Artículo de método

Preparación a gran escala de exosomas derivados de células madre mesenquimales del líquido sinovial mediante cultivo de biorreactores 3D

DOI:

10.3791/62221

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26 de julio de 2022

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1Department of Orthopedics, The First affiliated hospital of Shenzhen University, Shenzhen Second People's Hospital, 2Guangdong Provincial Research Center for Artificial Intelligence and Digital Orthopedic Technology, Shenzhen Second People's Hospital, 3Department of Child and Adolescent Psychiatry, Shenzhen Kangning Hospital, Shenzhen Mental Health Center, Shenzhen Key Laboratory for Psychological Healthcare & Shenzhen Institute of Mental Health

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, presentamos un protocolo para producir un gran número de exosomas de grado GMP a partir de células madre mesenquimales del líquido sinovial utilizando un biorreactor 3D.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los exosomas secretados por las células madre mesenquimales (MSC) se han sugerido como candidatos prometedores para las lesiones del cartílago y el tratamiento de la osteoartritis. Los exosomas para aplicación clínica requieren una producción a gran escala. Con este objetivo, las MSC de líquido sinovial humano (hSF-MSC) se cultivaron en perlas de microportadores y luego se cultivaron en un sistema de cultivo dinámico de tres dimensiones (3D). Mediante la utilización de la cultura dinámica 3D, este protocolo obtuvo con éxito exosomas a gran escala a partir de sobrenadantes de cultivo SF-MSC. Los exosomas se cosecharon por ultracentrifugación y se verificaron mediante un microscopio electrónico de transmisión, un ensayo de transmisión de nanopartículas y Western blotting. Además, se detectó la seguridad microbiológica de los exosomas. Los resultados de la detección de exosomas sugieren que este enfoque puede producir un gran número de exosomas de grado de buenas prácticas de fabricación (GMP). Estos exosomas podrían utilizarse en la investigación de la biología de exosomas y el tratamiento clínico de la osteoartritis.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La osteoartritis (OA), resultante del cartílago articular y la descomposición ósea subyacente, sigue siendo un desafío grave que conduce a la discapacidad 1,2. Sin suministro de sangre y nervios, la capacidad de autocuración del cartílago es mínima una vez lesionado 3,4. En las últimas décadas, las terapias basadas en la implantación autóloga de condrocitos (ACI) han progresado en el tratamiento de la OA5. Para el aislamiento y la expansión de los condrocitos, es necesario extraer cartílago pequeño del área que no soporta peso de la articulación OA, causando lesiones en el cartílago. Además, el procedimiento requerirá una segunda operación para implantar los condrocitos expandidos6. Por lo tanto, las terapias de un solo paso para el tratamiento de la OA sin lesiones del cartílago están bajo una exploración exhaustiva.

Las células madre mesenquimales (CMM) han sido sugeridas como alternativas prometedoras para el tratamiento de la OA 7,8. Originadas en múltiples tejidos, las MSC pueden diferenciarse en condrocitos con estimulación específica. Es importante destacar que las MSC pueden modular las respuestas inmunes a través de la antiinflamación9. Por lo tanto, las MSC tienen ventajas significativas en el tratamiento de la OA al reparar defectos del cartílago y modular la respuesta inmune, especialmente en el entorno inflamatorio. Para el tratamiento de la OA, las MSC del líquido sinovial (SF-MSC) han atraído recientemente mucha atención debido a su capacidad de diferenciación de condrocitos más fuerte que otras fuentes de MSC10,11. En particular, en la clínica ortopédica, la extracción de SF inflamatorio de la cavidad articular es una terapia de rutina para aliviar el síntoma de dolor de los pacientes con OA. El SF inflamatorio extraído generalmente se elimina como desechos médicos. Tanto los pacientes como los médicos están listos para considerar las CMM autólogas aisladas del SF inflamatorio como tratamiento de OA con muy pocos conflictos éticos. Sin embargo, la terapia SF-MSC se ve comprometida debido a los riesgos tumorigénicos, el almacenamiento prolongado y las barreras de envío distantes.

Los exosomas, secretados por muchos tipos de células, incluidas las MSC, llevan la mayor parte de la bioinformación de las células madre. Ha sido investigado en profundidad como terapia libre de células12,13. De acuerdo con los recursos actualizados disponibles en el sitio web del gobierno de ensayos clínicos (ClinicalTrials.gov), se inician y realizan estudios clínicos de exosomas más extensos en los campos de investigación del cáncer, la hipertensión y las enfermedades neurodegenerativas. El tratamiento con exosomas SF-MSC podría ser un ensayo emocionante y desafiante para hacer frente a la OA. La producción de exosomas a gran escala y de grado de buenas prácticas de fabricación (GMP) es esencial para la traducción clínica. El aislamiento de exosomas a pequeña escala se ha realizado ampliamente en base al cultivo celular bidimensional (2D). Sin embargo, las estrategias de producción de exosomas a gran escala necesitan optimización. En este estudio se desarrolló un método de fabricación de exosomas a gran escala, basado en el cultivo masivo de SF-MSC en condiciones libres de xeno. Después de la ultracentrifugación de sobrenadantes de cultivo celular, se validó la seguridad y la función del exosoma.

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Protocolo

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Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética Humana del Segundo Hospital Popular de Shenzhen. En la Figura 1 se muestra un diagrama esquemático de exosomas aislados del protocolo in vitro hSF-MSC.

1. Cultura e identificación de SF-MSCs humanas

  1. Recolectar 20 ml de SF usando una jeringa y una aguja de pacientes clínicos con OA.
    1. Desinfecte la articulación de la rodilla del paciente con OA. Punción del tendón femoral cuádriceps fuera de la rótula en la cavidad articular con una aguja 7#.
    2. Extraer 10 mL del líquido articular. Cubra el sitio de punción con la varilla de transfusión y presione durante 5 min.
  2. Desechar el sobrenadante SF después de la centrifugación a 1.500 x g durante 10 min a 4 °C.
  3. Resuspender el pellet celular con 10 ml de solución salina tampón fosfato 1x (PBS), centrifugar a 1.500 x g durante 10 min a 4 °C y desechar el PBS.
  4. Resuspender el pellet con 10 ml de medio de cultivo de MSC humano a una densidad celular de 5 x 104 células/ml (ver Tabla de materiales) y luego colocar la suspensión en una placa de 100 mm.
  5. Incubar el plato a 37 °C en una atmósfera que contenga un 5% deCO2.
  6. Después de 48 h, retire las células no adherentes cambiando el medio y lave con 1x PBS. Reemplace el medio cada 3 días durante 2 semanas.
  7. Recoger los sobrenadantes de cultivo celular.
  8. Identificar SF-MSCs mediante citometría de flujo.
    1. Digerir la tercera generación (P3) de SF-MSC, centrifugar a 1.000 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y recoja el pellet celular.
      NOTA: Un pasaje se reconoce como el subcultivo de las células a otra placa de cultivo. Las células primarias aisladas de SF y sembradas en platos se etiquetan como paso cero (P0). En aproximadamente un 75% de confluencia, las células se digieren y se separan de los platos, se siembran en otros platos y se etiquetan como P1.
    2. Añadir 400 μL de tampón de bloqueo (1% BSA en 1x PBS) a la célula granulada (5 x 104) y dejar reposar durante 15 min a temperatura ambiente (RT).
    3. Centrifugar a 1.000 x g durante 5 min a 4 °C, desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 100 μL de 1x PBS.
    4. Añadir 1 μL de CD105, CD73, CD90, CD45, CD34, anticuerpos fluorescentes monoclonales HLA-DR (relación de dilución 1:100) (ver Tabla de materiales) por tubo e incubar a RT durante 30 min.
    5. Lave dos veces con 1x PBS y deseche el sobrenadante. Recoger el pellet celular y resuspender en 100 μL de 1x PBS.
    6. Detecte en un citómetro de flujo hasta 10.000 células utilizando filtros de 525/50 y 585/40 para detectar los fluoróforos.

2.3D cultivo celular de biorreactor

  1. Preparación de microportadores
    1. Hinche los 0,75 g secos de microportadores (ver Tabla de materiales) e hidrátese en 1x solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco (50 ml / g de microportadores) durante al menos 3 h en RT.
    2. Decantar el sobrenadante y lavar los microportadores durante 5 min en DPBS frescos (50 mL/g de microportadores). Deseche el PBS y reemplácelo con 1x DPBS nuevo (50 ml / g de microportadores).
    3. Esterilizar los microportadores en autoclave (121 °C, 15 min, 15 psi). Permita que los microportadores esterilizados se asienten, decanten el sobrenadante.
    4. Enjuague brevemente los microportadores en el medio de cultivo (50 ml / g de microportadores) en RT. Deje que los microportadores se asienten, deseche el sobrenadante.
  2. Biorreactor de perfusión
    1. Esterilizar el biorreactor en autoclave (121 °C, 15 min, 15 psi).
    2. Contar el número de SF-MSCs y asignar 2.5 x 107 SF-MSCs y microportadores al biorreactor perfundido con medio de cultivo MSC de grado GMP (250 mL).
    3. Poner el biorreactor en una incubadora con 5% deCO2 a 37 °C. Gire el biorreactor a una velocidad de 15 rpm. Cambiar el medio de cultivo cada 6 días.
    4. Recolectar los sobrenadantes y microportadores del cultivo celular para su posterior análisis después del cultivo durante 14 días.

3. Identificación de exosomas y detección de seguridad

  1. Ultracentrifugación
    1. Centrifugar el sobrenadante de cultivo celular a 300 x g durante 10 min a 4 °C y recoger el sobrenadante; Deseche los desechos celulares.
    2. Centrifugar los sobrenadantes a 2.000 x g durante 10 min a 4 °C y recoger el sobrenadante; Deseche las vesículas más grandes (cuerpos apoptóticos y algunas microvesículas más grandes).
    3. Centrifugar de nuevo el sobrenadante a 10.000 x g durante 30 min a 4 °C para eliminar vesículas más grandes; recoger los pellets y resuspender en 40 mL de 1x PBS.
    4. Centrifugar los pellets resuspendidos a 120.000 x g durante 70 min a 4 °C, desechar el sobrenadante y resuspender los pellets que contienen exosomas en 500 μL de 1x PBS.
  2. Análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA)
    NOTA: Para cada corrida, se inyectaron 500 μL de la muestra en la cámara a un caudal de 30 μL/min. Realice el análisis a 24,4 °C-24,5 °C.
    1. Diluir las muestras de exosomas recién aisladas con 1x PBS estéril a 1 ml que contenga 107-10 9 / ml de partículas e inyectarlas en el sistema de análisis de seguimiento de nanopartículas (ver Tabla de materiales).
    2. Configure manualmente el sistema de captura y análisis de acuerdo con el protocolo del fabricante. Visualice las partículas mediante la dispersión de la luz láser y capture su movimiento browniano en video digital.
    3. Analice las cintas de video grabadas utilizando software (consulte la Tabla de materiales) basándose en el seguimiento de al menos 200 partículas individuales por ejecución.
  3. Microscopía electrónica de transmisión
    1. Fijar los exosomas en paraformaldehído al 4% (en frío 1x DPBS) durante 5 min.
    2. Monte 5 μL de los exosomas en rejillas de cobre. En este experimento, la concentración de exosomas es de 1 mg/ml cuantificada por un kit de ensayo de proteínas (ver Tabla de materiales).
    3. Incrustar los exosomas en ácido fosfotúngstico al 3% durante 10 minutos en hielo. Retire el exceso de ácido y seque las muestras en RT.
    4. Imagen de las muestras de exosomas por un TEM a una tensión de aceleración de 100 kV.
  4. Western blot
    1. Agregue 300 μL de tampón de lisis (1% Triton X-100, 0.1% SDS, 0.1 M Tris HCl, pH 7) y cóctel de inhibidores de proteasa (ver Tabla de materiales) a los exosomas.
    2. Mezcle los exosomas en el tampón de lisis pipeteando hacia arriba y hacia abajo y déjelo reposar sobre hielo durante 20 minutos.
    3. Centrifugar la mezcla a 9.391 x g durante 10 min a 4 °C y recoger el sobrenadante. Mida la concentración de proteína usando un kit de ensayo de proteínas (consulte la Tabla de materiales).
    4. Añadir 100 μL de tampón de carga de proteínas 4x y calentar a 100 °C durante 10 min.
    5. Cargar 15 μL de proteínas a una concentración de 10 mg/ml y funcionar mediante electroforesis en gel (120 V, 70 min) y electroblotting a 100 V, 60 min a 4 °C.
    6. Detectar los marcadores no exosomas específicos (calnexina) y los biomarcadores exosomales (CD9, CD63 y CD81) mediante Western Blot fluorescente (consulte la Tabla de materiales).
  5. Prueba de seguridad
    1. Para la detección de bacterias, hongos y Mycobacterium tuberculosis , siga los pasos 3.5.2-3.5.5.
    2. Sembrar 100 μL de la solución del exosoma (1 mg/ml) en una placa de cultivo de agar sangre (ver Tabla de materiales) e incubar la placa de cultivo a 37 °C durante 24 h.
    3. Sembrar 100 μL de la solución del exosoma (1 mg/ml) en una placa mediana de agar sabouraud (ver tabla de materiales) e incubar a 35 °C durante 48 h.
    4. Sembrar 100 μL de la solución del exosoma (1 mg/ml) en una placa de medio de cultivo de Lowenstein-Jensen (ver Tabla de materiales) e incubar a 37 °C durante 3 semanas.
    5. Detectar la aparición de bacterias, hongos y colonias de Mycobacterium tuberculosis mediante observación macroscópica.
      NOTA: Los criterios para evaluar la seguridad de los exosomas son la ausencia de microorganismos en la placa de cultivo.
    6. Para la detección de micoplasma, siga los pasos 3.5.7-3.5.9.
    7. Resuspender los exosomas en 50 μL de solución tampón incluida en el kit y calentar a 95 °C durante 3 min.
    8. Amplificar el micoplasma en solución de exosomas utilizando un kit de detección de micoplasma por PCR (consulte la Tabla de materiales).
    9. Detectar los productos de PCR en electroforesis en gel de agarosa al 1,5% (30 min, 120 V).

4. Detección in vitro de la función del exosoma

  1. Etiquetado de exosomas
    1. Marcar 100 μL de exosomas (1 mg/ml) con 1 mM Dil (1000x) (ver Tabla de materiales) e incubar a RT durante 30 min.
    2. Recuperar los exosomas por ultracentrifugación a 100.000 x g durante 70 min. Resuspender el pellet en 500 μL de 1x PBS.
  2. Carga de imitadores Cy3-miR-140 en exosomas
    1. Mezclar 1 μg/μL de proteína exosomal y 5 μmol/mL de Cy3-miR-140 en un volumen final de 400 μL de tampón de electroporación (1,15 mM fosfato de potasio (pH 7,2), 25 mM de cloruro de potasio y 21% (v/v) (ver Tabla de materiales).
    2. Transfiera la mezcla a cubetas de electroporación frías de 0,4 cm y electroporate a capacitancia de 300 V/100 μF utilizando un sistema de transfección génica (ver Tabla de materiales).
    3. Inmediatamente después de la electroporación, mantenga la mezcla en RT durante 30 minutos para asegurarse de que la membrana del exosoma esté completamente restaurada.
    4. Tratar las mezclas con una unidad de RNasa A (ver Tabla de materiales) durante 20 minutos para eliminar los imitadores de miRNA fuera de los exosomas.
    5. Ultracentrifugar la mezcla de exosomas a 120.000 x g durante 90 min, desechar el sobrenadante y resuspender los exosomas en 500 μL de 1x PBS.
  3. Ensayo de captación de exosomas
    1. Sembrar los condrocitos (1 x 107) en placas confocales de 35 mm con 1 mL de DMEM/F12 que contenga 10% de FBS.
    2. Después de 24 h, tratar los condrocitos con exosomas marcados con DiI (100 ng/ml) o exosomas cargados con cy3-miR-140 (100 ng/ml) durante 1 h.
    3. Lavar con 1x PBS tres veces, y luego etiquetar con DAPI (10 ng/mL) durante 10 min en RT.
    4. Registre la señal de fluorescencia en microscopía de fluorescencia de barrido láser confocal (CLSM) utilizando los filtros apropiados (consulte la Tabla de materiales).

5. Análisis estadístico

  1. Realizar análisis estadísticos utilizando el software estadístico apropiado.
    NOTA: Los datos representativos de cada figura se expresaron como la media ± DE. Se utilizó la prueba t de Student para la comparación de dos grupos utilizando software de estadística. Se realizó un ANOVA unidireccional seguido del múltiple de Tukey en el caso de las comparaciones entre múltiples grupos. Valores de p <0,05 (*), <0,01 (**) o <0,001 (***).

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Resultados

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La citometría de flujo fue utilizada para identificar los marcadores de superficie de las SF-MSCs, de acuerdo con los criterios mínimos para definir las MSCs humanas recomendados por la International Society for Cellular Therapy14,15. El análisis de citometría de flujo reveló que las SF-MSCs cultivadas en este estudio cumplieron con los criterios de identificación de las MSCs. Fueron negativos para CD34, CD45 y HLA-DR (por debajo del 3%) y positivos para CD73, CD...

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Discusión

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Las células madre mesenquimales han sido ampliamente utilizadas en medicina regenerativa debido a su autorrenovación, diferenciadas en células tisulares con funciones especializadas y efectos paracrinos16,17. Cabe destacar que los efectos paracrinos ejercidos por los exosomas han atraído mucha atención18. Los exosomas transportan la bioinformación de las MSC y realizan su función biológica y superan las deficiencias de MSC, como el almacen...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81972116, Nº 81972085, Nº 81772394); Programa clave de la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Guangdong (No.2018B0303110003); Proyecto de Cooperación Internacional de Guangdong (No.2021A0505030011); Proyectos de Ciencia y Tecnología de Shenzhen (No. GJHZ20200731095606019, No. JCYJ20170817172023838, No. JCYJ20170306092215436, No. JCYJ20170413161649437); Fundación de Ciencias Postdoctorales de China (No.2020M682907); Fundación de Investigación Básica y Aplicada de Guangdong (No.2021A1515010985); Proyecto Sanming de Medicina en Shenzhen (SZSM201612079); Fondos especiales para la construcción de hospitales de alto nivel en la provincia de Guangdong.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Kit de ensayo BCAThermoFisher23227Ensayo de concentración de proteínas
Placa de agar sangreNanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.P0903Cultivo de bacterias
anticuerpo CD105ElabscienceE-AB-F1243CCitometría de flujo
anticuerpo CD34ElabscienceE-AB-F1143CCitometría de flujo
anticuerpo CD45BD Bioscience555483Citometría de flujo
anticuerpo CD63Abclonal  A5271Western blot
anticuerpo CD73ElabscienceE-AB-F1242CCitometría de flujo
anticuerpo CD81ABclonal  A5270Western blot
CD9 anticuerpoAbclonal  A1703Western blot
anticuerpo CD90ElabscienceE-AB-F1167CCitometría
de flujo CentrífugaEppendorf5810R
Incubadora de CO2TermoCultivo celular
Confocal microscopía de fluorescencia de barrido láserZEISSLSM 800
CytodexGE HealthcareMicrocarrier
DilThermoFisherD1556Etiqueta de exosomas
EZ-PCR Kit de detección de micoplasmaBI20-700-20 Detección demicoplasma
Citometría de flujo Identificaciónde BeckmanMSC
Sistema Gene Pulser IIBio-Rad Laboratories1652660Transfección de genes
GraphPad Prism 8.0.2GraphPad Software, Inc.Versión 8.0.2
Anticuerpo HLA-DRElabscienceE-AB-F1111CCitometría de flujo
Medio de cultivo de Lowenstein-JensenNanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.T0573Cultivo de Mycobacterium tuberculosis
MesenGroStemRDMGro-500Cultivo MSC
Nanosight NS300MalvernNanosight NS300Análisis de seguimiento de nanopartículas
Software NTA 2.3MalvernAnálisis de datos
Odyssey FCGene Company LimitedWestern blot fluorescente
OptiPrep tampón de electroporaciónSigmaD3911Transfección
Cóctel de inhibidores de la proteasaSigmaP8340Inhibidor de la proteinasa
RNasa AQiagen158924Eliminación de ARN
Placa de agar SabouraudNanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.P0919Cultivo de hongos
TEMJEM-1200EX
El Sistema de Cultivo Celular Rotativo (RCCS)SyntheconRCCS-4HDCultivo 3D
UltracentrífugaBeckmanOptima XPN-100Centrífuga de exosomas
génica

Referencias

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