Artículo de método

Una descripción cartográfica 3D de la célula mediante tomografía de rayos X cryo soft

DOI:

10.3791/62190

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15 de marzo de 2021

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1MISTRAL beamline, Alba Light Source, Cerdanyola del Valles, Spain, 2Beamline B24, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus, Didcot, UK

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, se presenta un protocolo que describe los pasos de preparación de la muestra y recolección de datos requeridos en la tomografía de rayos X criobla (SXT) para obtener imágenes de la ultraestructura de células crioconservadas enteras a una resolución de medio paso de 25 nm.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las técnicas de imagen son fundamentales para comprender la organización celular y la maquinaria en la investigación biológica y los campos relacionados. Entre estas técnicas, la tomografía criobla de rayos X (SXT) permite obtener imágenes de células crioconservadas enteras en el rango de energía de rayos X de la ventana de agua (284-543 eV), en la que las estructuras de carbono tienen una absorción intrínsecamente mayor que el agua, lo que permite la reconstrucción 3D del coeficiente de absorción lineal del material contenido en cada vóxel. La información estructural cuantitativa a nivel de celdas enteras de hasta 10 μm de espesor se puede lograr de esta manera, con un alto rendimiento y resolución espacial de hasta 25-30 nm de paso medio. Cryo-SXT ha demostrado ser relevante para la investigación biomédica actual, proporcionando información 3D sobre procesos de infección celular (virus, bacterias o parásitos), cambios morfológicos debidos a enfermedades (como enfermedades genéticas recesivas) y ayudándonos a comprender la acción de los medicamentos a nivel celular o localizando estructuras específicas en el entorno celular 3D. Además, al aprovechar la longitud de onda sintonizable en las instalaciones de sincrotrón, la espectromicroscopía o su contraparte 3D, la espectrotomografía, también se pueden utilizar para obtener imágenes y cuantificar elementos específicos en la célula, como el calcio en los procesos de biomineralización. Cryo-SXT proporciona información complementaria a otras técnicas de imagen biológica como la microscopía electrónica, la fluorescencia de rayos X o la fluorescencia de luz visible, y generalmente se usa como un método asociado para imágenes correlativas 2D o 3D en condiciones criogénicas para vincular la función, la ubicación y la morfología.

Introducción

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Cryo-SXT puede desempeñar un papel central en la investigación de imágenes biológicas, ya que proporciona volúmenes de resolución media 3D (25-30 nm de medio paso) de células enteras hidratadas 1,2,3,4,5,6. En el rango de energía de la ventana de agua, entre los bordes K de absorción de carbono y oxígeno (4.4-2.3 nm), las estructuras celulares ricas en carbono absorben 10 veces más que el medio rico en oxígeno que las impregna y rodea. En este rango de energía, las células vitrificadas de hasta 10 μm de espesor se pueden obtener imágenes sin necesidad de seccionamiento o tinción, lo que lleva a proyecciones cuantitativas de alto contraste de absorción, que, combinadas con las capacidades de rotación de la muestra, permiten la reconstrucción tomográfica de la estructura celular. Cryo-SXT llena un nicho en términos de dimensiones de muestras y resolución espacial que no es fácilmente accesible por ninguna otra técnica de imagen.

En resumen, el contraste de absorción de crio-SXT es cuantitativo, ya que la atenuación de los fotones a través de la muestra de espesor t obedece a la ley de Beer-Lambert de la siguiente manera: figure-introduction-1, donde I0 representa la intensidad incidente y μl el coeficiente de absorción lineal, que depende de la longitud de onda λ y la parte imaginaria β del índice de refracción de la muestra (figure-introduction-2 ). La atenuación es una función de la composición bioquímica y el grosor de las estructuras que se están fotografiando, y cada componente bioquímico tiene un coeficiente de absorción lineal de rayos X específico μl (LAC). Esto significa que cada valor de vóxel de tomografía depende de los elementos químicos y su concentración en ese vóxel7. Esto permite la discriminación natural de diferentes orgánulos como núcleos, nucleolos, cuerpos lipídicos o mitocondrias, o diferentes estados de compactación de la cromatina basados únicamente en sus valores inherentes de LAC reconstruidos 2,8,9.

Además, cryo-SXT es una técnica de alto rendimiento con tomogramas que se recolectan en pocos minutos. Esto permite específicamente la obtención de imágenes a mesoescala de poblaciones celulares que se pueden capturar en puntos de tiempo clave como la división, la diferenciación y la apoptosis, pero también en diferentes estados de respuesta, como los inducidos por la exposición química a terapias farmacológicas específicas o a infecciones patógenas. Los datos recopilados en esos puntos clave entregarán una descripción en 3D del sistema con un registro fiel de la organización espacial de los diferentes orgánulos celulares en esos momentos específicos.

Por lo general, el crio-SXT se utiliza en combinación con otras técnicas siguiendo enfoques correlativos que permiten localizar características, eventos o macromoléculas específicas dentro del entorno celular 3D 4,10,11,12,13,14,15,16, o datos de fluorescencia de rayos X duros17,18 . Los enfoques correlativos en condiciones criogénicas son de suma importancia para obtener la imagen más completa y valiosa del sistema de interés. En la Figura 1 se esboza un resumen sucinto del flujo de trabajo típico en las líneas de haz crio-SXT Mistral (Alba) y B24 (Diamond).

Además, aprovechando la capacidad de ajuste de longitud de onda en las instalaciones de sincrotrón, se puede obtener información espectroscópica además de la estructural utilizando la absorción diferencial específica de elementos particulares contenidos en la muestra. Un ejemplo de ello sería la localización del calcio en el estudio de los procesos de biomineralización en las células 19,20,21. Al tomar imágenes 2D a diferentes energías de fotones (espectros) o tomogramas debajo y en el borde de absorción de rayos X de interés, se pueden identificar los píxeles o vóxeles que contienen el elemento seleccionado. Spectra también permite diferenciar estados químicos (es decir, la evolución del calcio amorfo a hidroxiapatita como en el ejemplo de biomineralización anterior20). La cuantificación de diferentes elementos es posible en 2D y 3D. Las imágenes espectroscópicas de células vitrificadas se realizan típicamente en la ventana de agua, pero también son posibles en otros rangos de energía si el contenido de agua es lo suficientemente bajo o si se utilizan otros protocolos de preparación de muestras, incluida la deshidratación,22. Un protocolo detallado de espectroscopia paso a paso está más allá del enfoque del protocolo en este documento.

En lo que sigue, el protocolo se centra en resumir brevemente los principales pasos de preparación de la muestra, aunque cada sistema puede necesitar un refinamiento individual, seguido de un procedimiento detallado de recopilación de datos paso a paso para la tomografía de rayos X crioblables.

Protocolo

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1. Preparación de la muestra

  1. Preparación del soporte de la red
    1. Irradiar las rejillas con UV durante 3 h con la película de carbono hacia arriba para la esterilización.
    2. Opcional: En caso de problemas con celdas que no se conectan a la cuadrícula, siga uno de los pasos siguientes.
      1. Hidrofilizar la lámina de soporte de carbono mediante el tratamiento con plasma de las rejillas para aumentar la propagación de la muestra y una mejor adhesión celular.
        1. Coloque las rejillas de carbono hacia arriba en el equipo de la cámara de descarga de resplandor y exponga la rejilla al plasma durante 30 s a 15 minutos (utilizando Ar u / y O2) dependiendo del equipo.
      2. Funcionalizar las rejillas con poli-L-lisina (PLL)
        1. Agregue gotas individuales de 60 μL PLL en una placa de Petri y coloque la rejilla encima de la gota de PLL con la película de carbono hacia abajo. Incubar durante 30 min a 37 °C y secar el PLL con un papel de filtro.
      3. Funcionalizar las rejillas con suero fetal bovino (FBS).
        1. Sumerja las rejillas en FBS durante la noche. Sumerja las rejillas en una solución tampón para lavar y deje la rejilla en un papel de filtro para eliminar el exceso de líquido.
  2. Crecimiento de células adherentes en rejillas
    1. Cultivar células en una placa de cultivo celular de 100 mm para alcanzar una confluencia del 80%-90% (Figura 2A).
    2. Sembrar 1-5 x 105 celdas/mL (ajustar el valor al sistema) en la parte superior de las rejillas Au en una placa de Petri P60 (3 mL en total).
      NOTA: La adición de la suspensión celular debe hacerse con mucho cuidado con la película de carbono de la rejilla mirando hacia arriba en un plato de cultivo celular de 60 mm. Prepare varias rejillas por condición, una condición por placa de Petri P60 (Figura 2B).
    3. Permita que las celdas se asienten hasta que la confluencia en la cuadrícula alcance varias celdas (1 a 10 dependiendo del tamaño de la celda) en cada cuadrado de malla (dependiendo de la línea celular, esto puede tomar hasta 24 h).
      NOTA: Antes de la congelación, las rejillas deben verificarse con un microscopio de luz visible (VLM), evaluando la integridad de la película de carbono, así como la confluencia celular en cada rejilla (Figura 2C). Espere hasta que se alcance la densidad de celdas adecuada en la cuadrícula. Si la rejilla es demasiado confluente o la lámina de carbono está rota, comience de nuevo.
  3. Deposición de celdas en suspensión sobre rejillas
    1. Elija una rejilla de Au o Cu preparada con la pinza del congelador (ver sección 1.6).
    2. Prepare una suspensión de 1-5 x 105 celdas (absorbancia de densidad óptica de 0.3 en caso de bacterias) y agregue 4 μL de la suspensión preparada a la rejilla.
    3. Incubar la rejilla con la gota durante unos minutos horizontalmente para permitir la deposición de las células y luego colocar la pinza que sostiene la rejilla dentro de la cámara de vitrificación climatizada configurada en las condiciones adecuadas de temperatura y humedad (paso 1.6.1).
  4. Opcional: etiquetado fluorescente de las muestras
    NOTA: Puede ser beneficioso etiquetar fluorescentemente algunos orgánulos de la muestra. Dependiendo del interés, se pueden utilizar fluoróforos específicos o células que expresan de manera estable una proteína fluorescente o transfectadas para la expresión transitoria de una proteína de interés. Esto permite una fácil detección de células mediante microscopía crioepifluorescencia y ayuda a encontrar células de interés para imágenes de rayos X posteriores. En lo que sigue, el protocolo solo detalla el uso de fluoróforos.
    1. Prepare una solución de trabajo para el fluoróforo (consulte la recomendación del fabricante) y siga el protocolo específico.
    2. Agregue los fluoróforos a la placa de Petri que contiene las rejillas y mezcle suavemente.
    3. Deje incubar en un ambiente oscuro y vaya directamente al paso 1.6 después de que finalice la incubación.
      NOTA: Es importante estar listo para vitrificar una vez finalizada la incubación para evitar el etiquetado inespecífico y, en consecuencia, la señal fluorescente borrosa.
  5. Preparación de nanopartículas de Au (NP) para la alineación de la proyección del tomograma
    1. Tome una alícuota de 1 ml de la solución madre de Au fiducial (100 nm en Mistral o 250 nm en B24) y centrífuga a baja velocidad (para evitar la agregación) durante 1 minuto para permitir que los NP se granularen.
      NOTA: Si es posible, se prefiere dejar que los fiduciales se asienten naturalmente durante la noche o más, para evitar la agregación.
    2. Retire el sobrenadante. Inmediatamente antes de la congelación, vuelva a suspender los NP en un medio sin suero de 20 μL o en una solución tampón para obtener una solución homogénea.
      NOTA: Se recomienda la sonicación y el vórtice para ayudar a homogeneizar la solución.
  6. Rejillas de congelación por inmersión
    PRECAUCIÓN: El nitrógeno líquido puede causar quemaduras por frío y se debe usar el equipo de protección adecuado (bata de laboratorio larga, gafas de seguridad, guantes, pantalones largos y zapatos cerrados). El etano es altamente explosivo y debe mantenerse alejado de cualquier chispa o fuego abierto.
    1. Siga las instrucciones del fabricante para preparar y utilizar el instrumento del congelador.
      NOTA: La humedad generalmente se establece en 80% -90%; la temperatura dependerá del tipo de célula (levadura 30 °C máximo, células de mamíferos 37 °C, células de insectos 28 °C, etc.).
    2. Tome una rejilla con las pinzas de montaje de la placa de Petri junto al borde, teniendo mucho cuidado de no doblar la rejilla y montarla en el dispositivo congelador. Asegúrese de que las células se alejen del papel secante.
    3. Opcional: lavar la rejilla tres veces en tampón en el caso de celdas adherentes.
    4. Añadir 1,5 μL de fiduciales Au NP en la parte superior de las celdas (a través del orificio en el lado derecho de la cámara) y dejar reposar durante 30 s antes de secar y hundir la rejilla.
      NOTA: En el caso de las celdas en suspensión, añadir fiduciales Au NP a la rejilla mientras todavía está en posición horizontal antes de montar la pinza y dejar que se asienten durante 30 s. El borrado es crucial para las rejillas de alta calidad. La distancia de borrado debe calibrarse antes de comenzar; La planitud del papel secante es importante para la eliminación reproducible (siga las instrucciones del fabricante). El tiempo de borrado debe evaluarse para cada tipo de célula.
    5. Prepare varias cuadrículas por condición. Transfiera la rejilla y almacene a temperaturas criogénicas para preservar la vitrificación.
  7. Rejillas de cribado con microscopía criovisible de luz
    1. Transfiera las rejillas bajo nitrógeno líquido de las crio-cajas a un crio-cassette estándar (tres posiciones para rejillas TEM de 3 mm) dentro de una crio-etapa pre-enfriada (consulte las instrucciones del fabricante).
    2. El crio-cassette se coloca en el puente crio-etapa y el cryo-stage se monta en un microscopio de luz de epifluorescencia de campo amplio.
    3. Tome una imagen de las rejillas a -196,5 °C utilizando un objetivo de larga distancia de trabajo (10x, 50x, 100x) con el fin de localizar células adecuadas para la obtención de imágenes crio-SXT y evaluar la calidad de la rejilla (presencia de hielo grueso, integridad de la película de soporte de carbono, presencia de señal fluorescente, etc.).
    4. Localice las células de interés utilizando imágenes de campo brillante y/o fluorescencia.
      NOTA: En esta etapa, capture las imágenes si hay una cámara vinculada en el microscopio. Úselo para la correlación de imágenes.
    5. Después de la detección, devuelva las rejillas a las crio-cajas en un dewar de almacenamiento de nitrógeno líquido.
      NOTA: Si no se encuentran buenas muestras, repita los pasos de preparación de la muestra modificando cualquiera de los parámetros. Por lo general, los parámetros que requieren modificación son el tiempo de borrado, en caso de que el hielo sea demasiado grueso o la confluencia, si hay demasiadas celdas por cuadrado de malla.

2. Carga en el microscopio de rayos X de transmisión (TXM)

  1. Enfríe la cámara de transferencia con nitrógeno líquido hasta que alcance <100 K, enfríe la estación de trabajo (Figura 3A) y encienda el calentador de la llanta de la estación de trabajo. Espere hasta que deje de hervir.
  2. Coloque las crio-cajas necesarias que contengan cuadrículas en las ubicaciones correspondientes en la estación de trabajo (Figura 3A). Preste atención para transferirlos de manera segura en condiciones de crioterapia.
  3. Cargue las rejillas seleccionadas en los soportes de muestra previamente enfriados (Figura 3B); cargue los soportes en el transbordador y protéjalos con las cubiertas (Figura 3C).
  4. Cargue el transbordador en la cámara de transferencia a <100 K y bombéelo a bajo vacío (Figura 3D).
  5. Conecte la cámara de transferencia al TXM (Figura 4A) y cargue el transbordador desde la cámara de transferencia al TXM siguiendo el procedimiento de vacío en la pantalla (Figura 4B).
  6. Una vez que el transbordador está dentro con las muestras, el brazo robótico TXM puede llevar un soporte de muestra a la vez a la etapa de muestra (Figura 4C).

3. Imágenes con el software TXM

NOTA: Las cuadrículas en la etapa de muestra se toman primero con un microscopio de luz visible en línea (VLM) para mapear la cuadrícula en modo de campo brillante y / o fluorescencia antes de ser fotografiadas con rayos X. Utilice el icono del joystick correspondiente a la pestaña Control de movimiento en el panel superior izquierdo para abrir el Control de movimiento.

  1. Obtención de imágenes de la cuadrícula con el VLM en línea.
    1. Adquisición de mosaico de campo brillante
      1. Seleccione la cámara VLM (lente de aumento > VLM) y encienda la fuente led VLM para obtener imágenes de campo brillante (Microscopio > Adquisición > Configuración de adquisición > Configuración de fuente y seleccione Transmisión).
      2. Gire la muestra a -60 grados para enfrentar el objetivo VLM (Motion Control > Sample > Sample θ) y mueva la muestra a las posiciones centradas esperadas (Motion Control > Sample y cambie Sample X, Sample Y).
      3. Al adquirir imágenes en pasos de 20 a 50 μm primero para enfocar la red aproximadamente (Microscopio > Configuración de adquisición > adquisición > modos de adquisición > inicio continuo >; Control de movimiento > Muestra y cambio de muestra Z).
      4. Refinar el foco con pasos más pequeños hasta 5 μm hasta que las células y/o los orificios de la película de soporte de carbono estén enfocados (Microscopio > Adquisición > Configuración de Adquisición > Modos de Adquisición > Inicio continuo de >; Motion Control > Muestra y cambiar muestra Z) e iniciar la adquisición de un mapa de mosaico completo de la cuadrícula en modo de campo brillante. Utilice los valores predeterminados para el mosaico. (Configuración de adquisición > adquisición > modos de adquisición > mosaico > inicio de microscopio >).
        NOTA: Un mapa de mosaico está hecho de imágenes individuales. El número de imágenes (número de columnas, filas y el tamaño del paso en X e Y) debe establecerse para visualizar toda la cuadrícula. El tamaño del paso depende del tamaño del campo de visión (FoV). Los valores predeterminados se utilizan aquí. Si la cuadrícula no está bien centrada en el plano X-Y con respecto al foV de mosaico completo, detenga la adquisición, corrija las coordenadas X e Y de la muestra y repita la adquisición.
    2. Adquisición de mosaico en modo de fluorescencia
      1. Apague la fuente led VLM para imágenes de campo brillante (Microscopio > Adquisición > Configuración de adquisición > Configuración de fuente y anule la selección de transmisión) y seleccione la fuente de luz LED correspondiente a la longitud de onda de excitación deseada (rojo, verde o azul) y el filtro óptico correspondiente manualmente en la configuración.
      2. Refinar el enfoque en la imagen de fluorescencia (Microscopio > Configuración de adquisición > adquisición > modos de adquisición > inicio de > continuo; Motion Control > Muestra y cambiar la Muestra Z) y, a continuación, adquirir un mapa de mosaico que conserva los parámetros posicionales (X e Y) del mosaico de campo brillante (Microscopio > Adquisición > Configuración de adquisición > Modos de adquisición > Mosaico > Inicio).
      3. Apague la fuente de luz LED
      4. Opcional: En función de los mapas de mosaico de campo brillante y fluorescencia, anote las regiones de interés (ROI) identificadas previamente (paso 1.7.4) o el nuevo ROI (posiciones X-Y en la imagen).
  2. Adquisición de mosaico de rayos X
    1. Seleccione el detector de rayos X CCD (lente de aumento > seleccione Pixis), lleve la muestra a una rotación de 0 grados (Control de movimiento > Muestra y cambie la muestra θ) y mueva la óptica de rayos X (Condensador y placa de zona) a las posiciones alineadas (Control de movimiento > condensador > cambie el condensador z; Control de movimiento > placa de zona y cambiar la placa de zona Z).
      NOTA: Enfríe el chip CCD a -65 ° C antes de obtener imágenes (microscopio > la temperatura de la cámara > Pixis y cambie la temperatura establecida a -65 ° C y haga clic en Aplicar).
    2. Mueva la muestra al centro del cuadrado de malla de uno de los ROI seleccionados (Motion Control > Sample y cambie Sample X, Sample Y).
    3. Utilice el binning 2 y la ranura de salida a 5 μm para minimizar la irradiación y la exposición de 1 s en Mistral, y el binning 1 y 60 μm en B24, ajuste el enfoque utilizando la traducción Z de muestra (Microscopio > Adquisición > Configuración de adquisición > Configuración de la cámara y cambie el binning; Motion Control > XS y cambiar XS; Configuración de adquisición > adquisición de microscope >> modos de adquisición > inicio continuo de >; Control de movimiento > Muestra y cambio de muestra Z). Comience en pasos de 5 μm y refinarlo hasta escalones de 0,5 μm, hasta que la celda o los orificios de la lámina de carbono estén bien enfocados.
    4. Adquiera un mapa de mosaico del cuadrado de malla (Microscopio > Configuración de adquisición > adquisición > Modo de adquisición > Mosaico > Inicio).
      NOTA: Los parámetros de adquisición de mosaicos se pueden determinar de la misma manera que para los mosaicos VLM (sección 3.1.1.4). El tamaño del paso depende de la ampliación preseleccionada por el personal de la línea de haz.
    5. Mueva la muestra a una posición de campo plano (FF) (un área vacía dentro de la cuadrícula, preferiblemente un orificio en el soporte de carbono) (Control de movimiento > Muestra y cambie la muestra X, Muestra Y).
    6. Establezca el tiempo de exposición en 1 s en Mistral y 0,5 s en B24 (Configuración de adquisición > adquisición > de microscopio > configuración de cámara y cambie el tiempo de exposición) y adquiera una sola imagen (Microscopio > adquisición > modos de adquisición > inicio de > único).
    7. Normalice (divida) el mosaico adquirido por la imagen FF para obtener la transmisión (con valores entre 0 y 1) y guarde el mosaico normalizado (haga clic en el primer icono de la esquina superior derecha en el lado derecho de la imagen para abrir el menú>elija la pestaña Referencia> haga clic en Referencia única y navegue por el FF específico).
  3. Preparación para recoger una serie de inclinación de rayos X
    NOTA: Busque el eje de rotación para cada región de interés que se está fotografiando.
    1. Haga una selección de áreas dentro de los mosaicos para realizar la tomografía, es decir, colocando una forma cuadrada (haga clic en Herramienta en el lado izquierdo de la ventana de la imagen) con el tamaño del FoV en el mapa de mosaico de rayos X.
      NOTA: Al seleccionar áreas, considere la distancia desde el borde (≥10 μm) y otras celdas, para evitar la superposición de celdas durante la rotación. Además, verifique el estado de la célula (forma esperada de la célula, espesor del hielo, éxito de la vitrificación, propagación fiducial, etc.).
    2. Alineación de la muestra en el eje de rotación
      NOTA: El procedimiento informado es iterativo. La iteración converge más rápido usando ángulos ± de 60° como ángulos de rotación máximos (θM). Si no son accesibles, use ángulos lo más cercanos posible a ± 60°.
      1. Configure la cámara en binning 2, tiempo de exposición 1 s (Microscopio > Configuración de adquisición > adquisición > Configuración de la cámara y cambie el tiempo de exposición; cambie Binning; Microscopio > modos de adquisición > adquisición > inicio de > continuo), ajuste la ranura de salida a 5 μm.
        NOTA: Minimice la dosis tanto como sea posible trabajando con una apertura mínima de la ranura de salida.
      2. Con la rotación a 0°, muévase al área previamente seleccionada utilizando la muestra X y la traslación de la muestra Y y concéntrese en la característica de la celda para colocar en el eje de rotación utilizando la traslación Z de la muestra (Control de movimiento > Muestra y cambie la muestra x; Muestra y; Ejemplo z).
      3. Gire la muestra a + θM (Motion Control > Sample y cambie Sample θ) y dibuje una línea (L+) (haga clic en el botón de herramienta de línea en el lado derecho de la ventana de la imagen) en la función de la celda para colocarla en el eje de rotación.
      4. Gire a -θM (Motion Control > Sample y cambie Sample θ) y dibuje una línea (L-) (haga clic en el botón de herramienta de línea en el lado derecho de la ventana de la imagen) en la función de la celda que desea colocar en el eje de rotación.
      5. Mientras esté en +θM o -θM, utilice la traducción Z de muestra para mover la función seleccionada a la posición central entre ambas líneas (Control de movimiento > Muestra y cambie muestra Z).
      6. Repita el procedimiento desde el paso 3.3.2.3 iterativamente hasta que se alcance una distancia mínima de L+ a L-.
        NOTA: La distancia entre las dos líneas L+ y L- debe ser menor con respecto a la iteración anterior.
      7. En la muestra θ = 0 (Control de movimiento > Muestra y cambiar Muestra θ), mueva la muestra X el doble de la distancia necesaria para colocar la función seleccionada en el centro de ambas líneas (Control de movimiento > Muestra y cambie la Muestra X). Mueva la placa de zona (ZP) X para devolver la función al centro del FoV (Control de movimiento > ZP y cambie ZP X). Haga este paso solo una vez por cuadrícula.
      8. Vuelva a optimizar la posición ZP Z con respecto al nuevo eje de rotación registrando una serie focal ZP Z (colecciones de imágenes en diferentes posiciones ZP Z, generalmente en pasos de 0,3 μm) (Microscopio > Configuración de adquisición > adquisición > Modos de adquisición > Serie focal > Inicio) y mueva el ZP Z a la posición donde la muestra está enfocada (Control de movimiento > placa de zona y cambio de placa de zona z).
      9. Establezca los parámetros para la adquisición de la serie de inclinación.
        NOTA: El rango angular máximo está limitado en última instancia por la distancia focal del ZP (±70 o ±65 grados para un ZP de 40 nm o 25 nm para una muestra plana, respectivamente). Optimice la relación señal-ruido (S/N) y el daño por radiación para definir el tiempo de exposición. Para la tomografía, use diferentes tiempos de exposición en diferentes rangos angulares.
      10. Determine el rango angular de rotación más alto, en caso de que se produzca un sombreado antes de que se alcance el ángulo de rotación máximo.
      11. Establezca el binning de la cámara en 1 (Microscopio > Adquisición > Configuración de adquisición > Configuración de la cámara y cambie Binning), abra la ranura de salida a 15 μm en Mistral (Motion Control > XS y cambie XS) y establezca la rotación en 0° (Motion Control > Sample y cambie Sample θ).
      12. Adquiera una sola imagen con un tiempo de exposición de 1 s (Microscopio > Configuración de adquisición > adquisición > Modos de adquisición > inicio de > único) y calcule el tiempo de exposición requerido para cada ángulo de inclinación de la tomografía.
  4. Adquisición de tomografía
    1. Desplácese al ángulo máximo negativo +0.1 (por ejemplo, para ZP 25 nm vaya a -65.1°) (Control de movimiento > Muestra y cambie Muestra θ).
    2. Establezca el número de imágenes como número total de ángulos (teniendo en cuenta la imagen en el ángulo 0) y el rango angular (Microscopio > Configuración de adquisición > adquisición > modos de adquisición > tomografía y cambie el número de imágenes; luego, cambie el inicio del ángulo y el extremo del ángulo).
    3. Establezca el tiempo de exposición definido e inicie la adquisición (Microscopio > Configuración de adquisición > adquisición > Configuración de la cámara y cambie el Tiempo de exposición y luego haga clic en Inicio).
    4. Vaya a la posición FF (Motion Control > Sample y cambie sample X; luego, cambie sample Y) y adquiera 10 imágenes FF (Microscopio > Adquisición > modos de adquisición > Promedio y cambie el número de imágenes y luego haga clic en Inicio).
      NOTA: En Mistral, la espectromicroscopía o microscopía dependiente de la energía es posible cuando se adquieren proyecciones mientras se escanea la energía a través de un borde de absorción de interés. La salida final es una pila de proyecciones 2D, que contendrá un espectro de absorción de rayos X (XAS) en cada píxel, es decir, imágenes con información química. La extensión a 3D combinando espectroscopia con tomografía es en principio posible. La dosis total requerida puede ser una limitación y luego se pueden requerir estrategias específicas como imágenes de absorción diferencial.

4. Análisis de datos

NOTA: Todo el análisis de datos se realiza con software abierto disponible y scripts desarrollados con canalizaciones automatizadas.

  1. En Mistral
    1. Pipeline convierte las pilas de tomografía de extensión txrm (extensión de software TXM) a hdf5 (formato de datos jerárquicos de código abierto) con todos los metadatos necesarios, luego normaliza la pila por el promedio FF y la corriente de la máquina, y finalmente desconvoluciona las pilas mediante la función de dispersión de puntos medidos del sistema óptico para una lente de placa de zona de Fresnel (ZP) específica y energía23, 24. Para la deconvolución, encuentre el valor adecuado k = 1/SNR (depende del grosor de la muestra). Para el script desarrollado en Mistral, escriba el comando: txrm2deconv "input tomo" "input FF" -zp="ZP used" - e= " energy " - dx= " pixel size " - k= " 1/SNR " - t=-1.
    2. Para el script desarrollado en Mistral para la alineación automática, escriba el comando: ctalignxcorr "normalized deconvolved stack.mrc" "normalized stack.hdf5".
      NOTA: Se pueden utilizar varias aplicaciones de software para la alineación de las proyecciones a un eje de rotación común utilizando los fiduciales Au NP25,26. La alineación de las proyecciones requiere precisión de subpíxeles. La alineación automática solo puede ser satisfactoria cuando los fiduciales Au NP son suficientes (>7) y están bien distribuidos en el campo de visión. La alineación manual a menudo se necesita a posteriori para corregir la alineación automática para lograr la mayor precisión posible.
    3. Para reconstruir la pila normalizada alineada, utilice cualquiera de los varios algoritmos disponibles.
      NOTA: La pila alineada se puede reconstruir utilizando la proyección inversa ponderada (WBP) o las técnicas de reconstrucción iterativa simultánea (SIRT) en pocos minutos. Sin embargo, para preservar los coeficientes de absorción lineal (ALC), se prefieren las Técnicas de Reconstrucción Algebraica (ART)27. ART requiere más tiempo de computación, por lo que SIRT28 se realiza primero para una rápida reconstrucción de la serie de inclinación alineada automáticamente (30 iteraciones en pocos minutos). Una vez que la alineación sea satisfactoria, se utilizará ART.
  2. En B24
    1. Una canalización personalizada convierte los archivos de datos txrm en Tiffs estándar con todos los metadatos necesarios y luego los envía a un flujo de trabajo de runtomo por lotes que procesa los conjuntos de datos de tres maneras: WBP, SIRT y parche.

Resultados

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Preparar muestras para cryo-SXT puede ser un desafío. Incluso dentro de la misma cuadrícula de muestra, es posible tener áreas que son ideales y áreas que no son ideales, como se puede ver en la Figura 5, que muestra dos cuadrados de la misma cuadrícula del buscador de Au. La muestra ideal debe tener células individuales en el centro de una malla cuadrada, incrustadas en una capa delgada de hielo y rodeadas de marcadores Au fiduciales bien dispersos utilizados para la alineación de las proyecciones de inclinación antes de la reconstrucción por tomografía. La Figura 5A muestra una célula similar a un fibroblasto (NIH 3T3) que cumple con muchos de estos criterios. En la Figura 5B se muestra una sola rebanada de una reconstrucción 3D utilizando ART27 del área marcada con el cuadro rojo que indica el campo de visión (FoV). Muchos orgánulos diferentes como la mitocondria (M), el retículo endoplásmico (ER), las vesículas (V) y el núcleo (N) se pueden distinguir gracias a la reconstrucción cuantitativa de los ALCs. Además, la relación señal-ruido de la reconstrucción es muy alta, lo que permite lograr un alto contraste de las características celulares. Por otro lado, la Figura 5C muestra un cuadrado con mayor densidad celular. Debido a esto, el blotting suele ser menos eficiente, lo que lleva a una capa de hielo más gruesa o incluso a problemas de vitrificación. En algunos casos, esto ya se puede observar al examinar la rejilla utilizando el mapeo de epifluorescencia antes de la imagen de rayos X, y esas rejillas deben evitarse a cualquier costo. En la Figura 5C, se puede observar una grieta dentro de la rejilla y el hielo vitrificado atravesando todo el cuadrado de la malla (marcado por las flechas rojas). Cualquier imagen cerca de grietas debe evitarse debido a la probable inestabilidad de la rejilla cuando se expone al haz. Además, las grietas pueden ser un signo de hielo grueso, como fue el caso en esta área. Se registró una serie de inclinación en el área marcada con la caja roja. En la figura 5D, se muestra un solo segmento de la reconstrucción 3D correspondiente. A pesar de que se pueden reconocer algunas estructuras más grandes, los detalles finos se pierden dentro del ruido y la textura granulosa debido a la mala calidad de vitrificación del hielo grueso, como se puede ver específicamente, por ejemplo, en las mitocondrias superiores apuntadas por la flecha.

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Figura 1: Flujo de trabajo. Flujo de trabajo esquemático seguido antes de la recopilación de datos crio-SXT. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Células en crecimiento en rejillas. (A) Células que crecen en una placa de Petri P100 con una confluencia de alrededor del 80% -90%. (B) Placa de Petri P60 con varias rejillas después de sembrar las células. (C) Células que crecen en la parte superior de una rejilla después de 24 h. Barras de escala: 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Rejillas de carga en los soportes de muestra y en la cámara de transferencia. (A) Estación de trabajo llena de nitrógeno líquido con el transbordador y las crioboxes listas para cargar las rejillas. (B) Soporte de muestra insertado en el cargador con la rejilla cargada. (C) Lanzadera con el portamuestras en la posición 3 sin la cubierta. (D) Estación de trabajo con la cámara de transferencia conectada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Carga de muestras en el TXM (A) Conexión de la cámara de transferencia al TXM. (B) Lanzadera dentro del TXM. (C) Brazo robótico TXM que inserta el soporte de la muestra en la etapa de muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Ejemplo de tomogramas de rayos X crioblables. Fila superior: muestra ideal, (A) Vista de mosaico 2D de un cuadrado de cuadrícula que muestra una celda aislada en el centro. (B) Una rebanada del volumen 3D reconstruido que muestra el área marcada con el cuadro rojo (A). En comparación con (D) la imagen es mucho más suave y se ven más detalles. Fila inferior: muestras no ideales, (C) vista de mosaico 2D de un cuadrado de cuadrícula que muestra una confluencia celular demasiado alta y grietas en el hielo y la lámina de la rejilla (flechas rojas). (D) Una rebanada del volumen 3D reconstruido que muestra el área marcada con el cuadro rojo en (C). La vitrificación pobre o subóptima se puede identificar por la textura granulosa de la imagen. N: Núcleo; M: Mitocondrias; ER: Retículo endoplásmico; MV: Cuerpos multivesiculares; V: Vacuola; Barras de escala: A & C 20 μm; B & D 2 μm.VHaga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

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La preparación de muestras es un paso crítico para obtener tomogramas de rayos X blandos de alta calidad, ya que su calidad depende directamente de la calidad de la vitrificación de la muestra y del espesor de la capa de hielo en la que está incrustada la célula. Las proyecciones con alta relación señal-ruido se recogerán en regiones con capa de hielo delgada, lo que permitirá minimizar la dosis de radiación requerida para lograr la mayor resolución posible. Además, la confluencia celular también afectará la calidad del tomograma final, ya que se debe evitar que las células vecinas entren en el FoV al rotar. Finalmente, la dispersión correcta de los marcadores Au fiduciales determinará la precisión de la alineación de proyección y luego determinará en última instancia la calidad del volumen final reconstruido en 3D. Tenga en cuenta que una distribución adecuada de Au fiducials en la cuadrícula permite la automatización del paso de alineación de proyección, sin el cual se necesita una gran experiencia para un paso tan crítico.

El protocolo aquí presente solo representa una posible estrategia de preparación de muestras, que tiene similitudes con las utilizadas en la criotomografía electrónica (crio-ET). En ambos casos, los protocolos que mejoren la exigente preparación de la muestra para una mejor reproducibilidad serán fundamentales para el éxito de estas técnicas, y se están realizando esfuerzos hacia este objetivo29. Vale la pena mencionar que, además de obtener imágenes de células aisladas, también se pueden visualizar secciones de tejido siempre que la señal de transmisión a través de la sección sea suficiente en ángulos de inclinación altos. Por lo general, esto implicará secciones de pocas micras (por debajo de 10 μm).

Para obtener una imagen de una estructura o evento específico dentro de una celda, uno debe asegurarse de que esta característica en particular esté dentro del FoV de la serie de inclinación. Como el FoV en crio-SXT está limitado a 10 x 10 μm2 a 15 x 15 μm2 dependiendo de la lente y teniendo en cuenta un sobremuestreo de píxeles de la resolución a al menos un factor de 2, a menudo es más pequeño que la extensión completa de la celda (ver los cuadrados rojos indicados en la Figura 5). Por lo tanto, el ROI debe encontrarse y etiquetarse adecuadamente. Esto generalmente se hace por medio de etiquetas fluorescentes y enfoques correlativos de luz visible. Las estrategias 2D que combinan la epifluorescencia son sencillas, ya que el microscopio de transmisión de rayos X blando tiene un microscopio de fluorescencia de luz visible en línea integrado, pero otros enfoques para la señal de fluorescencia 2D o 3D de alta resolución también están disponibles 4,12,13,15,16 . En esos casos, la cuadrícula debe ser fotografiada primero en instrumentos específicos, como microscopios de súper resolución. Tenga en cuenta que los enfoques correlativos más eficientes son aquellos que involucran la recopilación de datos en condiciones criogénicas. Esto se debe a que el lapso de tiempo entre la temperatura ambiente (RT), las imágenes de fluorescencia de luz visible y la vitrificación de muestras, por ejemplo, dificultará la captura del evento celular correcto a tiempo; además, el procedimiento de vitrificación podría separar la celda de interés que se ha fotografiado en RT de la cuadrícula. Incluso si la mayoría de los enfoques de imágenes correlativas podrían implicar que las rejillas de muestra tienen que ser manipuladas y transportadas de un instrumento a otro, y a pesar del mayor riesgo de contaminación o daño de la red que esto plantea, la recompensa es clara: poder identificar eventos o moléculas específicas dentro del paisaje celular.

Cuando se requieren imágenes de células enteras, es posible coser diferentes tomogramas siempre que la dosis total aplicada no exceda el límite de daño por radiación. Por lo general, la dosis depositada para recolectar pocos tomogramas en la misma célula está muy por debajo del límite a la resolución alcanzable (109 Gy) y, por lo tanto, no se requiere una estrategia específica para reducir la dosis, aunque esto depende de la muestra y del experimento. En el caso de la recopilación intensiva de datos, como la espectrotomografía, sería necesario reducir al mínimo la dosis y sería necesario aplicar estrategias convenientes de recopilación de datos y procesamiento específicos.

Cryo-SXT tiene varias limitaciones, que deben mencionarse aquí. La primera es la conocida cuña faltante, que es intrínseca al uso de soportes de muestra plana. Los soportes de muestra capilar que permiten una rotación de 180 grados se han utilizado en el pasado y todavía se utilizan en algunas instalaciones, pero también presentan inconvenientes como un contraste empobrecido debido a la absorción de vidrio y la restricción del uso de células en suspensión. Una forma de disminuir el efecto de la cuña faltante es mediante la realización de una tomografía de doble inclinación. Esto es posible en la línea de haz Mistral hoy en día. La segunda limitación es establecida por la lente de placa de la zona de Fresnel utilizada en tales microscopios. Esta lente establece la resolución final alcanzable y la profundidad de campo (DoF), ambas estrechamente relacionadas. Esto implica que aumentar la resolución disminuirá el DoF, mientras que el grosor de la célula a menudo será mayor. Por ejemplo, una lente de 40 nm tendrá en teoría un DoF de 3 μm y una resolución de 24,4 nm de medio paso. El compromiso entre resolución y DoF es, por lo tanto, estratégico y la elección de la lente dependerá del tipo de celda30,31. Finalmente, los TXM operativos en todo el mundo están lejos de ser microscopios ideales y se están haciendo esfuerzos para mejorar los sistemas ópticos para alcanzar las expectativas teóricas. Finalmente, la visualización y segmentación de los volúmenes reconstruidos se puede llevar a cabo con herramientas de software específicas 25,32,33,34.

En resumen, crio-SXT permite obtener imágenes de células cuantitativamente a resolución media (25-30 nm de medio paso) y en números estadísticos (pocas decenas de tomogramas por día). Esto permite obtener la organización, distribución y dimensión de los orgánulos en condiciones específicas, por ejemplo, durante infecciones o enfermedades patógenas, en puntos de tiempo precisos o después de tratamientos particulares. Es, por lo tanto, una técnica de imagen biológica complementaria útil para las microscopías de electrones y luz visible más comunes, cada una de ellas abordando un rango específico de dimensiones y resolución de la muestra. Cryo-SXT se utiliza con frecuencia en enfoques correlativos que involucran fluorescencia de luz visible, pero también son posibles otras estrategias criocorrectivas.

Divulgaciones

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Los autores declaran no tener conflicto de intereses.

Agradecimientos

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Este proyecto ha recibido financiación del proyecto iNEXT-Discovery Horizonte 2020 de la Comisión Europea y del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en virtud del acuerdo de subvención Marie Skłodowska-Curie n.º 75439.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
AmiraThermo FisherSoftware para la segmentación
Au Holey Carbon Films  rejillas de búsqueda(Quantifoil Micro Tools Gmb  R 2/2 Au G200F1Au Holey Carbon Films rejillas buscadoras Au
nanopartículas  BBI Group, Cardiff, Reino UnidoNanopartículas de Au 100nm100 nm Nanopartículas de Au (NPs) en Mistral (Alba)
Nanopartículas de Au  BBI Group, Cardiff, Reino UnidoNanopartículas de Au 250nm250 nm Nanopartículas de Au (NPs) en B24 (Diamante)
Axio Scope A1Zeiss430035 9060Microscopio de fluorescencia
Papel de filtro Blotting No.1WhatmanWHA10010155Filtro secante Bsoft
Software para alineación, reconstrucción y visualización de proyecciones (Heymann et al., 2008)
ChimeraSoftware para la segmentación (Pettersen et al. 2004)
Cryo-EM Glow Discharge SetPELCO easiGlow91000SSistema de limpieza de descarga incandescente
Cu Holey Carbon Films  rejillas de búsqueda(Quantifoil Micro Tools Gmb  R 2/2Cu G200F1Cu Holey Carbon Films rejillas buscadoras
Suero fetal para ternerosSigmaF9665Heat Inactivado, filtrado estéril, apto para cultivo celular
ImageJSoftware para el procesamiento y análisis de imágenes en Java (NIH & LOCI Universidad de Wisconsin)
IMODpara alineación, reconstrucción y visualización de proyecciones (Kremer et al., 1996)
Émbolo de rejilla Leica EM GP Congeladorde inmersión automático Leica16706401
LINKAM Etapa criogénicaLinkam Scientific InstrumentsCMS 196Platina de microscopía criocorrelativa
MIBSoftware para la segmentación (Belevich et al. 2016)
P100 Placa de PetriSigmaP6106Tratada para cultivo celular y
estéril P60 Placa de PetriSigmaD8054Tratada para cultivo celular y
estéril PolilisinaSigmaP4707Solución de poli-L-lisina 0,01%, estéril filtrada
Microscopio de rayos X blando 0,25-1,2keVXradiaNCT-SBTransmisión suave Microscopio de rayos X
SURVOSSoftware para segmentación  (Luengo et al. 2017)
Tomo3dSoftware para la reconstrucción (SIRT, WBP) (Agulleiro et al. 2011)
TomoJSoftware para la reconstrucción (ART) (Messaoudi et al., 2007)
XM Data ExplorerZeissTXM software
Software EM

Referencias

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