Aquí presentamos un protocolo paso a paso para generar organoides retinianos humanos maduros y utilizarlos en un ensayo de toxicidad de fotorreceptores para identificar candidatos farmacéuticos para la enfermedad degenerativa de la retina relacionada con la edad telangiectasia macular tipo 2 (MacTel).
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Artículo de método
Pruebas de toxicidad en organoides retinianos humanos para el descubrimiento farmacéutico
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Resumen
Resumen
Los organoides proporcionan una plataforma prometedora para estudiar el mecanismo y los tratamientos de la enfermedad, directamente en el contexto del tejido humano con la versatilidad y el rendimiento del cultivo celular. Los organoides retinianos humanos maduros se utilizan para detectar posibles tratamientos farmacéuticos para la enfermedad degenerativa de la retina relacionada con la edad telangiectasia macular tipo 2 (MacTel).
Recientemente hemos demostrado que MacTel puede ser causado por niveles elevados de una especie lipídica atípica, los desoxiesfingolípidos (deoxySLs). Estos lípidos son tóxicos para la retina y pueden conducir a la pérdida de fotorreceptores que se produce en pacientes con MacTel. Para detectar la capacidad de los fármacos para prevenir la toxicidad de los fotorreceptores deoxySL, generamos organoides retinianos humanos a partir de una línea de células madre pluripotentes (iPSC) no inducida por MacTel y los maduramos hasta una edad postmitótica en la que desarrollan todas las células derivadas del linaje neuronal de la retina, incluidos los fotorreceptores funcionalmente maduros. Los organoides retinianos se trataron con un metabolito deoxySL y la apoptosis se midió dentro de la capa fotorreceptora mediante inmunohistoquímica. Utilizando este modelo de toxicidad, se examinaron compuestos farmacológicos que previenen la muerte de los fotorreceptores inducida por desoxiSL. Utilizando un enfoque de candidato dirigido, determinamos que el fenofibrato, un fármaco comúnmente prescrito para el tratamiento del colesterol alto y los triglicéridos, también puede prevenir la toxicidad del desoxiSL en las células de la retina.
La prueba de toxicidad identificó con éxito un medicamento aprobado por la FDA que puede prevenir la muerte de los fotorreceptores. Este es un hallazgo directamente procesable debido al modelo altamente relevante para la enfermedad probado. Esta plataforma se puede modificar fácilmente para probar cualquier número de factores estresantes metabólicos y posibles intervenciones farmacológicas para el futuro descubrimiento de tratamientos en enfermedades de la retina.
Introducción
El modelado de enfermedades humanas en cultivos celulares y modelos animales ha proporcionado herramientas invaluables para el descubrimiento, modificación y validación de terapias farmacológicas, lo que les permite avanzar del fármaco candidato a la terapia aprobada. Aunque una combinación de modelos in vitro y no humanos in vivo ha sido durante mucho tiempo un componente crítico de la línea de desarrollo de fármacos, con frecuencia no logran predecir el rendimiento clínico de los nuevos candidatos a fármacos1. Existe una clara necesidad de desarrollar tecnologías que cierren la brecha entre los monocultivos celulares humanos simplistas y los ....
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Protocolo
1. Descongelación, paso y expansión de iPSCs/ESCs
NOTA: Para todos los pasos de cultivo celular, utilice las mejores prácticas para mantener un cultivo celular estéril.
- Cubra una placa de cultivo celular de 6 pocillos con medio de matriz de membrana basal.
- Para preparar 1x de este medio, siga las especificaciones del producto o diluya el medio de matriz fría de 75 μL con 9 ml de DMEM/F12. Agregue 1.5 ml de 1x medio recién preparado por pocillo en un plato de 6 pocillos. Incubar a 37 °C durante 30 min.
- Aspirar el medio de la matriz de la membrana basal y enjuagar cada pocillo con 3 ml de DMEM/F12. Añadir 2 ml de D....
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Resultados
Los organoides retinianos se generaron a partir de una línea iPSC de control no MacTel. Después de que los organoides alcanzaron las 26 semanas en cultivo, fueron seleccionados y divididos en grupos experimentales. Los organoides fueron tratados con concentraciones variables de deoxySA para determinar si deoxySA es tóxico para los fotorreceptores. Se probaron cuatro concentraciones de deoxySA, de 0 a 1 μM (Figura 2) y se trataron organoides durante 8 días, con cambios en los medios cada dos .......
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Discusión
Variaciones del protocolo de diferenciación
Desde la invención de las copas ópticas autoformadas por el grupo20 de Yoshiki Sasai, muchos laboratorios han desarrollado protocolos para generar organoides retinianos que pueden variar en casi todos los pasos 5,18,19,21. Una lista exhaustiva de protocolos se puede encontrar en Capowski et
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses.
Agradecimientos
Con el apoyo del Instituto de Investigación Médica Lowy. Nos gustaría agradecer a la familia Lowy por su apoyo al proyecto MacTel. Nos gustaría agradecer a Mari Gantner, Mike Dorrell y Lea Scheppke por su aporte intelectual y asistencia en la preparación del manuscrito.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,5 M EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
| 125 ml Frascos Erlenmeyer | VWR | 89095-258 | |
| 1-desoxiesfinganina | Avanti | 860493 | |
| B27 Suplemento, sin vitamina A | Gibco | 12587010 | |
| Beaver 6900 Mini-Blade | Beaver-Visitec | BEAVER6900 | |
| D-(+)-Sacarosa | VWR | 97061-432 | |
| DAPI | Thermo-fisher | D1306 | |
| Dispasa II, polvo | Gibco | 17105041 | |
| DMEM, alto contenido de glucosa, piruvato | Gibco | 11995073 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330 | |
| Burro anti-conejo Ig-G, Alexa Fluor plus 555 | Thermo-fisher | A32794 | |
| suero | de burroSigma | D9663-10ML | |
| FBS, Corning | 45001-108 | ||
| Fenofibrato | Sigma | F6020 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| Heparin | Stemcell Technologies | 7980 | |
| Kit de detección de muerte celular in situ, Fluorescina | Sigma | 11684795910 | |
| Matrigel, factor de crecimiento reducido | Corning | 356230 | |
| MEM Solución de Aminoácidos No Esenciales | Gibco | 11140050 | |
| mTeSR 1 | Stemcell Technologies | 85850 | |
| N2 Suplemento | Gibco | 17502048 | |
| Penicilina-Estreptomicina | Gibco | 15140122 | |
| Pierce 16% Formaldehído | Thermo-fisher | 28906 | |
| Anticuerpo anti-Recoverina para conejos | Millipore | AB5585 | |
| Citrato de sodio | Sigma | W302600 | |
| Steriflip Unidades de filtro de vacío desechables estériles | MilliporeSigma | SE1M179M6 | |
| Taurina | Sigma T0625 | ||
| Tissue Plus- Compuesto O.C.T. | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Tissue-Tek Cryomold | EMS | 62534-10 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Accesorio ultrabajo Placas de 6 pocillos | Corning | 29443-030 | |
| Accesorio ultrabajo 75cm2 U-Flask | Corning | 3814 | |
| Sistema de filtración al vacío | VWR | 10040-436 | |
| Vector medio de montaje Vectashield | Labs | H-1000 | |
| bolígrafo de cera-ImmEdge | vector Labs | H-4000 | |
| Y-27632 Dihidrocloruro (inhibidor de roca) | Sigma | Y0503 |
Referencias
- Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Review Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).
- Khalil, A. S., Jaenisch, R., Mooney, D. J.
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Reimpresiones y permisos
