semanas después de la fertilización, que son, por ejemplo, el control del comportamiento social, la toma de decisiones o el comportamiento impulsado por la motivación, se han trasladado al foco de la investigación. En estas etapas, la pigmentación de la piel del pez cebra interfiere con la penetración de la luz en el tejido cerebral, y las soluciones para las etapas embrionarias, por ejemplo, la inhibición farmacológica de la pigmentación, ya no son factibles.
Por lo tanto, se proporciona una solución quirúrgica mínimamente invasiva para el acceso de microscopía al cerebro del pez cebra despierto que se deriva de enfoques electrofisiológicos. En los teleóstos, la piel y el cartílago blando del cráneo se pueden eliminar cuidadosamente mediante la micro-peeling de estas capas, exponiendo las neuronas subyacentes y los tractos axonales sin daño. Esto permite registrar la morfología neuronal, incluidas las estructuras sinápticas y su contenido molecular, y la observación de cambios fisiológicos como transitorios de Ca2+ o eventos de transporte intracelular. Además, es factible el interrogatorio de estos procesos mediante inhibición farmacológica o manipulación optogenética. Este enfoque de exposición cerebral proporciona información sobre los cambios estructurales y fisiológicos en las neuronas, así como la correlación e interdependencia de estos eventos en el tejido cerebral vivo en el rango de minutos u horas. La técnica es adecuada para imágenes cerebrales in vivo de larvas de pez cebra hasta 30 días después de la fertilización, la última etapa de desarrollo probada hasta ahora. Por lo tanto, proporciona acceso a cuestiones tan importantes como el refinamiento sináptico y la escala, el transporte axonal y dendrítico, la orientación sináptica de la carga citoesquelética o la expresión dependiente de la actividad local. Por lo tanto, se puede anticipar un amplio uso para este enfoque de montaje e imágenes.
Introducción
En las últimas décadas, el pez cebra(Danio rerio)ha evolucionado como uno de los organismos modelo de vertebrados más populares para estudios de desarrollo embrionario y larvario. La gran fecundidad de las hembras de pez cebra junto con el rápido desarrollo ex utero del embrión y su transparencia durante las primeras etapas del desarrollo embrionario son solo algunos factores clave que hacen del pez cebra un poderoso organismo modelo para abordar las preguntas del desarrollo1. Los avances en las tecnologías genéticas moleculares combinados con estudios de imágenes in vivo de alta resolución permitieron abordar los mec....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Todo el trabajo con animales descrito aquí está de acuerdo con las regulaciones legales (Directiva UE 2010/63). El mantenimiento y la manipulación de los peces han sido aprobados por las autoridades locales y por el representante de bienestar animal de la Technische Universität Braunschweig.
1. Preparación de líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF), agarosa de baja fusión y agujas de vidrio afiladas
- Prepare el ACSF disolviendo los productos químicos enumerados a las siguientes concentraciones en agua destilada. 134 mM NaCl (58,44 g/mol), 2,9 mM KCl (74,55 g/mol), 2,1 mM CaCl2 (110,99 g/mol), 1,2 mM MgCl2 6x....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Figura 3A,C muestran una larva de 14 dpf de la línea transgénica Tg[-7.5Ca8:GFP]bz12[15] con el cráneo aún intacto. Las células pigmentarias en la piel superpuesta se distribuyen por toda la cabeza y están interfiriendo con la señal de fluorescencia en la región de interés (aquí, cerebelo). Con la larva en esta condición, no es posible obtener imágenes de alta resolución del cerebro.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
El método presentado proporciona un enfoque alternativo para el aislamiento cerebral o el tratamiento de larvas de pez cebra con productos farmacéuticos que inhiben la pigmentación para registrar imágenes de alta resolución de neuronas en su entorno in vivo. La calidad de las imágenes grabadas con este método es comparable a las imágenes de cerebros explantados, pero en condiciones naturales.
Además, se evita una pérdida de intensidad de fluorescencia, ya que no hay necesidad de trata.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos especialmente a Timo Fritsch por el excelente cuidado de los animales y a Hermann Döring, Mohamed Elsaey, Sol Pose-Méndez, Jakob von Trotha, Komali Valishetti y Barbara Winter por su útil apoyo. También estamos agradecidos a todos los demás miembros del laboratorio de Köster por sus comentarios. El proyecto fue financiado en parte por el proyecto de la Fundación Alemana de Investigación (DFG, KO1949/7-2) 241961032 (a RWK) y el Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF; Era-Net NEURON II CIPRESS proyecto 01EW1520 a JCM) es reconocido.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cloruro de calcio | Roth | A119.1 | |
| Confocal Microscopio de barrido láser | Leica | TCS SP8 | |
| d-Glucosa | Sigma | G8270-1KG | |
| d-Tubocurare | Sigma-Aldrich | T2379-100MG | |
| Capilar de vidrio tipo 1 | WPI | 1B150F-4 | |
| Capilar de vidrio tipo 2 | Aparato Harvard | GC100F-10 | |
| Cubreobjetos de vidrio | deltalab D102424 | ||
| HEPES | Roth | 9105.4 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen (Thermo Fischer) | H3570 | |
| Cámara de imagen | Ibidi | 81156 | |
| Cloruro de potasio Normapur | 26764298 | ||
| LM-Agarose | Condalab | 8050.55 | |
| Cloruro de magnesio (hexahidratado) | Cámara | A537.4 | |
| Leica | DFC9000 GTC | ||
| Tirador de agujas tipo 1 | NARISHIGE | Modelo PC-10 | |
| Tirador de agujas tipo 2 | Sutter Instruments | Modelo P-2000 | |
| Pasteur-Pipetas 3ml | A.Hartenstein | 20170718 | |
| Cloruro de sodio | Roth | P029.2 | |
| Hidróxido de sodio | Normapur | 28244262 | |
| Tricain | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Baño de agua | Phoenix Instrument | WB-12 | |
| placa de Petri de 35 mm | Sarstedt | 833900 | |
| Placa de Petri de 90 mm | Sarstedt | 821473001 |
Referencias
- Hill, M. A. Embryology. Zebrafish Development. , Available from: https://embryology.med.unsw.edu.au/embryology/index.php/Zebrafish_Development (2020).
- Sassen, W. A., Köster, R. W. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. Dove Medical Press. 2015 (5), 151-163 (2....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
