Uso de la herramienta E1A Minigene para estudiar los cambios en el empalme de ARNm

Resumen

Este protocolo presenta una herramienta rápida y útil para evaluar el papel de una proteína con la función uncharacterized en la regulación que empalma alternativa después del tratamiento quimioterapéutico.

Resumen

El procesamiento del ARNm implica múltiples pasos simultáneos para preparar el ARNm para la traducción, como el 5'capping, la adición de poli-A y el empalme. Además del empalme constitutivo, el empalme alternativo del ARNm permite la expresión de proteínas multifuncionales a partir de un gen. Como los estudios de interactomas son generalmente el primer análisis de proteínas nuevas o desconocidas, la asociación de la proteína de cebo con factores de empalme es una indicación de que puede participar en el proceso de empalme de ARNm, pero determinar en qué contexto o qué genes están regulados es un proceso empírico. Un buen punto de partida para evaluar esta función es el uso de la herramienta clásica de minigene. Aquí presentamos el uso del minigene adenoviral E1A para evaluar los cambios que empalme alternativos después de diversos estímulos celulares de la tensión. Se evaluó el empalme del minigén E1A en HEK293 establemente sobreexpresando la proteína Nek4 después de diferentes tratamientos de estrés. El protocolo incluye transfección de minigenes E1A, tratamiento celular, extracción de ARN y síntesis de ADNc, seguido de pcr y análisis de gel y cuantificación de las variantes empalmeadas E1A. El uso de este método simple y bien establecido combinado con tratamientos específicos es un punto de partida confiable para arrojar luz sobre los procesos celulares o qué genes pueden ser regulados por el empalme de ARNm.

Introducción

El empalme es uno de los pasos más importantes en el proceso eucariota del mRNA que ocurre simultáneamente al 5' mRNA que tapa y al 3' poliadenylation del mRNA, comprendiendo del retiro del intrón seguido por la ensambladura del exón. El reconocimiento de los sitios que empalaban (SS) por el spliceosome, un complejo del ribonucleoprotein que contiene las pequeñas ribonucleoproteínas (snRNP U1, U2, U4 y U6), los pequeños RNAs (snRNAs) y varias proteínas reguladoras¹ es necesario para empalmar.

Además de la extirpación de intrones (empalme constitutivo), en los eucariotas se pueden retener los intrones y se pueden excl....

Protocolo

1. Células de chapado

NOTA: En este protocolo descrito, hek293 líneas celulares estables, previamente generado para la expresión inducible estable de Nek4 se utilizaron^21,sin embargo, el mismo protocolo es adecuado para muchas otras líneas celulares, tales como HEK293^22,HeLa^23,24,25,26,U-2 OS^27,COS7^28,SH-SY5Y^29. El patrón de expresión de las isoformas del minigén E1A en condiciones basales varía en....

Resultados

Un 5' el análisis de los sitios del empalme usando el minigene de E1A fue realizado para evaluar cambios en perfil que empalmaba en células después de la exposición de la quimioterapia. Se evaluó el papel de Nek4-isoforma 1 en la regulación de AS en células estables HEK293 después del tratamiento con paclitaxel o cisplatino.

La región adenoviral de E1A es responsable de la producción de tres mRNAs principales a partir de un prec.......

Discusión

Los minigenes son herramientas importantes para determinar los efectos en el empalme alternativo global in vivo. El minigén adenoviral E1A se ha utilizado con éxito durante décadas para evaluar el papel de las proteínas aumentando la cantidad de estas en la célula^13,14. Aquí, proponemos el uso del minigén E1A para evaluar el empalme alternativo después de la exposición quimioterapéutica. Una línea celular estable que expresaba el isoform 1 Nek4 fue utilizada, evi.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
100 pb DNA Ladder	Invitrogen	15628-050
6 pocillos placa	Sarstedt	833920
Agarose	Sigma	A9539-250G
Cisplatino	Sigma	P4394
DEPC agua	ThermoFisher	AM9920
DMEM	ThermoFisher	11965118
dNTP mix	ThermoFisher	10297-018
Suero fetal bovino - FBS
	Leica	DMIL LED FLUO
Gel - ChemiDoc Gel Imagin System	Bio-Rad
GFP - pEGFPC3	Clontech
Células estables HEK293 - HEK293 Flp-In			Generado a partir de Flp-In™ T-REx&comercio; 293 - Invitrogen y descrito en la ref 21
Higromicina B	ThermoFisher	10687010	Utilizado para el mantenimiento de células Flp-In
Software de procesamiento y análisis de imágenes - FIJI software			ref. 32
Reactivo de transfección a base de lípidos - jetOPTIMUS Reactivo Polyplus	Polyplus	117-07
Oligo DT	ThermoFisher	18418020
Paclitxel	Invitrogen	P3456
Lector de placas/ Absorbancia UV	Biotech		Epoch Biotek/ Take3
plásmido			proporcionado por el Dr. Adrian Krainer
pMTE1A F	Invitrogen	5' -ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3
pMTE1A R	Invitrogen	5' -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3'
Centrífuga refrigerada	Eppendorf	F5810R
Transcriptasa inversa - M-MLV	ThermoFisher	28025013
Transcriptasa inversa - Superíndice IV	ThermoFisher	18090050
Inhibidor de la ribunucleasa RNAse OUT	ThermoFisher	10777-019
Reactivo a base de fenol-cloroformo para extracción de ARN - Trizol	ThermoFisher	15596018
SybrSafe Tinción de gel de ADN	ThermoFisher	S33102
Taq Platinum	Thermo 10966026
Tetraciclina	Sigma	T3383	Se utiliza para Bandera vacía o Nek4- Inducción de expresión de bandera
Termociclador Bio-Rad Bio-Rad		T100
Tripsina	Sigma	T4799