Summary
Hier presenteren we een protocol om de CLARITY-methode van de hersenweefsels aan te passen voor volledig gemonteerde retinas om de kwaliteit van standaard immunohistochemische kleuring en hoge resolutie beeldvorming van retinale neuronen en hun subcellulaire structuren te verbeteren.
Abstract
De weefselhydrogeldelipidatiemethode (CLARITY), oorspronkelijk ontwikkeld door het Deisseroth-laboratorium, is gewijzigd en wordt veel gebruikt voor immunostaining en beeldvorming van dikke hersenmonsters. Deze geavanceerde technologie is echter nog niet gebruikt voor volledig gemonteerde retina's. Hoewel het netvlies gedeeltelijk transparant is, beperkt de dikte van ongeveer 200 μm (bij muizen) nog steeds de penetratie van antilichamen in het diepe weefsel en vermindert het de lichtpenetratie voor beeldvorming met hoge resolutie. Hier hebben we de CLARITY-methode voor het netvlies van de muis in zijn geheel aangepast door ze te polymeriseren met een acrylamidemonomeer om een nanoporeuze hydrogel te vormen en ze vervolgens te verwijderen in natriumdodecylsulfaat om eiwitverlies te minimaliseren en weefselschade te voorkomen. CLARITY-verwerkte retinas werden immunostained met antilichamen voor retinale neuronen, gliacellen en synaptische eiwitten, gemonteerd in een refractieve index matching oplossing, en afgebeeld. Onze gegevens tonen aan dat CLARITY de kwaliteit van standaard immunohistochemische kleuring en beeldvorming voor retinale neuronen en gliacellen in de hele montering kan verbeteren. Bijvoorbeeld, 3D-resolutie van fijne axon-achtige en dendritische structuren van dopaminerge amacrine cellen werden veel verbeterd door CLARITY. In vergelijking met niet-verwerkte retina's met hele monturen kan CLARITY immunostaining onthullen voor synaptische eiwitten zoals postsynaptisch dichtheidseiwit 95. Onze resultaten tonen aan dat CLARITY het netvlies optisch transparanter maakt na het verwijderen van lipiden en fijne structuren van retinale neuronen en hun eiwitten behoudt, die routinematig kunnen worden gebruikt voor het verkrijgen van beeldvorming met hoge resolutie van retinale neuronen en hun subcellulaire structuren in de voorbereiding van de hele berg.
Introduction
Het gewervelde netvlies is misschien wel het meest toegankelijke deel van het centrale zenuwstelsel (CZS) en dient als een uitstekend model voor het bestuderen van de ontwikkeling, structuur en functie van de hersenen. Vijf klassen neuronen in het netvlies zijn verdeeld in drie nucleaire lagen gescheiden door twee plexivormlagen. De buitenste kernlaag (ONL) bestaat uit klassieke fotoreceptoren (staven en kegels) die licht omzetten in elektrische signalen. Elektrische signalen worden verwerkt door neuronen in de binnenste nucleaire laag (INL), waaronder bipolaire, horizontale en amacrinecellen, en vervolgens overgebracht naar retinale ganglioncellen (RGCs) in de ganglioncellaag (GCL). RGC's zijn de outputneuronen van het netvlies, waarbij de axonen naar de hersenen projecteren om bij te dragen aan beeldvormende en niet-beeldvormende visuele functie. Bovendien leveren drie soorten gliacellen (Muller-cellen, astroglia en microglia) voedingsstoffen aan neuronen en beschermen neuronen tegen schadelijke veranderingen in hun extracellulaire omgeving.
Een gespecialiseerde subpopulatie van amacrinecellen produceert en geeft dopamine vrij, een belangrijke neuromodulator in het CZS, die retinale neurale circuits herconfigureert tijdens lichtaanpassing1,2. Dopaminerge amacrinecellen (DAC's) hebben een uniek kenmerk van morfologische profielen. Hun somata bevinden zich in de proximale INL met dendrieten die rammen in het meest distale deel van de binnenste plexivormlaag (IPL). Axon-achtige processen van DAC's zijn ongemyelineerd, dun en lang, schaars vertakt en dragen spataderen (de plaatsen van dopamine-afgifte). Ze vormen een dichte plexus met dendrieten in de IPL, inclusief ringachtige structuren rond de somata van AII amacrinecellen. De axonen lopen ook door de INL naar de OPL en vormen een centrifugale route over het netvlies3. We hebben aangetoond dat DAC-processen receptoren uitdrukken als reactie op glutamaatafgifte uit presynaptische neuronen, waaronder bipolaire cellen en intrinsiek lichtgevoelige retinale ganglioncellen (ipRGCs)4,5,6. Het is echter onduidelijk of glutamaatreceptoren zich uitdrukken op de axonen, dendrieten of beide, omdat ze zijn afgesneden in verticale retinale secties en niet van elkaar kunnen worden onderscheiden5,6. Immunostaining moet worden uitgevoerd in volledig gemonteerde netvliezen om driedimensionale vertakking van DAC's en de aanwezigheid van glutamaatreceptoren op subcellulaire compartimenten aan het licht te komen. Hoewel het netvlies relatief transparant is, is de dikte van een muis volledig gemonteerd netvlies ongeveer 200 μm, wat de penetratie van antilichamen in het diepe weefsel beperkt en de lichtpenetratie vermindert voor beeldvorming met hoge resolutie als gevolg van weefsellichtverstrooiing. Om deze beperkingen te overwinnen, hebben we de immunostaining compatibele weefselhydrogel delipidatiemethode (CLARITY) die onlangs is ontwikkeld voor dikke hersensecties, aangepast aan het netvlies van de muis7.
De CLARITY-methode is oorspronkelijk ontwikkeld door het Deisseroth-laboratorium voor immunostaining en beeldvorming van dikke hersenmonsters7. Het maakt gebruik van een sterk reinigingsmiddel, natriumdodecylsulfaat (SDS) en elektroforese om de lipidecomponenten te verwijderen (die weefsellichtverstrooiing veroorzaken), waardoor de eiwitten en nucleïnezuren op hun plaats blijven. De verwijderde lipiden worden vervangen door een transparante steiger bestaande uit hydrogelmonomeren zoals acrylamide ter ondersteuning van de resterende eiwitstructuur. Het gewiste weefsel kan worden geëtiketteerd via immunohistochie en afgebeeld met aanzienlijk verhoogde lichtpenetratiediepte door het weefsel (tot enkele millimeters onder het weefseloppervlak). Sindsdien is de CLARITY-methode geoptimaliseerd en vereenvoudigd door verschillende onderzoeksgroepen8,9,10. Een gewijzigd CLARITY-protocol maakt gebruik van een passieve clearingtechniek om de mogelijke weefselschade veroorzaakt door elektroforese te voorkomen voor het opruimen van de hele hersenen en andere intacte organen11. Deze methode is echter nog niet toegepast op retina's met hele montering. Hier hebben we de passieve CLARITY-techniek voor volledig gemonteerde retina's aangepast om ze transparanter te maken voor immunohistochie en beeldvorming. We ontdekten dat een meerderheid van de geteste retinale eiwitten tijdens dit proces werd bewaard voor immunohistochgie. Met behulp van de refractieve index matching oplossing, waren we in staat om retinale neuronen in beeld te brengen over de ongeveer 200 μm dikte van de ONL naar de GCL in hele retinas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Muizenzorg en alle experimentele procedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de National Institutes of Health voor proefdieren en werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committees van Oakland University (protocol nr. 18071).
OPMERKING: De namen van de oplossingen en hun samenstellingen zijn opgenomen in tabel 1.
1. Weefselvoorbereiding
- Euthanaseer de muis met een overdosis CO2,gevolgd door cervicale dislocatie.
- Maak de ogen met gebogen tangen en breng ze over in een kleine petrischaal met 0,1 M PBS (tabel 1). Prik onder een dissectiemicroscoop een klein gaatje langs de hoornvlies-sclera-verbinding met een naald. Breng gedurende 1 uur over op 4% paraformaldehyde (PFA).
- Breng het oog terug naar een schaal met PBS. Gebruik onder een dissectiemicroscoop een dissectieschaar om helemaal rond de hoornvlies-sclera-kruising te snijden. Verwijder het hoornvlies en de lens. Snijd aan de basis van de oogzenuw en pel de sclera voorzichtig af met een tang om het netvlies te isoleren.
- Maak vier kleine sneetjes gelijkmatig rond het netvlies en gebruik een fijne tipborstel gedrenkt in PBS om het plat (GCL-kant naar beneden) in een klaverachtige vorm op een kleine vierkante snede van nitrocellulosefilterpapier te leggen om het netvlies te stabiliseren.
- Breng het netvlies over met een tang om de hoek van het nitrocellulosepapier vast te houden (zonder het gemonteerde netvlies aan te raken) en plaats het gedurende 1 uur in een 48-putplaat met 4% PFA.
- Breng het filterpapier en netvlies over in een put met PBS en was (elk 3x gedurende 5 min).
- Breng over naar A4P0 (tabel 1) en incubeer 's nachts bij 4 °C met zachte agitatie.
- Pipet plantaardige olie in de put om de A4P0-oplossing volledig te bedekken. Incubeer gedurende 3 uur in een waterbad bij 40 °C zonder te schudden.
- Was (3x voor elk 5 min) in PBS en zorg ervoor dat alle olie is afgespoeld. Gebruik indien nodig een pipet om de resterende olie voorzichtig van de bovenkant van de put te verwijderen voordat u de laatste spoeling laat doen.
- Incubeer in 10% SDS bij 40 °C gedurende twee dagen met zacht schudden. Vervang SDS door verse oplossing op de tweede dag.
- Breng het filterpapier en netvlies over naar PBS met Triton-X-100 (PBST, tabel 1)en was (elk 5x gedurende 1,5 uur).
- Bewaren bij 4 °C in PBST met 0,01% natrium azide (NaN3) of direct overgaan op immunostaining.
2. Immunostaining en brekingsindex matching
- Verwijder het netvlies van het filterpapier door het voorzichtig af te pellen met een fijnpenseel in PBST.
- Incubeer het netvlies in primair antilichaam (Tabel 2) verdund in blokkeeroplossing (Tabel 1) gedurende 2 dagen bij 40 °C met zacht schudden.
- Wassen (5x, elk 1,5 uur) in PBST.
- Incubeer met de juiste secundaire antilichamen (tabel 3) verdund in blokkeeroplossing gedurende 2 dagen bij 40 °C met zacht schudden en beschermen tegen licht gedurende de rest van de procedure.
- Wassen (5x, elk 1,5 uur) in 0,02 M fosfaatbuffer (zie tabel 1).
- Incubeer in sorbitol-gebaseerde Refractive Index Matching Solution (sRIMS, zie tabel 1) bij 40 °C 's nachts met zacht schudden.
3. Montage
- Omlijn een glazen afdeklip van 18 mm x 18 mm x 1,5 mm met een permanente markering met fijne punt om een vierkante grens op de achterkant van een glasmicroscoopschuif te markeren.
- Draai de schuif om en gebruik een spuit om de grens te traceren met een dunne lijn siliconenvet aan de voorkant van de glijbaan, waardoor er een kleine opening in een hoek overblijft om overtollige montageoplossing te ontsnappen.
- Breng het netvlies over naar het midden van het begrensde gebied en schik met een borstel met fijne punt zodat het plat ligt met de fotoreceptorzijde tegen de glazen schuif.
- Pipetteer ongeveer 60 μL sRIMS zodat het het afgeplatte netvlies bedekt en zich uitstrekt tot een hoek van de behuizing, waarbij ervoor wordt gezorgd dat het netvlies plat en op zijn plaats blijft.
- Breng de afdeklip vanaf de hoek aan met de sRIMS en laat deze langzaam zakken totdat deze het vet aan alle kanten raakt, waardoor de vorming van luchtbellen wordt vermeden.
- Plaats een stapel van 3 coverslips aan elke kant van het gemonteerde netvlies als een afstandsruimte. Gebruik de lange rand van een andere dia om de afdeklip naar beneden te drukken, zodat de houder vlak en gelijkmatig is.
- Bewaar dia's plat bij 4 °C tot beeldvorming.
4. Beeldvorming
- Beeldmonsters op een conventionele fluorescentiemicroscoop of een confocale microscoop(tabel met materialen). Begin met het plaatsen van de dia op het microscoopstadium en het lokaliseren van het monster.
OPMERKING: Als een omgekeerde objectieve microscoop wordt gebruikt, plaatst u de schuif ondersteboven op het podium en zorgt u er eerst voor dat de blootgestelde delen van de glijbaan vrij zijn van alle siliconenvet en montageoplossing. - Om z-gestapelde beelden van co-gelabelde monsters te verkrijgen, richt u eerst op het signaal in elk kanaal afzonderlijk en stelt u de belichtingstijd of scansnelheid in, respectievelijk voor fluorescentie- of confocale microscopen.
- Stel het bereik voor de z-stack in door het brandpuntsvlak handmatig in te stellen aan de boven- en onderkant van het gewenste bereik, of door het middelpunt in te stellen en vervolgens een bereik rond het middelpunt op te geven.
- Pas de stapgrootte of het aantal segmenten naar wens aan.
- Leg de afbeelding vast en sla het oorspronkelijke bestand op en exporteert het als een TIFF-bestand of een ander gewenst formaat.
5. Beeldanalyse
- Gebruik de beeldanalysesoftware naar keuze (Table of Materials) om de helderheid en het contrast in elk kanaal aan te passen totdat optimale helderheid wordt bereikt in zowel de enkele beelden als de 3-dimensionale weergave van de z-stack.
OPMERKING: Als de geselecteerde stapgrootte voldoende klein is, kan ook 3D-deconvolutie worden uitgevoerd om het signaal te verbeteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gemodificeerde CLARITY-verwerkte retina's zijn optisch transparant weefsel.
Om een weefselophelderingsmethode te formuleren die compatibel is met immunohistochemische toepassingen in het netvlies, terwijl het voldoende delipidatie biedt en de structurele integriteit van de cellulaire eiwitten behoudt, hebben we de CLARITY-weefselopruimingsmethode aangepast aan het netvlies van de muis. We konden het protocol vereenvoudigen en wijzigen voor retina's met hele bevestiging (zie Protocol). Na voltooiing van weefselhybrideisatie, clearing en refractieve indexmatching vertoonden retina's die met dit gewijzigde CLARITY-protocol werden verwerkt bijna volledige optische transparantie over de dikte van het netvlies (figuur 1A) in vergelijking met niet-verwerkte controle-netvlies (figuur 1B). Dit resultaat geeft aan dat deze wijziging van het CLARITY-protocol voldoende ontruimd retinaweefsel met hele montering biedt.
Verbeterde 3D-beeldvorming van neuronen in gemodificeerde CLARITY verwerkte retina's.
Om de kwaliteit en bruikbaarheid van immunohistochemische kleuring te beoordelen die deze aangepaste CLARITY-methode biedt, hebben we CLARITY verwerkt netvlies gekleurd met verschillende primaire antilichamen (Tabel 2). Deze antilichamen markeren elk belangrijk celtype in het netvlies: kegelfotoreceptoren, staafbipolaire cellen, amacrinecellen, RGC's en gliacellen, evenals antilichamen tegen subcellulaire synaptische eiwitten. Met uitzondering van de celactiviteitsmarker phospho-S6 (pS6) bleken alle geteste antilichamen compatibel met CLARITY. Typische voorbeelden worden geïllustreerd in figuur 2. We voerden triple labeling uit met antilichamen tegen cone arrestin, tyrosine hydroxylase (TH) en RNA-Binding Protein with Multiple Splicing (RBPMS). We namen een serie z-stack confocale microscopie beelden van de ONL naar de GCL. Individuele afbeeldingen toonden de arrestine gelabelde kegels in de ONL (Figuur 2A), TH-gelabelde DAC's in de INL (Figuur 2B) en RBPMS-gemarkeerde RGCs in de GCL (Figuur 2C). Een overlay-afbeelding onthulde de relatieve locatie van deze neuronen over de volledige dikte van het netvlies (Figuur 2D). Deze resultaten suggereren dat CLARITY de kwaliteit van veel standaard immunohistochemische kleuring kan verbeteren en duidelijk de 3D-structuur van neuronen over de volledige dikte van het netvlies in hele vatende preparaten kan onthullen.
Modified CLARITY biedt een verbeterde 3D-resolutie van fijne processen van retinale neuronen en synaptische eiwitten.
We hebben verder TH-kleuring geanalyseerd in CLARITY-verwerkte whole-mount retinas(figuren 3A,B)en vergeleken deze met beeldvorming verkregen uit standaard whole-mount voorbereiding(figuren 3C, D). Confocale beelden laten zien dat dendrieten en axonachtige processen van DAC's veel duidelijker werden onthuld in een HELDER verwerkt netvlies (Figuur 3A) dan in een standaard netvlies (Figuur 3C). Axonachtige processen van DAC's vertoonden met name completere ringachtige structuren in een CLARITY-netvlies (zie een insert in figuur 3A) dan in een standaard retina (zie een insert in figuur 3C). Met name ringachtige structuren van een CLARITY-netvlies die werden genomen met fluorescentiemicroscopie (figuur 3B) waren bijna identiek aan die waargenomen met confocale (figuur 3A). Bovendien liepen axonachtige processen ook naar het buitenste netvlies, wat werd waargenomen in X-Z-georiënteerde beelden (figuur 4A). Deze gegevens suggereren dat CLARITY kan worden gebruikt om axon-achtige processen van DAC's in volledig gemonteerde retina's te identificeren, zelfs met behulp van conventionele fluorescentiemicroscopie.
Toen de AMPA-receptor subeenheid GluA2 en postsynaptische dichtheid eiwit 95 (PSD-95) werden onderzocht in standaard whole-mount retinas, werden geen van beide gedetecteerd, waarschijnlijk als gevolg van een slechte penetratie van antilichamen tegen deze synaptische eiwitten in het diepe netvlies. Om te bepalen of CLARITY-verwerkte retinas deze antilichamen toestaan tegen immunostain synaptische eiwitten, hebben we TH drievoudig gelabeld met de subeenheid GluA2 en PSD-95. Immunostaining tegen GluA2 en PSD-95 vertoonde verschillende puncta die individuele GluA2-bevattende AMPA-receptoren (figuur 4B) en putatieve postsynaptische sites (figuur 4C) onthulde. Een overlay-afbeelding toonde enkele puncta zichtbaar op DAC-processen (Figuur 4D). We stelden een punt van putatieve colocalisatie voor met alle drie de vlekken en presenteerden het in 3D-weergaven (figuur 5). Vanuit alle drie de weergavencolocaliseerde TH duidelijk met zowel GluA2 als PSD-95 (Figuur 5 A-C). Deze 3D-perspectiefresultaten van volledig gemonteerde retinas valideren onze eerdere rapporten van synaptische expressie van GluA2-bevattende AMPA-receptoren op DAC-processen in verticale retinale segmenten5,6.
Figuur 1. CLARITY zorgt voor optisch transparant weefsel. Het hele netvlies van de muis werd verwerkt met de aangepaste CLARITY-methode (zie Protocol) en het hele netvlies werd afgebeeld met een dissectiemicroscoop, bedekt met een vierkant raster van 0,67 cm om schaal weer te geven. A: CLARITY-verwerkt geheel-mount netvlies, met rasterlijnen duidelijk zichtbaar door het transparante weefsel. Pijlen baken de plaatsing van het netvlies af. B: Niet-CLARITY-verwerkt controle retina, bevestigd in PFA gedurende 1 uur en geïncubeerd in PBS. Rasterlijnen worden verduisterd door de relatieve dekking van het weefsel. Schaalbalk: ongeveer 2 mm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Verbeterde 3D-beeldvorming van neuronen over de dikte van het netvlies in helder verwerkte retinas. Whole-mount CLARITY retinas werden immunostained met antilichamen tegen cone arrestin, TH en RBPMS. Afbeelding vertegenwoordigt een 3D-volumeweergave van een z-gestapelde confocale afbeelding, weergegeven in een X-Z-oriëntatie. A: Cone photoreceptors (pijl) gelabeld door cone arrestin (blauw). Een lichte spikkel is zichtbaar in het binnenste netvlies (pijlpunten), waarschijnlijk als gevolg van achtergrondkleuring. B: DAC soma en dendrieten (pijl) gelabeld met TH (rood). Pijlpunten duiden op retinale bloedvaten in het binnenste netvlies, zichtbaar als gevolg van de multi-label immunostaining. C: RGC somata (pijl) gelabeld door RBPMS (groen). Pijlpunten geven aan dat retinale bloedvaten zichtbaar zijn als gevolg van autofluorescentie en niet-specifieke kleuring van bloedvaten. D: Samengevoegde afbeelding van de triple gelabelde kleuring, die de relatieve plaatsing van deze neuronen over de dikte van het netvlies onthult, met kegelfotoreceptoren in de buitenste nucleaire laag, DAC's in de binnenste nucleaire laag en RGC's in de ganglioncellaag. De schaal van de volumeweergave is gemarkeerd in stappen van 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. CLARITY onthult fijne structuren van DAC-morfologie. TH immunostaining werd uitgevoerd in CLARITY-verwerkte (A en B) en standaard (C en D) retinas. Z-gestapelde beelden werden genomen met confocale (A en C) en fluorescentiemicroscopie (B en D). Een insert van een enkel optisch vlak in elke afbeelding markeert ringachtige structuren die vermoedelijk zijn gevormd door axonachtige processen. Pijlpunten duiden op DAC somata, en veel ringachtige structuren zijn zichtbaar (voorbeelden worden aangegeven door pijlen) in de dichte plexus van dendrieten en axonachtige processen die worden onthuld in HELDER-verwerkte retinas (A en B). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4. Modified CLARITY zorgt voor een verbeterde 3D-resolutie van fijne dendritische structuren en synaptische eiwitten. Triple immunostaining werd uitgevoerd in CLARITY-verwerkte whole-mount retinas met antilichamen tegen TH, GluA2 en PSD-95. Een volumeweergave werd gereconstrueerd uit z-gestapelde confocale beeldvorming en gepresenteerd in een schuine X-Z-oriëntatie. A: TH-gelabelde DAC somata (pijlpunten) in de binnenste nucleaire laag en processen (gele pijlen) stratificeren in de distale binnenste plexivormlaag (rood). Witte pijlen duiden op centrifugale processen die zich uitstrekken naar het buitenste netvlies. B: Dichte punctaatexpressie van GluA2-bevattende AMPA-receptoren over de binnenste plexivormlaag (groen). Pijl duidt op autofluorescentie van een netvliesbloedvat. C: Puncta onthult post-synaptische sites gelabeld door PSD-95 in de binnenste plexivormlaag (blauw). Pijlen geven bloedvaten aan, duidelijk door het gebruik van een monoklonaal antilichaam van de muis tegen PSD-95. D: Overlay-afbeelding die overlapping van de DAC-processen met TH-label demonstreert met de expressie van GluA2 en PSD-95. De schaal van de volumeweergave is gemarkeerd in stappen van 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5. Synaptische expressie van GluA2-bevattende AMPA-receptoren op DAC's. Een punt van putatieve drievoudige colocalisatie van TH, GluA2 en PSD-95 in figuur 4 werd geselecteerd en onderzocht in 3D. A1 vertegenwoordigt een segment van een DAC-proces (rood) in de X-Z-oriëntatie (A5). A2 en A3 tonen een enkele GluA2 punctum (groen) en PSD-95 punctum (blauw), respectievelijk, in dezelfde richting. De samengevoegde afbeelding (A4) demonstreert drievoudige colocalisatie van TH, GluA2 en PSD-95 (pijl). B1-B4 toont hetzelfde punt van colocalisatie (pijl) in een Y-Z-richting (B5). C1-C4 tonen colocalisatie van hetzelfde punt (pijl) in het X-Y vlak (C5). Drievoudige colocalisatie is duidelijk zichtbaar in elke oriëntatie. Schaalbalk: 2 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| oplossing | compositie | Notities |
| 0,1 M PBS | 137 mM NaCl | Stel de pH in op 7,4 |
| 26,8 mM KCl | ||
| 10,1 mM Na2HPO4 | ||
| 17,6 mM KH2PO4 | ||
| A4P0 | 4% acrylamide | Bereid je voor op ijs, aliquot en bewaar bij -20 ºC |
| 0,25% VA-044 | ||
| 0,1 M PBS | ||
| PBST | 0,1% (v/v) Triton-X-100 | |
| 0,1 M PBS | ||
| Blokkeringsoplossing | 2% NDS of 1% BSA | |
| 0.01% NaN3 | ||
| PBST | ||
| 0,1 M Fosfaatbuffer | 11,93 g Na2HPO4/liter | Stel de pH in op 7,5 |
| 15,34 g NaH2PO4/liter | ||
| ddH2O | ||
| sRIMS | 70% sorbitol | Stel de pH in op 7,5 met NaOH |
| 0,1% tween-20 | ||
| 0.01% NaN3 | ||
| 0,02 M fosfaatbuffer | ||
Tabel 1. Samenstelling van oplossingen.
| antistof | IHC | gastheer | Verdunning | catalogus # | leverancier | Ab-register-ID | doel |
| Blauwgevoelige opsin | +3 | Geitenpolyklonaal | 1:1000 | Sc-14363 | Santa Cruz Biotechnologie | AB_2158332 | S-kegel |
| Kegel arrestin | +2 | Konijn polyklonaal | 1:1000 | AB15282 | EMD Millipore | AB_1163387 | kegel |
| Eiwitkinase C-alfa (PKC-α) | +3 | Konijn polyklonaal | 1:1000 | SC-208 | Santa Cruz Biotechnologie | AB_2168668 | Staaf bipolaire cel |
| Gliafibrillair zuur eiwit (GFAP) | +3 | Geitenpolyklonaal | 1:500 | Sc-6170 | Santa Cruz Biotechnologie | AB_641021 | Astrocyt |
| Tyrosine hydroxylase (TH) | +3 | Schapen polyklonaal | 1:500 | AB1542 | EMD Millipore | AB_90755 | Dopaminerge amacrinecel |
| Tyrosine hydroxylase (TH) | +2 | Konijn polyklonaal | 1:500 | OPA1-04050 | ThermoVisser | AB_325653 | Dopaminerge amacrinecel |
| Choline acetyltransferase (ChAT) | +1 | Geitenpolyklonaal | 1:500 | AB144P | EMD Millipore | AB_2079751 | Starburst amacrine cel |
| RNA-bindend eiwit met meervoudige splicing (RBPMS) | +1 | Cavia polyklonaal | 1:2000 | ABN1376 | EMD Millipore | AB_2687403 | Retinale ganglioncel |
| GluA2 | +3 | Konijn polyklonaal | 1:500 | AB1768-I | EMD Millipore | AB_2247874 | Ca2+-ondoordringbare AMPA-receptor |
| GluA2 | +2 | Muis monoklonaal | 1:250 | MABN1189 | EMD Millipore | AB_2737079 | Ca2+-ondoordringbare AMPA-receptor |
| Postsynaptische dichtheid eiwit 95 (PSD-95) | +3 | Muis monoklonaal | 1:1000 | 75-028 | NeuroMab | AB_2877189 | Synaptische sites |
| Phospho-S6 (pS6) | 0 | Konijn polyklonaal | 1:500 | 44-923G | ThermoVisser | AB_2533798 | Celactiviteitsmarkering |
Tabel 2. Samenvatting van de geteste primaire antilichamen. IHC legende: +3 = consistente, zeer specifieke kleuring; +2 = consistent goede kleuring, minimale achtergrond; +1 = goede kleuring, wat achtergrond; 0 = onverenigbaar met CLARITY.
| gastheer | Doelsoorten | conjugeren | Verdunning | leverancier |
| ezel | Anti-schapen | Alexa Fluor 568 | 1:500 | Invitrogen |
| ezel | Anti-schapen | Alexa Fluor 594 | 1:500 | Invitrogen |
| ezel | Anti-konijn | Alexa Fluor 488 | 1:500 | Invitrogen |
| ezel | Anti-konijn | Alexa Fluor 594 | 1:500 | Invitrogen |
| geit | Anti-konijn | Alexa Fluor 647 | 1:500 | Invitrogen |
| ezel | Anti-muis | Alexa Fluor 488 | 1:500 | Invitrogen |
| ezel | Anti-muis | Alexa Fluor 647 | 1:500 | Invitrogen |
| ezel | Anti-geit | Alexa Fluor 568 | 1:500 | Invitrogen |
| ezel | Anti-geit | Alexa Fluor 594 | 1:500 | Invitrogen |
| geit | Anti-cavia | Alexa Fluor 488 | 1:500 | Invitrogen |
Tabel 3. Samenvatting van de geteste secundaire antilichamen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wijziging van het CLARITY-protocol voor retina's met hele montering.
We hebben het CLARITY-protocol vereenvoudigd om adequate polymerisatie te bereiken zonder dat er een vacuümevacuatie- of uitdrogingskamer nodig is, zoals wordt gebruikt in de meeste eerdere studies7,9,11. Het polymerisatieproces wordt geremd door zuurstof, waardoor het monster tijdens de polymerisatiestap van het protocol uit de lucht moet worden geïsoleerd. In plaats van te ontgassen met stikstof, ontdekten we echter dat het bedekken van het monster met olie het monster voldoende heeft geïsoleerd om polymerisatie mogelijk te maken zonder de rest van het protocol nadelig te beïnvloeden na een grondige spoeling, zoals eerder gedocumenteerd12. We hebben het protocol verder vereenvoudigd met een passieve clearingmethode om het risico op weefselbruining en schade aan weefselstructuur geassocieerd met elektroforetische clearing te beperken11. De passieve clearing wordt versneld door zachte agitatie en verhoogde temperatuur, waardoor volledige weefselopruiming in slechts twee dagen mogelijk is. Gedurende deze periode wordt voldoende delipidatie bereikt om te resulteren in optisch transparant weefsel terwijl het verlies van eiwitten en andere biomoleculen die integraal deel uitmaken van de cellulaire structuur en immunohistochemische kleuring wordt geminimaliseerd.
CLARITY behoudt eiwitten van retinale neuronen en gliacellen in hele vaten.
Onze resultaten laten zien dat bijna alle geteste antilichamen werken in CLARITY verwerkte retinas. Deze antilichamen markeren fotoreceptoren, bipolaire cellen, amacrinecellen, RGC's en gliacellen. Hoewel we niet in staat waren om antilichamen te testen voor subtypes van elke klasse van retinale neuronen, impliceren onze resultaten dat CLARITY verwerkte retinas kunnen worden gebruikt voor de meerderheid van cellulaire markers in het netvlies. Hoewel de meeste antilichamen die we hebben getest ook retinale neuronen in niet-CLARITY verwerkte retinas kunnen immunostain, ontdekten we dat CLARITY voldoende antilichaampenetratie in het diepe weefsel van het netvlies mogelijk maakte, wat een goede specificiteit van kleuring in de middelste laag van het netvlies mogelijk maakte. Bovendien ontdekten we dat CLARITY de lichtpenetratie over de dikte van het netvlies verbeterde, waardoor lichtverstrooiing werd verminderd en beeldvorming met hoge resolutie door zelfs de diepste lagen mogelijk werd. Deze factoren dragen bij tot een verbetering van zowel de kleuring als de beeldvorming in de CLARITY-verwerkte retinas met hele montering in vergelijking met niet-CLARITY-standaard IHC13. De verminderde achtergrond en verbeterde 3D-beeldvorming en volumeweergaven maken een volledig onderzoek van cellulaire structuren in alle lagen over de dikte van het netvlies mogelijk.
CLARITY onthult fijne processen en synaptische structuur van DAC's in volledig gemonteerde retina's.
Onze resultaten tonen aan dat ringachtige structuren en centrifugale processen van DAC's beter worden onthuld in CLARITY-verwerkt dan in niet-CLARITY whole-mount retinas. Met name immunostaining met CLARITY-verwerkt weefsel zorgt voor een goede resolutie van deze fijne structuren, zelfs met standaard fluorescentiemicroscopie zonder confocale beeldvorming. Gezien het belang van DAC's in de visuele functie, kan het CLARITY-preparaat worden gebruikt om de structuren van DAC's in normale retina's en morfologische veranderingen onder zieke omstandigheden te onderzoeken.
Bij immunostaining voor PSD-95 en GluA2 met standaard wholemount weefsel, zagen we weinig tot geen etikettering van deze subcellulaire structuren in de diepe lagen van het netvlies, wat wijst op een slechte antilichaampenetratie. De toepassing van het CLARITY-protocol maakt een duidelijke kleuring van deze eiwitten in de binnenste netvlieslagen mogelijk, wat wijst op een verbeterde antilichaampenetratie in het diepe weefsel. Onze resultaten tonen aan dat CLARITY de detectie van synaptische eiwitten op DAC-processen in volledig gemonteerde retinas mogelijk maakt, wat normaal gesproken wordt waargenomen in verticale plakpreparaten6. Aangezien axon-achtige processen niet kunnen worden onderscheiden van dendrieten in verticale segmenten, bieden CLARITY whole-mount retinas de mogelijkheid om te bepalen of synaptische invoer van DAC's van andere neuronen zoals bipolaire cellen en ipRGC's voorkomt in dendrieten, axonachtige processen of beide5,6. Aangezien AMPA-receptoren en PSD-95-eiwitten op grote schaal worden gedistribueerd over de IPL, is de expressie van deze eiwitten op DAC's een uitstekend voorbeeld voor CLARITY retinas die moeten worden gebruikt voor de identificatie van synaptische eiwitten in andere retinale neuronen.
Overwegingen, beperkingen en toekomstige toepassingen van het CLARITY-protocol voor retina's met hele montering.
Ten eerste voegen de polymerisatie- en clearingprotocollen voor CLARITY-verwerkte retina's met hele montering enkele dagen toe aan het weefselvoorbereidingsproces. De methode wordt echter nog steeds zeer praktisch gemaakt door het feit dat opgehelderd netvlies maximaal twee weken kan worden opgeslagen in natrium azide-bevattende PBS met minimale weefselafbraak. Ten tweede werd enige uitzetting van het weefsel waargenomen tijdens het clearingproces , zoals gedocumenteerd in eerdere toepassingen van CLARITY7,11. We ontdekten echter dat het netvlies bij equilibratie terugkeerde naar ongeveer de oorspronkelijke grootte met de refractieve indexmatchingoplossing. De potentiële kleine veranderingen in weefselvolume kunnen geen significante vervorming van cellulaire of subcellulaire structuur veroorzaken7,11. Ten derde, bij het weergeven van dikkere hersenmonsters, wordt het microscoopdoel vaak direct ondergedompeld in de montagemedia om volledige brekingsindexmatching van de microscooplens door het weefsel mogelijk te maken12. Met dunnere monsters zoals het netvlies gebruikten we coverslips voor montage om de monsters vlakker en gelijkmatiger te maken voor beeldvorming. De effecten van breking door de coverslip lijken minimaal te zijn op de beeldvorming. Ten vierde tonen sommige van onze afbeeldingen niet-specifieke bloedvatkleuring omdat we het hele dier niet hebben doordrenkt met intracardiale perfusie (voorgesteld om te worden gebruikt om niet-specifieke vlekken te voorkomen) voordat we de ogen verleidden. Ten slotte kan het huidige protocol dat is aangepast voor muizen worden gebruikt voor netvlies van andere soorten. Met name het netvlies van grote dieren zoals honden, varkens, paarden en primaten is veel dikker dan dat van muizen. Dit CLARITY-protocol kan het netvlies van deze dieren optisch transparanter maken na het verwijderen van lipiden en de fijne structuren van retinale neuronen en hun eiwitten behouden voor immunostaining.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
We willen Bing Ye, Nathan Spix en Hao Liu bedanken voor de technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door het National Institute of Health Grants EY022640 (D.-Q.Z.) en Oakland University Provost Undergraduate Student Research Award (E.J.A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Fixative |
| Acrylamide | Fisher Biotech | BP170 | Hydrogel monomer |
| Axio Imager.Z2 | Zeiss | Fluorscence microscope | |
| BSA | Fisher Scientific | BP1600 | Blocking agent |
| Eclipse Ti | Nikon Instruments | Scanning confocal microscope | |
| KCl | VWR | BDH0258 | Buffer component |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | Buffer component |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S9763 | Buffer component |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Buffer component |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S0751 | Buffer component |
| NaN3 | Sigma Aldrich | S2002 | Bacteriostatic preservative |
| NDS | Aurion | 900.122 | Blocking agent |
| NIS Elements AR | Nikon | Image analysis software | |
| SDS | BioRad | 1610301 | Delipidation agent |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | 51876 | Buffer component |
| Triton-X-100 | Sigma | T8787 | Surfactant |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337 | Surfactant |
| VA-044 | Wako Chemicals | 011-19365 | Thermal initiator |
References
- Witkovsky, P.
- McMahon, D. G., Iuvone, P. M. Circadian organization of the mammalian retina: from gene regulation to physiology and diseases. Progress in Retinal and Eye Research. 39, 58-76 (2014).
- Prigge, C. L., et al. M1 ipRGCs Influence Visual Function through Retrograde Signaling in the Retina. Journal of Neuroscience. 36 (27), 7184-7197 (2016).
- Zhang, D. Q., Belenky, M. A., Sollars, P. J., Pickard, G. E., McMahon, D. G. Melanopsin mediates retrograde visual signaling in the retina. PLoS One. 7 (8), 42647 (2012).
- Liu, L. L., Alessio, E. J., Spix, N. J., Zhang, D. Q. Expression of GluA2-containing calcium-impermeable AMPA receptors on dopaminergic amacrine cells in the mouse retina. Molecular Vision. 25, 780-790 (2019).
- Liu, L. L., Spix, N. J., Zhang, D. Q. NMDA Receptors Contribute to Retrograde Synaptic Transmission from Ganglion Cell Photoreceptors to Dopaminergic Amacrine Cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 279 (2017).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332 (2013).
- Poguzhelskaya, E., Artamonov, D., Bolshakova, A., Vlasova, O., Bezprozvanny, I. Simplified method to perform CLARITY imaging. Molecular Neurodegeneration. 9, 19 (2014).
- Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs. eNeuro. 2 (3), (2015).
- Magliaro, C., et al. Clarifying CLARITY: Quantitative Optimization of the Diffusion Based Delipidation Protocol for Genetically Labeled Tissue. Frontiers in Neuroscience. 10, 179 (2016).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Zheng, H., Rinaman, L. Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain. Brain Structure and Function. 221 (4), 2375-2383 (2016).
- Witkovsky, P., Arango-Gonzalez, B., Haycock, J. W., Kohler, K. Rat retinal dopaminergic neurons: differential maturation of somatodendritic and axonal compartments. Journal of Comparative Neurology. 481 (4), 352-362 (2005).
