Producción de nanogotas de decafluorobutano de cambio de fase filtradas por membrana a partir de microburbujas preformadas

Resumen

Este protocolo describe un método para generar grandes volúmenes de microburbujas de decafluorobutano encapsuladas en lípidos utilizando sonicación de punta de sonda y posteriormente condensarlos en nanogotas de cambio de fase utilizando extrusión de alta presión y filtración mecánica.

Resumen

Hay muchos métodos que se pueden utilizar para la producción de gotas vaporizables de cambio de fase para imágenes y terapia. Cada método utiliza diferentes técnicas y varía en precio, materiales y propósito. Muchos de estos métodos de fabricación dan como resultado poblaciones polidispersas con umbrales de activación no uniformes. Además, el control de los tamaños de las gotas generalmente requiere líquidos de perfluorocarbono estables con altos umbrales de activación que no son prácticos in vivo. Producir tamaños de gotas uniformes utilizando gases de bajo punto de ebullición sería beneficioso para los experimentos de imagen y terapia in vivo. Este artículo describe un método simple y económico para la formación de nanogotas de cambio de fase estabilizadas por lípidos filtradas por tamaño con decafluorobutano (DFB) de bajo punto de ebullición. Se describe un método común para generar microburbujas lipídicas, además de un nuevo método para condensarlas con extrusión a alta presión en un solo paso. Este método está diseñado para ahorrar tiempo, maximizar la eficiencia y generar mayores volúmenes de soluciones de microburbujas y nanogotas para una amplia variedad de aplicaciones utilizando equipos de laboratorio comunes que se encuentran en muchos laboratorios biológicos.

Introducción

Los agentes de contraste por ultrasonido (UCA) están creciendo rápidamente en popularidad para aplicaciones de imágenes y terapia. Las microburbujas, los UCA originales, son actualmente los agentes principales utilizados en aplicaciones de diagnóstico clínico. Las microburbujas son esferas llenas de gas, típicamente de 1-10 μm de diámetro, rodeadas de capas de lípidos, proteínas o polímeros1. Sin embargo, su tamaño y estabilidad in vivo pueden limitar su funcionalidad en muchas aplicaciones. Las nanogotas de cambio de fase, que contienen un núcleo líquido sobrecalentado, pueden superar algunas de estas limitaciones debido a su tamaño más pequeñ....

Protocolo

1. Hacer películas lipídicas

1. Prepare películas lipídicas para la generación de microburbujas utilizando 90% DSPC y 10% DSPE-PEG2K mezclando los lípidos en la proporción correcta utilizando las siguientes instrucciones:
   1. Hacer lípidos de stock de DSPC y DSPE-PEG2K en cloroformo. Pesar 50 mg de cada polvo lipídico en viales separados. Añadir 1 ml de cloroformo a cada vial con una jeringa de vidrio de 1 ml.
   2. Añadir 287 μL de material DSPC y 113 μL de DSPE-PEG2K (ambos 50 mg/ml) en un vial de centelleo de 20 ml utilizando una jeringa de vidrio.
   3. Secar los lípidos mezclados para eliminar el cloroformo usando nitrógeno. Utilizando una lo....

Resultados

Los resultados representativos de la distribución de tamaño se incluyen mediante el análisis de dispersión dinámica de luz (DLS) y detección de pulso resistivo sintonizable (TRSP). La Figura 5 muestra la distribución de tamaño de las soluciones de burbujas condensadas con y sin extrusión. Sin extrusión, el protocolo termina en el paso 5.3. Las burbujas refrigeradas se condensan ventilando la muestra a presión atmosférica mientras está fría. La única muestra condensada tiene una distribución .......

Discusión

Hay disponible un cuerpo completo de literatura que analiza la formulación, la física y las aplicaciones potenciales de las microburbujas y las gotas de cambio de fase para imágenes y terapia in vivo. Esta discusión se refiere explícitamente a la generación de microburbujas lipídicas y su conversión en gotas de cambio de fase submicrométricas utilizando un gas DFB de bajo punto de ebullición y extrusión a alta presión. El método descrito aquí está destinado a proporcionar un método relativamente simple de producir grande.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubos de centrífuga de 15 mL Falcon		352095	Recogida y centrifugación de gotas Filtro
policarbonato de 200 nm	Whatman	110606	Filtros extrusores
2-metilbutano	Fisher Chemical	03551-4	Preenfriamiento rápido de la solución de microburbujas antes de la extrusión
Pinzas de 3 puntas X2	Fisher	02-217-002	Mantener los viales de centelleo en su lugar para la sonicación de la punta de la sonda
400W Sonicador de punta de sonda analógica con bocina	Branson	101-063-198R	Se utiliza para generar microburbujas lipídicas a partir de una solución lipídica
Sonicador	de baño Fisher Scientific	15337402	Se utiliza para ayudar a descomponer los liposomas en vesículas unilaminares
Cloroformo	Biorreactivos	Fisher C298-4	Se utiliza para hacer películas lipídicas para la
preparación de microburbujasDecafluorobutano (Perfluorobutano) Gas	FluoroMed L.P.	1 kg	que genera microburbujas a través de la sonicación de la punta de la sonda
Hielo seco	:		preenfriamiento rápido de la solución de microburbujas antes de la extrusión
DSPC Polvo lipídico	NOF America	COATSOME MC-8080	Componente de la película lipídica
DSPE-PEG-2K Polvo lipídico	NOF America	SUNBRIGHT DSPE-020CN	Componente de la película lipídica
Termómetro general	-	-	Se utiliza para medir la temperatura del baño de hielo y la temperatura del 2-metilbutano (debe adaptarse a temperaturas de -20 °C)
Jeringas de vidrio	Hamilton	81139	Se utiliza para mezclar lípidos en cloroformo
Glicerol	Fisher Bioreactivos	BP229-1	Reduce la temperatura de congelación de la solución de PBS
Bloque calefactor	VWR Scientific Products		Calentamiento de películas lipídicas y gotas vaporizadoras
Lipex 10 Extrusora mL	Evonik		Sistema de extrusión comercial de alta presión
Mini mezclador de vórtice	Marca Fisher	14-955-151	Se utiliza para eliminar el exceso de cloroformo de las películas lipídicas Tanque de
nitrógeno	:		se utiliza para operar la extrusora
Tampón de fosfato Solución salina	Fisher Scientific		Hydrate películas lipídicas y gotas de lavado
Disco	de drenaje de poliésterWhatman	230600	Proporciona soporte para filtro de policarbonato
Tapas de polipropileno	Fisher Scientific	298417	Se utiliza para el almacenamiento de soluciones
Propilenglicol	Fisher Chemical	P355-1	Reduce la temperatura de congelación de la solución de PBS Viales de
Scintiliation	DWK Life Sciences Wheaton 986532		Se utiliza para películas lipídicas y generación de microburbujas
Pequeño martillo	-		Se utiliza para romper el hielo seco para enfriar el metilbutano
Sonicator Microtip	Attachment Branson		101148070 Se utiliza para generar microburbujas a partir de una solución lipídica
Contenedor de acero	Medegen	79310	Preenfriamiento rápido de la solución de microburbujas antes de la extrusión (cualquier recipiente clasificado para -20C funcionará)
Desecador al vacío	Bel-Art SP Scienceware	08-648-100	Elimina el exceso de cloroformo de las películas lipídicas Tubo de
centrífuga de 2 ml	Fisher	02682004	utilizado para concentrar nanogotas

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