Caracterización funcional de variantes de RYR1 humanas expresadas endógenamente

Susan Treves; Thierry Girard; Francesco Zorzato

doi:10.3791/62196

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Artículo de método

Caracterización funcional de variantes de RYR1 humanas expresadas endógenamente

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DOI:

10.3791/62196

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9 de junio de 2021

Susan Treves¹^,² , Thierry Girard³ , Francesco Zorzato¹^,²

¹Department of Biomedicine, Basel University Hospital, ²Department of Life Sciences, University of Ferrara, ³Department of Anesthesia, Basel University Hospital

En este artículo

Resumen

Aquí se describen los métodos utilizados para estudiar el efecto funcional de las mutaciones RYR1 expresadas endógenamente en los linfocitos B humanos inmortalizados por el virus de Epstein Barr y las células satélite derivadas de biopsia muscular diferenciadas en miotubos.

Resumen

Se han identificado más de 700 variantes en el gen RYR1 en pacientes con diferentes trastornos neuromusculares incluyendo susceptibilidad a hipertermias malignas, miopatías centrales y miopatía centronuclear. Debido a los diversos fenotipos vinculados a las mutaciones RYR1 es fundamental caracterizar sus efectos funcionales para clasificar las variantes que portan los pacientes para futuras intervenciones terapéuticas e identificar variantes no patógenas. Muchos laboratorios se han interesado en desarrollar métodos para caracterizar funcionalmente las mutaciones RYR1 expresadas en las células de los pacientes. Este enfoque tiene numerosas ventajas, que incluyen: las mutaciones se expresan endógenamente, RyR1 no se sobreexpresa, se evita el uso de células heterólogas que expresan RyR1. Sin embargo, dado que los pacientes pueden presentar mutaciones en diferentes genes aparte de RYR1, es importante comparar los resultados del material biológico de individuos que albergan la misma mutación, con diferentes antecedentes genéticos. El presente manuscrito describe métodos desarrollados para estudiar los efectos funcionales de las variantes RYR1 expresadas endógenamente en: (a) linfocitos B humanos inmortalizados por el virus de Epstein Barr y (b) células satélite derivadas de biopsias musculares y diferenciadas en miotubos. Luego se monitorean los cambios en la concentración intracelular de calcio desencadenados por la adición de un activador farmacológico de RyR1. El tipo de célula seleccionado está cargado con un indicador de calcio fluorescente ratiométrico y los cambios intracelulares [Ca²⁺] se monitorean a nivel de una sola célula mediante microscopía de fluorescencia o en poblaciones celulares utilizando un espectrofluorómetro. Las curvas de respuesta a dosis agonistas en reposo [Ca^2+],se comparan entre las células de los controles sanos y los pacientes que albergan variantes de RYR1, lo que lleva a una idea del efecto funcional de una variante dada.

Introducción

Hasta la fecha, se han identificado más de 700 variantes de RYR1 en la población humana y se han relacionado con diversos trastornos neuromusculares, incluida la susceptibilidad a la hipertermia maligna (MHS), la rabdomiólisis inducida por el ejercicio, la enfermedad del núcleo central (CCD), la enfermedad multi-minicore (MmD), la miopatía centronuclear (CNM)¹^,²^,³ ; sin embargo, los estudios para caracterizar sus efectos funcionales están rezagados y solo aproximadamente el 10% de las mutaciones se han probado funcionalmente. Se pueden utilizar diferentes enfoques experimenta....