Este protocolo ilustra un sistema de dimerización de proteínas inducido químicamente para crear condensados en la cromatina. Se demuestra la formación del cuerpo nuclear de la leucemia promielocítica (LMP) en telómeros con dimerizadores químicos. El crecimiento, la disolución, la localización y la composición de las gotas se controlan con imágenes de células vivas, inmunofluorescencia (IF) e hibridación fluorescente in situ (FISH).
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Artículo de método
Condensados de proteínas inducidas por dimerización química en telómeros
En este artículo
Resumen
Resumen
Los condensados asociados a la cromatina están implicados en muchos procesos nucleares, pero los mecanismos subyacentes siguen siendo difíciles de alcanzar. Este protocolo describe un sistema de dimerización de proteínas inducido químicamente para crear condensados en los telómeros. El dimerizador químico consiste en dos ligandos unidos que pueden unirse a una proteína: Halo ligando a Halo-enzima y trimetoprima (TMP) a E. coli dihidrofolato reductasa (eDHFR), respectivamente. La fusión de la enzima Halo a una proteína telómero ancla los dimerizantes a los telómeros a través de la unión covalente ligando-enzima de Halo. La unión de TMP a eDHFR recluta proteínas de separación de fase fusionadas con eDHFR a telómeros e induce la formación de condensado. Debido a que la interacción TMP-eDHFR no es covalente, la condensación se puede revertir mediante el uso de exceso de TMP libre para competir con el dimerizador para la unión de eDHFR. Se muestra un ejemplo de inducción de la formación de cuerpos nucleares de leucemia promielocítica (LMP) en los telómeros y determinación del crecimiento, disolución, localización y composición del condensado. Este método se puede adaptar fácilmente para inducir condensados en otras ubicaciones genómicas fusionando Halo a una proteína que se une directamente a la cromatina local o a dCas9 que está dirigida al locus genómico con un ARN guía. Al ofrecer la resolución temporal requerida para la obtención de imágenes en vivo de una sola célula mientras se mantiene la separación de fases en una población de células para ensayos bioquímicos, este método es adecuado para sondear tanto la formación como la función de los condensados asociados a la cromatina.
Introducción
Muchas proteínas y ácidos nucleicos se someten a separación de fase líquido-líquido (LLPS) y se autoensamblan en condensados biomoleculares para organizar la bioquímica en las células1,2. LLPS de proteínas de unión a cromatina conduce a la formación de condensados que están asociados con loci genómicos específicos y están implicados en varias funciones locales de cromatina3. Por ejemplo, LLPS de la proteína HP1 subyace a la formación de dominios de heterocromatina para organizar el genoma4,5,LLPS de factores de transcripción for....
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Protocolo
1. Producción de líneas celulares transitorias
- Cultite células aceptoras U2OS en fundas de vidrio de 22 x 22 mm (para imágenes vivas) o cubiertas circulares de 12 mm de diámetro (para IF o FISH) recubiertas con poli-D-lisina en placa de 6 pozos con medio de crecimiento (10% de suero bovino fetal y solución de penicilina-estreptomicina al 1% en DMEM) hasta que alcancen una confluencia del 60-70%.
- Reemplace el medio de crecimiento con 1 ml de medio de transfección (medio de crecimiento sin solución de penicilina-estreptomicina) antes de la transfección.
- Para cada pozo de transfección, agregue 4 μL de reactivo de transfecció....
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Resultados
En la Figura 2se muestran imágenes representativas de localización telomérica de SUMO identificadas por ADN telómero FISH y PROTEÍNA SUMO IF. Las células con reclutamiento de SIM enriquecieron SUMO1 y SUMO 2/3 en telómeros en comparación con las células con reclutamiento de mutantes SIM. Esto indica que el enriquecimiento de SUMO inducido por la dimerización de SIM en telómeros depende de las interacciones SUMO-SIM.
Una película representativa de lapso de tiempo d.......
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Discusión
Este protocolo demostró la formación y disolución de condensados en telómeros con un sistema de dimerización química. La cinética de la separación de fases y la agrupación de telómeros inducida por la fusión de gotas se monitorean con imágenes en vivo. La localización y composición del condensado se determinan con ADN FISH y proteína IF.
Hay dos pasos críticos en este protocolo. El primero es determinar la concentración de proteínas y dimerizantes. El éxito en la inducción de la separación de .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos (1K22CA23763201 a H.Z., GM118510 a D.M.C.) y la fundación Charles E. Kaufman a H.Z. Los autores desean agradecer a Jason Tones por revisar el manuscrito.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,25 % de tripsina, 0,1 % de EDTA en HBSS sin bicarbonato de calcio, magnesio y sodio | Corning | MT25053CI | |
| 16 % de formaldehído (p/v), sin metanol | Thermo Scientific | 28906 | Prepare el 1 % en 1x PBS |
| Placa de cultivo de 6 pocillos | VWR | 10861-554 | |
| Papel de aluminio | Fisher Scientific | 01-213-101 | |
| Anticuerpo anti-mCherry | Abcam | Ab183628 | |
| Anticuerpo anti-PML | Santa Cruz | sc966 | |
| Anticuerpo anti-SUMO1 | Abcam | Ab32058 | |
| Anticuerpo anti-SUMO2/3 | Citoesqueleto | Asm23 | |
| Reactivo bloqueante | Roche | 11096176001 | |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | Fisher Scientific | BP9706100 | |
| Tubo BTX micro 1.5ML | VWR | 89511-258 | |
| Cubreobjetos circulares | Thermo Scientific | 3350 | |
| Nikon | MQS31000 | ||
| DAPI | Fisher Scientific | D1306 | |
| Dimethyl Sulphoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| DMEM con L-Glutamina, 4,5 g/L de glucosa y piruvato de sodio | Corning | MT10017CV | |
| EMCCD Camera | iXon Life | 897 | |
| Etanol Fisher Scientific | 4355221 | ||
| Suero Fetal Bovino, Calificado, Regiones Aprobadas por el USDA | Gibco | ||
| Formamida, MilliporeSigma Desionizado | 46-101-00ML | ||
| Cabra anti-Ratón IgG (H + L), Anticuerpo secundario recombinante, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A28181 | |
| IgG anti-conejo para cabras (H + L), anticuerpo secundario recombinante, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A32733 | |
| Pinzas/pinzas de punta ultrafina cónicas rectas de alta precisión | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Módulo de fusión láser | Nikon | NIIMHF47180 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 21083027 | |
| Lipofectamine 2000 Reactivo de transfección | Invitrogen | 11668027 | |
| Software de trazado de figuras, MATLAB | The MathWorks | ||
| Microscope Slide Box | Fisher Scientific | 34487 | |
| Esmalte de uñas | Fisher Scientific | 50-949-071 | |
| Software de imagen, NIS-Elements | Nikon | ||
| Opti-MEM Medios de suero reducidos | Gibco 51985091 | ||
| Parafilm | Bemis | 13-374-12 | |
| PBS 10X, pH 7.4 | Fisher Scientific | 70-011-044 | |
| Solución de penicilina-estreptomicina,100X | Gibco | 15140122 | |
| piezo Z-Drive | Physik Instrumente (PI) | 91985 | |
| Puntas de pipeta | VWR | 10017 | |
| Portaobjetos de microscopio de esquina recortada lisos y esmerilados | Fisher Scientific | 22-037-246 | |
| Solución de poli-D-lisina | Sigma-Aldrich | A-003-E | |
| Azida sódica | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Disco giratorio | Yokogawa | CSU-X1 | |
| Cubreobjetos cuadrados | Thermo Scientific | 3305 | |
| TBS 10x solución | Fisher Scientific | BP2471500 | |
| TelC-Alexa488 | PNA Bio | F1004 | |
| TMP | Sintetizado por el laboratorio | Disponible bajo pedido | |
| TNH | Sintetizado por el laboratorio Chenoweth Disponible | bajo pedido | |
| Tris Solución | Fisher Scientific | 92-901-00ML | |
| Triton X-100 10% Solución | MilliporeSigma | 64-846-350ML | Prepare 0.5% en 1x línea celular PBS |
| U2Os | Del laboratorio E.V. Makayev (Universidad Tecnológica de Nanyang, Singapur) | HTB-96 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | NC9524612 |
Referencias
- Shin, Y., Brangwynne, C. P. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science. 357 (6357), (2017).
- Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nature Reviews Molecular Cell Biology<....
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Reimpresiones y permisos
