Este protocolo presenta una herramienta rápida y útil para evaluar el papel de una proteína con la función uncharacterized en la regulación que empalma alternativa después del tratamiento quimioterapéutico.
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Artículo de método
Uso de la herramienta E1A Minigene para estudiar los cambios en el empalme de ARNm
En este artículo
Resumen
Resumen
El procesamiento del ARNm implica múltiples pasos simultáneos para preparar el ARNm para la traducción, como el 5'capping, la adición de poli-A y el empalme. Además del empalme constitutivo, el empalme alternativo del ARNm permite la expresión de proteínas multifuncionales a partir de un gen. Como los estudios de interactomas son generalmente el primer análisis de proteínas nuevas o desconocidas, la asociación de la proteína de cebo con factores de empalme es una indicación de que puede participar en el proceso de empalme de ARNm, pero determinar en qué contexto o qué genes están regulados es un proceso empírico. Un buen punto de partida para evaluar esta función es el uso de la herramienta clásica de minigene. Aquí presentamos el uso del minigene adenoviral E1A para evaluar los cambios que empalme alternativos después de diversos estímulos celulares de la tensión. Se evaluó el empalme del minigén E1A en HEK293 establemente sobreexpresando la proteína Nek4 después de diferentes tratamientos de estrés. El protocolo incluye transfección de minigenes E1A, tratamiento celular, extracción de ARN y síntesis de ADNc, seguido de pcr y análisis de gel y cuantificación de las variantes empalmeadas E1A. El uso de este método simple y bien establecido combinado con tratamientos específicos es un punto de partida confiable para arrojar luz sobre los procesos celulares o qué genes pueden ser regulados por el empalme de ARNm.
Introducción
El empalme es uno de los pasos más importantes en el proceso eucariota del mRNA que ocurre simultáneamente al 5' mRNA que tapa y al 3' poliadenylation del mRNA, comprendiendo del retiro del intrón seguido por la ensambladura del exón. El reconocimiento de los sitios que empalaban (SS) por el spliceosome, un complejo del ribonucleoprotein que contiene las pequeñas ribonucleoproteínas (snRNP U1, U2, U4 y U6), los pequeños RNAs (snRNAs) y varias proteínas reguladoras1 es necesario para empalmar.
Además de la extirpación de intrones (empalme constitutivo), en los eucariotas se pueden retener los intrones y se pueden excl....
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Protocolo
1. Células de chapado
NOTA: En este protocolo descrito, hek293 líneas celulares estables, previamente generado para la expresión inducible estable de Nek4 se utilizaron21,sin embargo, el mismo protocolo es adecuado para muchas otras líneas celulares, tales como HEK29322,HeLa23,24,25,26,U-2 OS27,COS728,SH-SY5Y29. El patrón de expresión de las isoformas del minigén E1A en condiciones basales varía en....
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Resultados
Un 5' el análisis de los sitios del empalme usando el minigene de E1A fue realizado para evaluar cambios en perfil que empalmaba en células después de la exposición de la quimioterapia. Se evaluó el papel de Nek4-isoforma 1 en la regulación de AS en células estables HEK293 después del tratamiento con paclitaxel o cisplatino.
La región adenoviral de E1A es responsable de la producción de tres mRNAs principales a partir de un prec.......
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Discusión
Los minigenes son herramientas importantes para determinar los efectos en el empalme alternativo global in vivo. El minigén adenoviral E1A se ha utilizado con éxito durante décadas para evaluar el papel de las proteínas aumentando la cantidad de estas en la célula13,14. Aquí, proponemos el uso del minigén E1A para evaluar el empalme alternativo después de la exposición quimioterapéutica. Una línea celular estable que expresaba el isoform 1 Nek4 fue utilizada, evi.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Agradecemos a la Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, a través de grant temático 2017/03489-1 a JK y beca a FLB 2018/05350-3) y al Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) por financiar esta investigación. Nos gustaría dar las gracias al Dr. Adrian Krainer por proporcionar el plásmido pMTE1A y a Zerler y sus colegas por su trabajo en la clonación E1A. También agradecemos a la Prof. Dra. Patrícia Moriel, a la Prof. Dra. Wanda Pereira Almeida, al Prof. Dr. Marcelo Lancellotti y a la Prof. Dra. Karina Kogo Cogo Müller por permitirnos utilizar su espacio y equipo de laboratorio.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 100 pb DNA Ladder | Invitrogen | 15628-050 | |
| 6 pocillos placa | Sarstedt | 833920 | |
| Agarose | Sigma | A9539-250G | |
| Cisplatino | Sigma | P4394 | |
| DEPC agua | ThermoFisher | AM9920 | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965118 | |
| dNTP mix | ThermoFisher | 10297-018 | |
| Suero fetal bovino - FBS | |||
| Leica | DMIL LED FLUO | ||
| Gel - ChemiDoc Gel Imagin System | Bio-Rad | ||
| GFP - pEGFPC3 | Clontech | ||
| Células estables HEK293 - HEK293 Flp-In | Generado a partir de Flp-In™ T-REx&comercio; 293 - Invitrogen y descrito en la ref 21 | ||
| Higromicina B | ThermoFisher | 10687010 | Utilizado para el mantenimiento de células Flp-In |
| Software de procesamiento y análisis de imágenes - FIJI software | ref. 32 | ||
| Reactivo de transfección a base de lípidos - jetOPTIMUS Reactivo Polyplus | Polyplus | 117-07 | |
| Oligo DT | ThermoFisher | 18418020 | |
| Paclitxel | Invitrogen | P3456 | |
| Lector de placas/ Absorbancia UV | Biotech | Epoch Biotek/ Take3 | |
| plásmido | proporcionado por el Dr. Adrian Krainer | ||
| pMTE1A F | Invitrogen | 5' -ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3 | |
| pMTE1A R | Invitrogen | 5' -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3' | |
| Centrífuga refrigerada | Eppendorf | F5810R | |
| Transcriptasa inversa - M-MLV | ThermoFisher | 28025013 | |
| Transcriptasa inversa - Superíndice IV | ThermoFisher | 18090050 | |
| Inhibidor de la ribunucleasa RNAse OUT | ThermoFisher | 10777-019 | |
| Reactivo a base de fenol-cloroformo para extracción de ARN - Trizol | ThermoFisher | 15596018 | |
| SybrSafe Tinción de gel de ADN | ThermoFisher | S33102 | |
| Taq Platinum | Thermo 10966026 | ||
| Tetraciclina | Sigma | T3383 | Se utiliza para Bandera vacía o Nek4- Inducción de expresión de bandera |
| Termociclador Bio-Rad Bio-Rad | T100 | ||
| Tripsina | Sigma | T4799 |
Referencias
- Ule, J., Blencowe, B. J. Alternative Splicing Regulatory Networks: Functions, Mechanisms, and Evolution. Molecular Cell. 76 (2), 329-345 (2019).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of....
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Reimpresiones y permisos
