Aquí, presentamos un ensayo de co-cultivo fácil de usar para analizar la migración de glioblastoma (GBM) en neuronas modeladas. Desarrollamos una macro en el software FiJi para una fácil cuantificación de la migración de células GBM en las neuronas, y observamos que las neuronas modifican la capacidad invasiva de las células GBM.
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Artículo de método
Co-cultivo De Glioblastoma Células Madre-como En Las Neuronas Modeladas Para Estudiar La Migración Y Las Interacciones Celulares
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Resumen
Resumen
Los glioblastomas (GBMs), gliomas malignos de grado IV, son uno de los tipos más mortales de cáncer humano debido a sus características agresivas. A pesar de los avances significativos en la genética de estos tumores, cómo las células GBM invaden el parénquima cerebral sano no se entiende bien. En particular, se ha demostrado que las células GBM invaden el espacio peritumoral a través de diferentes rutas; el principal interés de este trabajo es la ruta a lo largo de los tractos de materia blanca (WMTs). Las interacciones de las células tumorales con los componentes de la célula nerviosa peritumoral no están bien caracterizadas. Aquí, se ha descrito un método que evalúa el impacto de las neuronas en la invasión celular GBM. Este papel presenta un análisis in vitro avanzado de la co-cultura que mímico la invasión de WMT analizando la migración de GBM vástago-como las células en neuronas. El comportamiento de las células GBM en presencia de neuronas se monitorea mediante el uso de un procedimiento de seguimiento automatizado con software de código abierto y de libre acceso. Este método es útil para muchas aplicaciones, en particular, para estudios funcionales y mecanicistas, así como para analizar los efectos de los agentes farmacológicos que pueden bloquear la migración celular GBM en las neuronas.
Introducción
Las gliomas malas primarias, incluyendo GBMs, son tumores devastadores, con una tasa de supervivencia media de 12 a 15 meses divulgada para los pacientes de GBM. La terapia actual se basa en la resección de la masa tumoral grande y la quimioterapia juntadas con la radioterapia, que extiende solamente la tasa de supervivencia por pocos meses. Los fracasos terapéuticos están íntimamente relacionados con la mala administración de fármacos a través de la barrera hematoencefálica (BBB) y con el crecimiento invasivo en espacios perivascularios, meninges y a lo largo de las TMM1. La invasión perivascularia, también llamada cooptación vascular, es un p....
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Protocolo
Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes (del Hospital Haukeland, Bergen, Noruega, de acuerdo con las regulaciones del comité de ética local). Este protocolo sigue las directrices de los comités de ética de la investigación humana y animal de la Universidad de Burdeos. Las ratas embarazadas fueron alojadas y tratadas en las instalaciones para animales de la Universidad de Burdeos. La eutanasia de una rata embarazada de E18-timed fue realizada usando elCO2. Todos los procedimientos para animales se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales y aprobados por el comité de ética local. Todos los productos comerci....
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Resultados
Las neuronas modeladas co-cultivadas con las células fluorescentes de GBM fueron preparadas según lo descrito en la sección del protocolo, y los experimentos de seguimiento fueron realizados. Las células GBM modificaron rápidamente su forma mientras migraban sobre las neuronas (Figura 1B:panel 6 y Video 1). Las células migraron a lo largo de las extensiones neuronales, en un movimiento aleatorio (Video 1). Las células fluorescentes GBM y las.......
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Discusión
Los glioblastomas invaden ampliamente el parénquima mediante el uso de diferentes modos: cooptación de los vasos sanguíneos circundantes, invasión intersticial o invasión en las TMM18. Este último modo no se caracteriza bien en la literatura debido a la dificultad en encontrar los modelos ines vitro o in vivo convenientes relacionados con la invasión de WMT. Aquí, se ha propuesto un modelo simplificado en el que las neuronas de roedores cultivadas se modelaron en superficies recu.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por fondation ARC 2020, Ligue Contre le Cancer (Comite de la Gironde), ARTC, Plan Cancer 2021, INCA PLBIO. Alveole cuenta con el apoyo de la Agence Nationale de la Recherche (Grant Labex BRAIN ANR-10-LABX-43). Joris Guyon ha recibido una beca del Hospital Universitario de Toulouse (CHU Toulouse).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| (3-aminopropilo) trietoxisilano | Sigma | 440140-100ML | El grupo amino es útil para la bioconjugación de mPEG-SVA Placa de |
| fondo redondo de 96 pocillos | Sarstedt | 2582624 | Se utiliza para preparar esferoides |
| Accutase | Gibco | A11105-01 | Almacenado a -20 & grados; C (a largo plazo) o 4 ° C (a corto plazo), enzima de disociación esférica |
| B27 | Gibco | 12587 | Almacenado a -20 & grados; C, descongelar antes de usar |
| Factor de crecimiento básico de fibroblastos | Peprotech | 100-18B | Almacenado a -20 ° C, descongelar antes de usar |
| Countess Cámara de recuento de célulasSlides | Invitrogen | C10283 | Se utiliza para el recuento de células |
| Cubreobjetos | Marienfeld | 111580 | Sustrato de cultivo celular |
| Cartuchos desecadores Sigma | Z363456-6EA | Se utiliza para reducir la humedad durante el tratamiento con trietoxisilano (3-aminopropilo) | |
| DPBS 10x | Pan Biotech | P04-53-500 | Almacenado a 4 ° C |
| Fiji software, MTrack2 macro | ImageJ | Utilizado para analizar imágenes | |
| Matraz 75 cm² | Falcon | 10497302 | |
| HBSS | Sigma | H8264-500ML | |
| Heparina sódica | Sigma | H3149-100KU | Almacenado a 4 & grados; C |
| Laminin | 114956-81-9 | Promueve la adhesión neuronal | |
| software | carga de micropatrones imaginados | ||
| MetaMorph Software | Molecular Devices LLC | NA | Software de automatización de microscopía |
| Metilcelulosa | Sigma | M0512 | Diluido en NBM para una concentración final del 2% |
| Medio neurobasal | Gibco | 21103-049 | Almacenado a 4 & grados; C |
| Microscopio invertido Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA) | equipado con una platina motorizada | ||
| Penicilina - Estreptomicina | Gibco | 15140-122 | almacenada a 4 & grados; C |
| PLPP | Alveole | PLPPclassic_1ml | Fotoiniciador utilizado para degradar el cepillo PEG |
| Valerato de poli(etilenglicol)-succinimidilo (mPEG-SVA) | Laysan Bio | VA-PEG-VA-5000-5g | Utilizado como recubrimiento antiincrustante |
| PRIMO | Alveole | PRIMO1 | Aparato de proyección UV basado en dispositivo de microespejo digital (DMD) |
| Azul de tripán 0.4% | ThermoFisher | T10282 | Se utiliza para el recuento de células |
| Tripsina-EDTA | Sigma | T4049-100ML | Se utiliza para separar las células adherentes |
Referencias
- Shergalis, A., Bankhead, A., Luesakul, U., Muangsin, N., Neamati, N. Current challenges and opportunities in treating glioblastoma. Pharmacology Reviews. 70, 412-445 (2018).
- Scherer, H. J. The forms of growth in gliomas and their practical significance. Brain. 63
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Reimpresiones y permisos
