Aquí, presentamos un protocolo para producir un gran número de exosomas de grado GMP a partir de células madre mesenquimales del líquido sinovial utilizando un biorreactor 3D.
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Artículo de método
Preparación a gran escala de exosomas derivados de células madre mesenquimales del líquido sinovial mediante cultivo de biorreactores 3D
En este artículo
Resumen
Resumen
Los exosomas secretados por las células madre mesenquimales (MSC) se han sugerido como candidatos prometedores para las lesiones del cartílago y el tratamiento de la osteoartritis. Los exosomas para aplicación clínica requieren una producción a gran escala. Con este objetivo, las MSC de líquido sinovial humano (hSF-MSC) se cultivaron en perlas de microportadores y luego se cultivaron en un sistema de cultivo dinámico de tres dimensiones (3D). Mediante la utilización de la cultura dinámica 3D, este protocolo obtuvo con éxito exosomas a gran escala a partir de sobrenadantes de cultivo SF-MSC. Los exosomas se cosecharon por ultracentrifugación y se verificaron mediante un microscopio electrónico de transmisión, un ensayo de transmisión de nanopartículas y Western blotting. Además, se detectó la seguridad microbiológica de los exosomas. Los resultados de la detección de exosomas sugieren que este enfoque puede producir un gran número de exosomas de grado de buenas prácticas de fabricación (GMP). Estos exosomas podrían utilizarse en la investigación de la biología de exosomas y el tratamiento clínico de la osteoartritis.
Introducción
La osteoartritis (OA), resultante del cartílago articular y la descomposición ósea subyacente, sigue siendo un desafío grave que conduce a la discapacidad 1,2. Sin suministro de sangre y nervios, la capacidad de autocuración del cartílago es mínima una vez lesionado 3,4. En las últimas décadas, las terapias basadas en la implantación autóloga de condrocitos (ACI) han progresado en el tratamiento de la OA5. Para el aislamiento y la expansión de los condrocitos, es necesario extraer cartílago pequeño del área que no soporta peso d....
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Protocolo
Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética Humana del Segundo Hospital Popular de Shenzhen. En la Figura 1 se muestra un diagrama esquemático de exosomas aislados del protocolo in vitro hSF-MSC.
1. Cultura e identificación de SF-MSCs humanas
- Recolectar 20 ml de SF usando una jeringa y una aguja de pacientes clínicos con OA.
- Desinfecte la articulación de la rodilla del paciente con OA. Punción del tendón femoral cuádriceps fuera de la rótula en la cavidad articular con una aguja 7#.
- Extraer 10 mL del líquido articular. Cubra el sitio de punción con la v....
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Resultados
La citometría de flujo fue utilizada para identificar los marcadores de superficie de las SF-MSCs, de acuerdo con los criterios mínimos para definir las MSCs humanas recomendados por la International Society for Cellular Therapy14,15. El análisis de citometría de flujo reveló que las SF-MSCs cultivadas en este estudio cumplieron con los criterios de identificación de las MSCs. Fueron negativos para CD34, CD45 y HLA-DR (por debajo del 3%) y positivos para CD73, CD.......
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Discusión
Las células madre mesenquimales han sido ampliamente utilizadas en medicina regenerativa debido a su autorrenovación, diferenciadas en células tisulares con funciones especializadas y efectos paracrinos16,17. Cabe destacar que los efectos paracrinos ejercidos por los exosomas han atraído mucha atención18. Los exosomas transportan la bioinformación de las MSC y realizan su función biológica y superan las deficiencias de MSC, como el almacen.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81972116, Nº 81972085, Nº 81772394); Programa clave de la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Guangdong (No.2018B0303110003); Proyecto de Cooperación Internacional de Guangdong (No.2021A0505030011); Proyectos de Ciencia y Tecnología de Shenzhen (No. GJHZ20200731095606019, No. JCYJ20170817172023838, No. JCYJ20170306092215436, No. JCYJ20170413161649437); Fundación de Ciencias Postdoctorales de China (No.2020M682907); Fundación de Investigación Básica y Aplicada de Guangdong (No.2021A1515010985); Proyecto Sanming de Medicina en Shenzhen (SZSM201612079); Fondos especiales para la construcción de hospital....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Kit de ensayo BCA | ThermoFisher | 23227 | Ensayo de concentración de proteínas |
| Placa de agar sangre | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd. | P0903 | Cultivo de bacterias |
| anticuerpo CD105 | Elabscience | E-AB-F1243C | Citometría de flujo |
| anticuerpo CD34 | Elabscience | E-AB-F1143C | Citometría de flujo |
| anticuerpo CD45 | BD Bioscience | 555483 | Citometría de flujo |
| anticuerpo CD63 | Abclonal | A5271 | Western blot |
| anticuerpo CD73 | Elabscience | E-AB-F1242C | Citometría de flujo |
| anticuerpo CD81 | ABclonal | A5270 | Western blot |
| CD9 anticuerpo | Abclonal | A1703 | Western blot |
| anticuerpo CD90 | Elabscience | E-AB-F1167C | Citometría |
| de flujo Centrífuga | Eppendorf | 5810R | |
| Incubadora de CO2 | Termo | Cultivo celular | |
| Confocal microscopía de fluorescencia de barrido láser | ZEISS | LSM 800 | |
| Cytodex | GE Healthcare | Microcarrier | |
| Dil | ThermoFisher | D1556 | Etiqueta de exosomas |
| EZ-PCR Kit de detección de micoplasma | BI | 20-700-20 Detección de | micoplasma |
| Citometría de flujo Identificación | de Beckman | MSC | |
| Sistema Gene Pulser II | Bio-Rad Laboratories | 1652660 | Transfección de genes |
| GraphPad Prism 8.0.2 | GraphPad Software, Inc. | Versión 8.0.2 | |
| Anticuerpo HLA-DR | Elabscience | E-AB-F1111C | Citometría de flujo |
| Medio de cultivo de Lowenstein-Jensen | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd. | T0573 | Cultivo de Mycobacterium tuberculosis |
| MesenGro | StemRD | MGro-500 | Cultivo MSC |
| Nanosight NS300 | Malvern | Nanosight NS300 | Análisis de seguimiento de nanopartículas |
| Software NTA 2.3 | Malvern | Análisis de datos | |
| Odyssey FC | Gene Company Limited | Western blot fluorescente | |
| OptiPrep tampón de electroporación | Sigma | D3911 | Transfección |
| Cóctel de inhibidores de la proteasa | Sigma | P8340 | Inhibidor de la proteinasa |
| RNasa A | Qiagen | 158924 | Eliminación de ARN |
| Placa de agar Sabouraud | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd. | P0919 | Cultivo de hongos |
| TEM | JEM-1200EX | ||
| El Sistema de Cultivo Celular Rotativo (RCCS) | Synthecon | RCCS-4HD | Cultivo 3D |
| Ultracentrífuga | Beckman | Optima XPN-100 | Centrífuga de exosomas |
Referencias
- Cross, M., et al. The global burden of hip and knee osteoarthritis: estimates from the global burden of disease 2010 study. Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (7), 1323-1330 (2014).
- Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B.
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Reimpresiones y permisos
